本研究描述了一种利用细胞核内流式细胞术对分离自脑组织的小胶质细胞进行全基因组组蛋白修饰定量的实验方案。本研究还包含了用于数据采集的小胶质细胞分离方案。
本文内容
摘要
摘要
基因表达的调控部分依赖于染色质结构的改变，包括组蛋白尾部发生翻译后修饰的添加与去除。组蛋白翻译后修饰（HPTMs）可促进或抑制基因表达。例如，组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化可中和其正电荷，减弱尾部与带负电荷DNA之间的相互作用。组蛋白尾部与DNA相互作用的减少使得底层DNA的可及性增加，从而促进转录因子的结合。此外，乙酰化修饰还可作为含溴结构域的转录激活因子的识别位点，共同促进基因表达的增强。组蛋白修饰可在细胞分化过程中以及响应不同细胞环境和刺激时动态调控。尽管新一代测序技术已开始用于鉴定单个组蛋白修饰的基因组定位，但每次仅能检测一种修饰。鉴于目前已知存在数百种不同的HPTMs，我们开发了一种高通量、定量检测全局HPTMs的方法，可用于在开展更深入的基因组测序前对组蛋白修饰进行筛选。本方案描述了一种基于流式细胞术的检测全局HPTMs的方法，适用于培养细胞或从组织中分离的细胞 体内 组织。我们展示了从小鼠脑内分离的微胶质细胞获得的示例数据，以证明该检测方法在响应细菌来源的免疫刺激物（脂多糖）时，能够灵敏地检测组蛋白翻译后修饰的整体变化。本方案可实现对组蛋白翻译后修饰的快速定量评估，并可应用于任何可通过抗体检测的转录或表观遗传调控因子。
引言
表观遗传学是研究在不改变DNA序列的情况下调控基因表达的机制的学科。基因表达的表观遗传调控在细胞内具有动态性，能够使细胞快速且协调地响应各种环境刺激。这种动态调控部分源于核小体水平上染色质结构的变化，核小体由组蛋白蛋白（H2A、H2B、H3、H4）组装成八聚体核心，并被DNA紧密缠绕1。组蛋白蛋白与DNA之间的相互作用可控制转录机器对DNA的可及性，从而最终调控基因表达及其他染色质生物学过程2。组蛋白蛋白具有无固定结构的尾部，其上含有带正电荷的残基，可与带负电荷的DNA骨架形成静电相互作用。这些相互作用导致DNA高度紧密包装，降低DNA的可及性。对组蛋白尾部的共价修饰，称为组蛋白翻译后修饰（HPTMs），能够调控这些相互作用3,4。其中研究最为清楚的HPTMs包括组蛋白尾部的乙酰化和甲基化，这些修饰可改变组蛋白尾部与DNA之间静电相互作用的亲和力，从而导致底层DNA可及性的差异，并招募能够识别特定位置HPTMs的转录因子。HPTMs由三类重要的酶进行调控：识别HPTMs的“阅读器”（readers）、添加修饰的“书写器”（writers）以及去除修饰的“擦除器”（erasers）。因此，阅读器、书写器或擦除器酶的招募或解离最终可改变HPTMs的分布格局，进而调控染色质的结构与功能，使得对这些修饰的调控及其读取成为理解细胞生物学和功能的关键3,4。
中枢神经系统（CNS）中的细胞在表观遗传上具有可塑性，能够通过改变其转录组来适应环境刺激。越来越多的证据表明，表观基因组的改变（如DNA甲基化、非编码RNA以及组蛋白翻译后修饰（HPTM））在记忆形成和突触功能中发挥着关键作用5。通过调控相应的“阅读器”、“书写器”或“擦除器”来干扰HPTM的动态过程，可阻断或增强联想学习和长时程增强效应6,7,8。小胶质细胞作为中枢神经系统中的常驻免疫细胞，可通过其表观基因组的动态变化，快速调节转录组以响应免疫刺激9,10,11。这种对局部脑环境的高度适应性使得在脱离体内环境的情况下独立研究小胶质细胞变得困难，已有研究表明，小胶质细胞一旦离开脑组织并在培养基中培养数小时后，其表观基因组和转录组即发生改变11。此外，由于小胶质细胞仅占脑细胞总数的10%，在全组织水平上检测其变化的方法缺乏足够的灵敏度和特异性12,13。因此，为了在离体（ex vivo）条件下研究HPTM水平等表观遗传变化，需要快速分离小胶质细胞。
常用于检测组蛋白翻译后修饰（HPTM）的方法包括染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和靶点切割与标签化测序（CUT&Tag-seq）4。尽管这些技术对特定的HPTM具有高度特异性，并能揭示特定基因组背景下HPTM的存在情况，但每次实验仅能检测众多可能的HPTM中的一种11,14。因此，在开展需要大量时间和资金投入的此类实验之前，通过首先检测HPTM整体水平的变化，缩小值得进一步研究的潜在HPTM范围，具有重要意义。检测HPTM整体水平的两种主要方法是免疫组织化学和蛋白质印迹分析，但这两种方法均为半定量、通量较低，且需要大量组织切片或分离的细胞15,16。因此，我们致力于开发一种高灵敏度、定量的方法，以实现快速、单细胞水平的HPTM整体水平检测。
本方案通过核内流式细胞术，能够快速检测全局组蛋白翻译后修饰（HPTM）水平。既往在癌细胞中的研究已从临床角度证实了检测全局水平的重要性17,18。目前许多研究也常将全局水平作为筛选手段，用于在分析特定HPTM基因组定位之前进行初步评估19,20。对于小胶质细胞而言，由于细胞得率较低，分离后检测其全局HPTM水平具有挑战性；Pan等人的研究中报告了分离小胶质细胞的全局HPTM水平，其通过合并三只动物的小胶质细胞样本，方得以通过Western blot检测蛋白水平19。而采用本方案，我们能够在显著更低的细胞投入量下检测到全局变化，从而实现每只动物多个修饰标志物的筛查，并避免样本 pooling 的必要性。
本文介绍了一种通过定量核内流式细胞术快速检测分离小胶质细胞中组蛋白翻译后修饰（HPTM）水平的实验方案。尽管为简洁起见，本文重点聚焦于HPTM的定量分析，但该方案同样可用于定量检测识别蛋白（reader）、修饰酶（writer）和去修饰酶（eraser）的整体水平。本方案分为两个部分：第一部分为小胶质细胞的分离方法，第二部分为基于流式细胞术的HPTM水平检测方法。该分离方法所获得的细胞可用于RNA提取和HPTM水平分析，从而实现对同一样本中基因表达水平与HPTM水平的联合评估。此外，HPTM检测方法也可应用于其他细胞类型，具体操作如方案中所述。
方案
所有动物护理方案均经不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会指南批准。
1. 小胶质细胞分离的脑组织消化
图1：实验方案的简易流程图。 首先对小鼠进行经心脏灌注HBSS，随后解剖获取脑组织。脑组织通过化学消化和机械破碎 处理，获得单细胞悬液。通过不连续密度梯度离心收集免疫细胞富集组分，之后对细胞进行P2RY12染色。染色后的细胞可进行以下两种处理：1）通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分选，用于后续RNA分析或蛋白质分析；或2）固定、透化并针对核内蛋白进行染色。通过流式细胞术检测目标通道的中位荧光强度，以定量蛋白质表达水平。蓝色标注的方框属于方案步骤1）小胶质细胞分离的脑组织消化步骤；红色标注的方框属于方案步骤2）用于蛋白表达分析的核内流式染色步骤。图示使用BioRender.com制作。请点击此处查看该图的放大版本。
- 试剂的配制
注意：如果计划进行提取以同时收集用于HPTM分析的RNA和细胞，请参见第1.7.1节，了解添加转录和翻译抑制剂的修改步骤。但如果仅评估蛋白质信号，则无需此步骤，因为细胞在冰上保存时基本处于静止状态。- 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（每样本20 mL）：将牛血清白蛋白（BSA）溶于1×汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，配制2% BSA溶液。再将EDTA溶解于2% BSA溶液中，终浓度为1 mM。使用滤器除菌 0.2 µm 过滤并保存于 4 °C 使用前最多可保存1周。
- 消化缓冲液（每样本 1 mL）：将一瓶木瓜蛋白酶用 HBSS 重悬，配制成终浓度为 20 U/mL 的溶液，其中含 1 mM L-半胱氨酸和 0.5 mM EDTA。激活于 37 °C 至少孵育10分钟，或孵育至组织可进行消化。使用前立即向活化的木瓜蛋白酶溶液中加入DNase I，使其终浓度为200 U/mL。该溶液需在实验当天配制，不可储存。
- 等渗密度梯度溶液（每样本 5.5 mL）：将 10x HBSS 加入冷的密度梯度介质中，使 HBSS 的终浓度为 1x，所得溶液终密度为 1.117 g/mL。使用前涡旋混匀至少 30 秒。冰上放置备用。
- 37% 密度梯度溶液（每样本 4 mL）：将等渗密度梯度液加入 1x HBSS 中，配制成终浓度为 37%、终密度为 1.043 g/mL 的溶液。加入 20 µL 每毫升37%密度梯度中加入酚红，以配制粉红色溶液，便于分层时观察。使用前至少涡旋30秒。置于冰上待用。
- 70% 密度梯度溶液（每样本 2 mL）：将等渗密度梯度液加入 1× HBSS 中，配制成终浓度为 70%、终密度为 1.082 g/mL 的溶液。加入 5 µL 每毫升70%密度的培养基中加入一定量的台盼蓝，制成蓝色溶液，以便在分层过程中观察。使用前至少涡旋振荡30秒。置于冰上直至使用。
- 灌流与脑组织解剖
注意：灌注方案与 Posel 等人的方法类似。 包括小鼠开胸、经心脏灌注及脑组织取出的视频演示21. 此处，我们使用成年 C57BL/6J 雄性和雌性小鼠（10–15 周龄，20–30 g)，但本方案可用于任何小鼠的开胸手术。所有动物实验操作必须在开展实验前获得机构伦理委员会的批准。- 小鼠麻醉：使用4%异氟烷（Isoflurane）与100%氧气混合气体对小鼠进行麻醉，直至达到外科麻醉深度，可通过脚趾夹捏反应或用力夹捏小鼠足部无反射来确认。将小鼠仰卧位固定于倾斜放置于塑料托盘中的手术解剖板上，牢固地固定其四肢，并确保其鼻部稳妥连接于异氟烷鼻罩。转移后，须确认动物仍处于外科麻醉深度，方可继续后续操作。
- 小鼠开胸术：用镊子夹起并提起腹部皮肤，通过皮肤和腹壁做一浅切口，暴露剑突，注意不要损伤降主动脉或任何深层器官。
- 用镊子夹住剑突，在肋骨下方做侧向切口，以暴露膈肌和肝脏。使用精细剪刀沿肋骨全长小心地在膈肌上做浅层切割，并使用组织剪刀剪开肋骨，将胸骨固定在靠近小鼠头部的手术台上，以暴露心脏和肺脏，便于进行心脏灌流。
- 心脏灌注：准备一台蠕动灌注泵，并在管路一端连接一支26.5G针头。将管路的一端插入含有冷的1×HBSS的试剂瓶中，启动泵，用1×HBSS完全充满管路以完成灌注前的预充。
- 用钝头镊子夹住心脏，将连接灌注管路的26.5G针头尖端插入小鼠左心室，并在右心房处做一小切口。开启灌注泵，以每分钟约2–4 mL的流速，用至少15–20 mL冰冷的1×HBSS溶液小心灌注小鼠。
注意：当肝脏开始清除血液并变成与心脏相同颜色时，通常表明灌注完全。 - 脑组织取出：使用组织解剖剪将小鼠断头，沿中线从颈部至鼻部剪开头皮。将皮瓣向两侧剥离以暴露颅骨，用解剖剪清除颅骨尾端多余的组织和骨骼。
- 小心地将剪刀的一侧刀刃锐面朝向颅骨，从枕骨大孔插入颅底下方，沿中线小心向上朝鼻部剪开。使用解剖剪在颅底基部和靠近鼻部的位置分别进行横向剪切。用精细镊子从中线开始将颅骨轻轻向外掀起，使颅骨碎片裂开并暴露脑组织。轻柔地 用解剖刀片将脑组织轻轻抬起，置于解剖滤纸上。
- 脑组织解剖：将脑组织置于铺有经1×HBSS润湿的解剖滤纸的培养皿盖上，培养皿内盛有冰块并保持密闭。用洁净的刀片去除小脑，并沿中线将脑半球纵向切开。
- 去除每个半脑的脑干、纹状体和白质，同时保持海马体及其上方的皮层完整。将含有分离皮层和海马组织的脑半球转移至含有5 mL冰冷1×HBSS的15 mL离心管中，并置于冰上保存。
注意：解剖操作应尽快进行，以确保组织保持低温状态，从断头到将分离的组织最终置于冰上的1x HBSS中，间隔时间不得超过2分钟。若需从多只动物中分离小胶质细胞，在继续进行消化等后续处理前，脑组织可在冰上的1x HBSS中保存约1小时。
- 脑组织消化与匀浆
- 机械和化学解离：将每只小鼠的脑组织和1 mL消化缓冲液分别置于冰上的独立培养皿中。使用洁净的手术刀片，将脑组织彻底切碎成小块（<1 mm
- 剪去塑料移液管的尖端，将每份切碎的脑组织小心转移至冰上的24孔板中的不同孔内。用透明柔性膜覆盖孔板，置于冰上孵育30分钟。
注意：切碎得当的脑组织应类似于切碎的大蒜。 - Dounce匀浆：将每孔中消化后的脑组织溶液转移至预冷的7 mL玻璃Dounce匀浆器中，每个匀浆器中已加入5 mL预冷的FACS缓冲液。用松动研杵（A）轻轻匀浆每个脑组织，约30–40次，直至获得单细胞悬液。使用A研杵匀浆后，再用紧密研杵（B）轻轻匀浆3–4次，以确保形成单细胞悬液。
注意：切勿将研杵下压超过 ¾ 以避免压碎匀浆器底部的组织。最终溶液应呈不透明乳白色。
注意：若在单次实验中消化多个脑组织，应控制将脑组织消化液转移至FACS缓冲液的时间，确保每个样本在消化缓冲液中的时间仅为30分钟。过度消化可能导致表面蛋白被切割，从而降低后续抗体结合能力及信号强度。
- 获取免疫富集片段
- 建立密度梯度：将每份脑组织匀浆分别转移至独立的15 mL聚丙烯管中，每管加入2.125 mL等渗密度梯度液，并用FACS缓冲液定容至8.5 mL，使密度梯度液终浓度为25%。轻轻翻转15 mL管20次，充分混匀。
- 使用窄刻度移液管，小心地将 4 mL 37% 密度梯度液轻轻铺于各试管底部，注意形成清晰的分层。更换移液管，再轻轻将 2 mL 70% 密度梯度液铺于其下图 2A). 转移至预冷至指定温度的离心机中 4 °C 并以 500 x g 20分钟，制动斜坡设为零。
- 收集免疫富集片段：使用洁净的移液管，轻轻吸取15 mL离心管中上层的髓鞘成分并弃去。随后，小心吸取密度梯度上层的片段，转移至洁净的15 mL聚丙烯离心管中。
- 小心收集免疫富集片段（即70%与37%密度梯度层交界处上方1.5 mL和下方1.5 mL的液体），转移至一个新的15 mL聚丙烯管中（图2B加入10 mL FACS缓冲液至免疫富集后的样品中，以稀释密度梯度介质，轻轻倒置离心管20次，充分混匀。
注意：由于细胞容易粘附在管壁上，在收集液体时，应缓慢移动移液管沿管壁旋转，以确保在收集步骤中将所有细胞收集完全。 - 通过在离心机中离心15 mL离心管，使免疫富集样品中的细胞形成沉淀 4 °C 以 500 x g 离心 g 10分钟，下坡坡度制动设为零。离心结束后立即小心移除上清液，保留约 300 µL 15 mL 离心管中的液体，注意不要扰动沉淀（沉淀可能不可见）。
- 将上清液收集到另一个15 mL离心管中，以确保细胞已在离心过程中沉淀（待重悬沉淀细胞计数验证后，弃去此上清液）。将细胞沉淀重悬于 300 µL 使用P1000移液器测量体积，用血细胞计数板计数细胞以估算总细胞产量。
图2：通过不连续密度梯度获得免疫富集片段。（A）将脑匀浆调至25%密度介质，下层依次铺加4 mL呈粉红色的37%密度介质（通过酚红染色）和2 mL呈蓝色的70%密度介质（通过台盼蓝染色）。（B）离心后，各组分发生分离。小胶质细胞位于37%与70%密度介质之间的界面处。髓鞘碎片位于15 mL离心管顶部，将被弃去。顶部片段可另行收集作为备份，以防离心失败导致无细胞回收；若发生此情况，可使用该片段重复梯度分离。免疫富集片段在下游收集。底部含有红细胞的组分保留在管中并弃去。（C）显示完整分层的示例图。由BioRender.com制作。请点击此处查看该图的放大版本。
- 细胞外抗体染色
- 封闭：将细胞转移至冰上的圆底96孔板，于500 x g离心 g 用刹车离心沉淀细胞。在水槽上方快速轻弹培养板以去除上清液，保留孔底完整的细胞沉淀。
- 将细胞重悬于 50 µL 用P200移液器将抗小鼠CD16/32 Fc受体阻断试剂加入FACS缓冲液中（终浓度 10 µg/mL，稀释倍数1:50）以阻断抗体与单核细胞或其他表达Fc受体细胞的非特异性结合。冰上孵育10分钟。
- 抗体染色：配制适量体积的2x混合液，其中包含P2RY12-藻红蛋白别藻蓝蛋白（APC；稀释倍数1:50，浓度 4 µg/mL 最终孔内浓度为1:100，浓度 2 µg/mL）和紫光525活死染色剂（稀释倍数1:50，终孔浓度1:100）。加入 50 µL 将染色主混合液加入细胞悬液（来自1.5.1节封闭后的产物）中，冰上避光孵育30分钟。
注意：本方案中，我们以 P2RY12 对细胞进行染色。首先，P2RY12 是小胶质细胞的一种稳态标志物，在某些疾病状态下可能表达下调。例如，5XFAD 阿尔茨海默病模型小鼠的 P2RY12 水平降低，可能导致其难以识别22可用于分离的其他染色标记包括 Tmem119、Cd11b 和 CD45。23其次，可调节偶联荧光染料 APC 以适配所需的抗体组合。然而，选择 APC 或 PE 等亮度较高的荧光染料有助于确保阳性与阴性细胞群易于区分。24. - 染色后，加入 200 µL 直接向每孔加入FACS缓冲液以洗涤细胞。在500 x g 在 4 °C 轻弹以去除上清液。将细胞重悬于 200 µL 用 P200 移液器加入 FACS 缓冲液，500 x g 离心 g 在 4 °C，轻弹培养板以去除孔中的缓冲液。
- 准备流式对照：在完成步骤1.5.1的封闭后， staining前，从每个样本中分出所需用于流式对照的细胞体积。
注意：每次实验均需设置流式对照以确定设门范围。流式对照可来自额外的动物，或来自每个实验孔中的部分细胞。分装细胞时，需确保每个对照组分配足够的细胞，因为建立高置信度的设门需每个对照组包含10,000–30,000个细胞。- 有三个相关的流式对照：未染色对照、死活对照和P2RY12同型对照。对于未染色对照，不添加任何抗体。在P2RY12同型对照中，使用活力染料（1:100）和APC偶联的同型对照抗体（1:100）处理细胞。
- 为制备活死细胞对照，将细胞分装至单独的孔中，并将一半细胞体积转移至另一容器 500 µL 管。放置 500 µL -管插入到80 °C 冷冻5分钟，随后置于 37 °C 孵育5分钟以杀死细胞。将已杀死的细胞分装液返回至活/死对照孔中，并使用 violet 525 胺结合活性染料（稀释倍数1:100）进行染色，以标记死细胞。
注意：本实验方案针对使用 flick 法去除上清液的板染色方法而编写。然而，此方法要求在离心结束后立即去除上清液，且 flick 操作需施加足够力度，以快速移除上清液同时不扰动沉淀。作为替代方案，可使用 1.5 mL 无 RNA 酶/DNA 酶的离心管进行染色，具体修改如下：将细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 800 x g 5 分钟 4 °C吸弃上清液。提示：为加快速度，可使用带P200吸头的5 mL移液管快速且准确地吸走上清液。吸液时注意观察沉淀物，若不可见沉淀，请保留 50 µL 上清液的体积，并相应调整计算。在洗去抗体时，可加入额外的FACS以增加抗体的稀释倍数（1000 µL 而不是 200 µL) 以弥补上清液去除不完全的情况。根据流式细胞仪的型号，可使用 1.5 mL 离心管进行分选，以减少所需耗材的用量。
- 小胶质细胞的FACS分选
- 准备：重悬各孔中的细胞 200 µL 用 P200 移液器加入 FACS 缓冲液，转移至标记好的流式分选管中，并补加 FACS 缓冲液至总体积 500 µL 浓度约为 5 x 105 每毫升的事件数。避光并置于冰上保存，直至分析。通过加入准备分选后试管 100 µL 加入适量FACS缓冲液作为细胞垫，置于1.5 mL无RNA酶的离心管中。
- 流式细胞仪设置：在配备以下设置的流式细胞分选仪上分选细胞 100 µm 喷嘴。使用18-20 psi进行细胞分选。
- 设门：在流式细胞仪上，使用无染色对照样本，通过侧向散射（SSC）面积与前向散射（FSC）高度的散点图对细胞大小设门，以帮助区分碎片；将SSC-A设为对数坐标以清晰显示细胞群体，并紧密设门以选择细胞（门S1）； 图3）。为去除双联体，绘制FSC-H与FSC-W的散点图，并在细胞群周围设门以排除碎片和双联体（设门S2）。利用P2RY12同型对照，在APC通道中检测细胞，并根据自发荧光设门以确定P2RY12+细胞。利用未染色对照和死活染色对照，对在紫光525 nm处无荧光信号的细胞设门，定义为活细胞。
- 分选：绘制紫光525 nm对APC的散点图，通过FMO对照（MG）确定P2RY12阳性且活细胞群体，将该群细胞分选至已标记的分选后离心管中（图3）。最终分选比例约为总事件数的50%，其中大部分事件总数的损失为在S1门中去除的碎片（约70%的事件为细胞； 表 1).
- RNA 的分离与分析
- 转录与翻译抑制剂：若计划进行RNA提取，为消除与分离过程相关的转录组特征风险，应在缓冲液步骤中加入翻译和转录抑制剂。按Marsh等所述方法配制抑制剂混合液。 包括放线菌素D、茴香霉素和雷公藤内酯25.
- 抑制剂制备：按如下方法重悬抑制剂储备液并保存：将放线菌素D用二甲基亚砜（DMSO）溶解至5 mg/mL，于-20 °C保存。20 °C. 用 DMSO 将雷公藤甲素重悬至 10 mM，并于 -20 °C 保存20 °C，避光保存。用DMSO将Anisomycin重悬至10 mg/mL，并储存在 4 °C，避光保存。所有抑制剂母液在重悬后保存时间不得超过1个月。
- 缓冲液修饰：在方案中的四种不同缓冲液中分别加入抑制剂，具体如下：进行心脏灌注时，准备含有放线菌素D的HBSS5 µg/mL，1:1000 原液）和雷公藤内酯醇（10 µM，1:1000 原液）。灌注后，将脑组织置于含放线菌素 D 的 HBSS 中运送至实验室5 µg/mL，1:1000 原液），雷公藤内酯醇（10 µM，1:1000 来自原液）和茴香霉素（27.1 µg/mL，1:368.5 来自母液）。用放线菌素 D 配制 FACS 缓冲液（5 µg/mL，1:1000 原液），雷公藤内酯10 µM，1:1000 原液稀释）和茴香霉素（27.1 µg/mL，1:368.5 稀释自原液）。配制含放线菌素 D 的消化缓冲液（5 µg/mL，1:1000 原液），雷公藤甲素（triptolide）10 µM，1:1000 原液）和茴香霉素（27.1 µg/mL，1:368.5 稀释自母液）。配制分选后洗涤缓冲液，含放线菌素 D 的 HBSS。5 µg/mL，1:1000 原液），雷公藤甲素（triptolide）10 µM，1:1000 原液）和茴香霉素（27.1 µg/mL，1:368.5（来自原液）。
注意：添加抑制剂时，需在使用前立即加入，并在使用过程中避免光照已配制的缓冲液。避免反复冻融储备液。
- 分选后洗涤：由于细胞已分选至含有FACS缓冲液的1.5 mL无RNase的离心管中，而FACS缓冲液会干扰RNA提取，因此必须对细胞进行洗涤。以1000 x g离心细胞 g 在 4 °C 5 分钟，去除上清液，保留约 50 µL 液体。
- 添加 200 µL 含放线菌素D的1× HBSS5 µg/mL，1:1000 原液），雷公藤内酯醇（triptolide）10 µM，1:1000 来自原液）和茴香霉素（27.1 µg/mL，从储备液中取1:368.5比例）并充分混匀。重复离心，移除上清液，保留 50 µL 液体（洗涤液1）。加入 200 µL 加入洗涤缓冲液，充分混匀，再次离心并移除上清液，留下 25 µL 液体（洗涤液2）
- RNA提取：从小胶质细胞中分离RNA时，使用低起始量RNA提取试剂盒，以获得高产量且稳定的RNA，并确保RIN值高于9（见下文及 材料清单 （有关产品推荐，请参见相关说明）。向细胞沉淀中加入 350 µL 推荐试剂盒裂解缓冲液 + β-巯基乙醇（1:100），充分混匀。
注意：如有必要，可在该步骤暂停实验流程。样品可在裂解缓冲液中于 -80 °C 直至进行RNA提取。如果在储存后提取RNA，需将裂解液置于冰上解冻，并按照试剂盒说明书中的具体步骤进行分离操作。 - 将裂解液转移至基于柱的细胞破碎器中（参见 材料清单 用于产品推荐）并在最大速度下离心 4 °C 2分钟。以最小体积洗脱 14 µL 加入无RNase水并根据需要测定浓度。此后，RNA可用于任何下游应用。
- 转录与翻译抑制剂：若计划进行RNA提取，为消除与分离过程相关的转录组特征风险，应在缓冲液步骤中加入翻译和转录抑制剂。按Marsh等所述方法配制抑制剂混合液。 包括放线菌素D、茴香霉素和雷公藤内酯25.
图3：流式分选的设门策略。 首先根据SSC-A与FSC-H对细胞大小进行设门（S1）；随后在FSC-H与FSC-W上设门以筛选单细胞（S2）。单细胞若在Comp-FL8-A::405-526-52（紫光525活死染料）上呈阴性，则被分选为活细胞；若在Comp-FL32-A::640-671_30（P2RY12-APC）上呈阳性（以P2RY12同型型对照为参照），则被定义为P2RY12+细胞。若细胞同时满足活细胞且P2RY12+，则标记为MG并进行分选。请点击此处查看该图的放大版本。
| 门控群体 | 父群体频率 | 总体频率 | 计数 |
| S1 | 68.10% | 68.10% | 162186 |
| S2>S1 | 93.59% | 63.70% | 151707 |
| P2Y12+ (670+) > S2 > S1 | 83.05% | 52.90% | 125986 |
| 活细胞 (525-) > S2 > S1 | 92.78% | 59.10% | 140752 |
| 小胶质细胞 (P2RY12+ 活细胞) >S2>S1 | 78.96% | 50.30% | 119794 |
表1：示例样本谱系表，包含设门百分比和预期事件数。
2. 蛋白质表达分析的核内流式染色
注意：此时可开始处理其他细胞类型，本方案已使用培养细胞进行测试，包括 HEK293 细胞、BV2 小胶质样细胞以及人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞。
- 细胞固定与染色
注意：以下方案中，请使用专为核染色优化的细胞内染色试剂盒。产品推荐详见材料表。- 将第1.5.2节中已完成胞外染色的细胞分装至96孔板中（每孔细胞数为5 × 104–1 × 106）。在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟，弃去FACS缓冲液，轻弹去除残留液体。
注意：为获得具有高置信度的中位值数据，每孔至少应使用10,000个细胞。虽然未规定最大细胞数量，但建议在整个实验中保持细胞数量一致，以避免不同变异系数（CV）对结果造成显著影响。 - 固定与通透：每孔加入200 µL 1×固定浓缩液，使用P200移液器轻轻吹打混匀以重悬细胞。避光孵育45–60分钟。在室温（RT）下以500 × g离心5分钟，轻弹弃去上清液。
注意：如有需要，可在本步骤暂停实验流程。弃去上清液后，将细胞重悬于免疫细胞长期保存缓冲液中（产品推荐详见材料表）。样品可在4 °C避光条件下保存12–18小时，并用透明封膜覆盖以防止缓冲液蒸发。 - 每孔加入200 µL 1×通透缓冲液，使用P200移液器混匀。在室温下以500 × g离心5分钟，轻弹弃去上清液。重复通透缓冲液洗涤共3次。
- 流式对照制备：从各样品中分出适量细胞用于制备所需的流式对照（每对照孔10,000–30,000个细胞即可）。
- 制备未染色对照：将分选后未染色的细胞或直接分装未染色细胞至独立孔中，不添加任何抗体。
- 制备荧光减一（FMO）对照：为面板中每种抗体分别分装细胞，但排除该通道对应的抗体。
- 对于相关通道，在FMO对照中加入同型对照抗体以辅助设门。例如，在包含P2RY12-APC和H3K27Ac-AlexaFluor568的抗体组合中，应设置两个FMO对照：（1）APC-FMO，仅包含H3K27Ac-AlexaFluor568和P2RY12同型对照抗体；（2）568-FMO，仅包含P2RY12-APC、同型对照一抗及568标记的二抗。
注意：本方案用于检测单一组蛋白翻译后修饰（HPTM），但也可建立包含多种偶联不同荧光染料的HPTM抗体组合。
- 一抗染色：每孔加入含适当浓度一抗的50 µL 1×通透缓冲液。在室温避光孵育30分钟。使用200 µL 1×通透缓冲液洗涤2次。
注意：各HPTM所用抗体浓度详见材料表。抗体浓度通过在培养细胞上进行滴定确定，细胞经可显著上调目标修饰的刺激物处理（如乙酰化修饰使用HDAC抑制剂），确保未处理与处理组细胞的信号均处于检测范围内（高于同型对照，低于流式细胞仪的最大检测上限）。HPTM抗体的最佳浓度应使荧光通道的平均中位荧光强度（MFI）介于5 × 104至1 × 105之间。 - 二抗染色：每孔加入含2%正常驴血清（NDS）的200 µL 1×通透缓冲液，室温封闭10分钟。在室温下以500 × g离心5分钟，轻弹弃去上清液。
- 每孔加入含2% NDS及适当浓度二抗的50 µL 1×通透缓冲液，室温避光孵育30分钟。每孔加入200 µL 1×通透缓冲液稀释，于室温下以500 × g离心5分钟，轻弹弃去上清液。使用200 µL 1×通透缓冲液洗涤细胞2次。
注意：如有需要，可在本步骤暂停实验流程。使用P200移液器将细胞重悬于200 µL免疫细胞长期保存缓冲液中（推荐产品详见材料表），于4 °C避光保存12–24小时。 - 流式细胞术前准备：在室温下以500 × g离心5分钟，轻弹弃去上清液。使用P200移液器将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中用于流式检测。用透明封膜密封后运送至流式细胞仪。
- 将第1.5.2节中已完成胞外染色的细胞分装至96孔板中（每孔细胞数为5 × 104–1 × 106）。在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟，弃去FACS缓冲液，轻弹去除残留液体。
- 流式细胞术
- 为分析所建议的抗体组合，确保流式细胞仪至少配备四种激光器：紫光（405 nm）、蓝光（488 nm）、黄光（561 nm）和红光（633 nm）。仪器需配备可检测FITC（蓝光-525 nm）、KRO（紫光-525 nm）、PE（黄光-585 nm）和APC（红光-660 nm）的滤光片。根据所选仪器可添加其他抗体。
- 校准与标准化：每次实验开始前，运行彩虹荧光微球，调节光电倍增管（PMT）电压，使微球峰位与先前实验的目标值相当。该标准化方法可校正仪器随时间产生的漂移。
- 补偿调节：在设定实验所需的PMT电压与增益后，使用抗体捕获型补偿微球建立抗体组合的补偿矩阵。该计算可确保各荧光染料不会对其他通道信号产生干扰，尤其在多重抗体联合检测时更为重要。
- 大小设门：在散点图中，以对数形式绘制SSC-A，线性形式绘制FSC-H。通过S1门排除碎片并筛选特定细胞大小。在FSC-W与FSC-H的散点图中选择单细胞群体，并设为S2门。（图4）。
- 建立荧光通道设门：针对每个荧光通道使用相应的FMO对照，通过单参数直方图确定各通道阳性信号的设门标准（图4）。
- 样品检测：按照既定设门策略仔细记录样品数据。通过P2RY12+信号鉴定小胶质细胞，并仅在小胶质细胞群体中分析各目标蛋白在相应通道的表达水平。
- 流式细胞术数据分析
- 建立分析设门：在分析软件用户界面中，使用上述细胞仪操作步骤中相同的设门策略进行数据分析。
- 获取MFI值：使用流式细胞术分析软件（推荐软件详见材料表）获取中位荧光强度（MFI）值：在分析软件中重现细胞仪的设门策略。使用“添加统计”功能，在已补偿的通道高度上选择目标群体（如568+）的中位值。通过表格编辑器将各通道的MFI值导出至电子表格，用于后续统计分析（表2）。
注意：补充文件S1包含脂多糖（LPS）与磷酸盐缓冲液（PBS）注射小鼠的示例数据，以及包含设门策略和MFI值的示例分析文件。 - 由MFI值计算蛋白表达倍数变化：获得MFI值后，计算其相对于对照组或未处理组的倍数变化（公式1）。MFI的倍数变化可反映蛋白水平的倍数变化。基于倍数变化值评估表达变化，并使用t检验或ANOVA计算统计学显著性。
公式 1
图4：蛋白MFI评估的设门策略。 首先根据SSC-A与FSC-H的散点图对细胞大小进行设门（S1）。随后在FSC-H与FSC-W的散点图上对单细胞进行设门（S2）。接着通过P2RY12-APC信号（APC+）鉴定单细胞为小胶质细胞，其设门依据为包含同型对照抗体的APC-FMO对照样本中的荧光信号。然后根据Comp-FL5-A::Y610-mCherry上的H3K27Ac-AlexaFluor568信号对细胞进一步设门。610+细胞的荧光强度被用作蛋白表达水平的替代指标。请点击此处查看该图的放大版本。
结果
成年小鼠经心脏灌注后处死，用于小胶质细胞的分离。小胶质细胞在冰上分离，并用P2RY12-APC和violet 525活死细胞抗体进行染色。P2RY12阳性且violet 525活死染色阴性的细胞被分选为活的小胶质细胞。从一只解剖后的小鼠脑组织中平均获得的小胶质细胞数量为1.28 × 105 ± 0.05（均值 ± 均值标准误[SEM]，N=100）。雌性小鼠（1.25 × 105 ± 0.09 [均值 ± SEM，N=46]）与雄性小鼠（1.32 × 105 ± 0.07 [均值 ± SEM，N=54]）之间的小胶质细胞得率无显著差异（t(98)=0.6365，p=0.526）。在从特定脑区分离时，小鼠皮层来源的小胶质细胞平均得率为8.3 × 104 ± 0.08（均值 ± SEM，N=15），海马区来源的为4.1 × 104 ± 0.02（均值 ± SEM，N=16）。如预期所示，不同脑区之间的小胶质细胞得率存在显著差异（F(2, 128)=25.25，P<0.0001）。小胶质细胞分离后，使用低输入量RNA提取试剂盒从小胶质细胞中提取RNA。RNA完整性评分（RIN） consistently 高于9.0（9.62 ± 0.05），每细胞平均RNA得率为0.25 ± 0.01 pg（均值 ± SEM，N=32；补充文件S2）。
在处死前24小时，成年小鼠通过腹腔注射1 mg/kg的脂多糖（LPS）。小鼠经心脏灌注HBSS，并按照所述方案从全脑中分离小胶质细胞（图5A）。每种染色实验中，将20,000–30,000个细胞分配至每组抗体检测面板。通过流式细胞术检测分离的小胶质细胞中组蛋白3赖氨酸27乙酰化（H3K27Ac）的整体水平。在雄性和雌性小鼠中，当MFI在性别内部归一化时，LPS处理均导致H3K27Ac水平升高（t(6)=9.676，p<0.0001；图5B）。观察染色细胞的直方图可见，细胞群体仍呈正态分布且变异程度相似；但细胞的荧光强度整体升高，导致MFI增加（图5C）。在相同处理条件下检测H3K9Ac时，也观察到H3K9Ac水平的类似升高（t(6)=7.299，p=0.0003；图5D，E），但LPS相对于PBS处理组的H3K9Ac信号倍数变化小于H3K27Ac信号的倍数变化。
图5：分离的小胶质细胞中组蛋白乙酰化的全局变化。（A）小鼠在处死前24小时经腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS）或1 mg/kg脂多糖（LPS）。从小胶质细胞富集的免疫组分中收集细胞，并固定用于流式细胞术及全局组蛋白翻译后修饰水平检测。以中位荧光强度作为蛋白表达水平的替代指标。图片使用BioRender.com制作。（B）H3K27Ac的全局水平在LPS处理后升高。以同一实验和性别内PBS组为基准进行归一化，计算倍数变化。非配对双尾t检验，t(6)=9.676，p<0.0001。柱状图表示均值±标准误（SEM）。N=8只动物；每种条件2只，共进行2次独立实验。（C）示例直方图显示H3K27Ac荧光强度的变化。模态图展示PBS注射小鼠与LPS注射小鼠的直方图对比。（D）示例直方图显示H3K9Ac荧光强度的变化。模态图展示PBS注射小鼠与LPS注射小鼠的直方图对比。（E）H3K9Ac的全局水平在LPS处理后升高。以同一实验和性别内PBS组为基准进行归一化，计算倍数变化。非配对双尾t检验，t(6)=7.299，p=0.0003。柱状图表示均值±标准误（SEM）。N=8只动物；每种条件2只，共进行2次独立实验。 请点击此处查看该图的放大版本。
为了确认所描述的方法是否与其他先前用于全基因组组蛋白修饰定量的方法具有可比性，我们计划使用免疫印迹作为比较工具。然而，分离得到的微胶质细胞产量过低，无法进行合理的评估。因此，我们采用培养的 BV2 细胞来比较细胞内流式细胞术与蛋白质印迹法（WB）。BV2 细胞在完全培养基（DMEMF12，10% 胎牛血清，1× 青霉素/链霉素和 1× L-谷氨酰胺）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。细胞使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行传代，并以每孔 250,000 个细胞的密度接种，在低血清培养基（DMEM F12，2% 胎牛血清，1× 青霉素/链霉素和 1× L-谷氨酰胺）中处理，并在 37 °C、5% CO2 条件下恢复 12 小时。随后，细胞用 25 ng/mL LPS 处理 24 小时，之后按上述方法进行固定或使用 WB 裂解缓冲液进行裂解。H3K27Ac 信号通过两种方法检测，WB 中以 GAPDH 作为上样对照。对每组数据计算相对于 PBS 对照组的归一化荧光强度（图 6A）。在通过 WB 检测归一化 H3K27Ac 信号变化时，LPS 处理组相对于 H2O 对照组信号增加了 1.527 倍，经非配对 t 检验确定具有显著性差异（t=3.024，df=5；p=0.0293）。在使用流式细胞术检测时，LPS 处理组信号增加了 1.482 倍，差异亦具有显著性（t=7.843，df=10；p<0.0001）。采用双因素方差分析（2-way ANOVA）对两种方法进行比较，结果显示处理因素具有显著效应（F(1,15)=45.21，p<0.0001），但方法本身（F(1,15)=0.05545，p=0.8697）以及处理与方法的交互作用（F(1,15)=0.02785，p=0.8697）均无显著差异。此外，我们进一步验证了组蛋白 H3 水平在 WB 和流式细胞术检测中均未发生变化，双因素方差分析显示 LPS 处理（F(1,7)=0.02170，p=0.8870）、检测方法（F(1,7)=0.01191，p=0.9162）以及交互作用（F(1,7)=0.01191，p=0.9162）均无显著效应（图 6B）。本数据的代表性印迹图和直方图偏移示例也一并展示（图 6C、D）。
图6：流式细胞术与蛋白质印迹法在定量全基因组组蛋白修饰变化方面的比较。（A）BV2细胞在分析前经25 ng/mL脂多糖（LPS）或H2O处理24小时。H3K27Ac的荧光强度以磷酸盐缓冲液（PBS）对照组为基准，表示为倍数变化，流式细胞术与蛋白质印迹法结果均如此。双因素方差分析显示LPS处理具有显著效应（F(1,15)=45.21，p<0.0001），但检测方法（F(1,15)=0.05545，p=0.8697）及交互作用（F(1,15)=0.02785，p=0.8697）无显著差异。对残差采用Tukey多重假设检验校正。*表示p=0.0332，**表示p=0.0021。（B）组蛋白H3 的荧光强度以PBS组为基准，表示为倍数变化，流式细胞术与蛋白质印迹法结果均如此。双因素方差分析显示LPS处理（F(1,7)=0.02170，p=0.8870）、检测方法（F(1,7)=0.01191，p=0.9162）以及交互作用（F(1,7)=0.01191，p=0.9162）均无显著效应。（C）示例蛋白印迹图及（D）流式细胞术偏移图。直方图根据处于峰值荧光强度的细胞数量归一化为百分比。柱状图表示均值±标准误（SEM）。n=2个独立实验，每个实验每组2个重复。请点击此处查看此图的放大版本。
综上所述，这些结果表明，该技术可用于定量评估分离的小胶质细胞中的全局组蛋白翻译后修饰水平。此外，该方法已被证明与先前的技术具有可比性，但所需细胞投入量显著更低。另外，尽管未在此展示，但通过适当的补偿，本技术可在同一检测面板上使用多种抗体，以同时评估不同的组蛋白翻译后修饰。
补充文件 S1：示例分析文件。 该文件包含一个 wsp 分析文件和 7 个 fcs 文件，其中包括未染色样本、P2RY12FMO、568FMO、两个经 PBS 处理的动物样本以及两个经 LPS 处理并用 H3K27Ac 染色的动物样本。本文件的目的是展示实验分析与设门策略，以呈现一次成功实验可能的结果。 请点击此处下载该文件。
补充文件 S2：分离数据。该文件包含小胶质细胞分选后的相关数据，包括本方案所述的小胶质细胞数量及RNA产量。请点击此处下载该文件。
| 门控群体 | 占父群比例 | 占总体比例 | 计数 |
| S1 | 89.00% | 89.00% | 25672 |
| S2>S1 | 88.73% | 78.97% | 22779 |
| APC+ > S2 > S1 | 76.61% | 60.50% | 17452 |
| 610+ > APC+ > S2 > S1 | 99.56% | 60.24% | 17376 |
表2： 示例样本谱系图展示了准确检测蛋白质所需的百分比和事件数量。
讨论
本方案通过流式细胞术实现对全基因组HPTM水平的定量评估。尽管本方案提出了一种新方法，但既往研究已采用类似方法对蛋白质进行过定量分析。26以往用于评估组蛋白翻译后修饰全局水平的方法包括免疫组织化学和蛋白质印迹法16,17,19,20基于流式细胞术的方法如下所示 一个 易于定量的方法，而蛋白质印迹和免疫组织化学为半定量方法，通量较低。蛋白质印迹依赖于细胞裂解，因此需要进行蛋白归一化，并使用一种在实验条件下表达水平被认为保持不变的上样对照蛋白。27免疫组织化学是半定量的，通量很低，因为在单细胞水平以下难以对蛋白含量进行准确定量评估。16同样，对于分离的小胶质细胞而言，由于蛋白产量有限，而 Western blot 需要大量的蛋白上样量，因此使用流式细胞术更具优势。19细胞数量需求较低，可从同一只动物中进行多个染色组合的实验。
然而，与其他任何方法一样，该技术也存在局限性，包括抗体的成本和可获得性，因为并非所有抗体在流式细胞术条件下都能良好工作。此外，与免疫印迹相比，该方法所需的抗体浓度要高得多。尽管多重检测技术允许在同一组细胞上同时使用多种抗体，但在分析后无法将抗体从细胞上去除，因此每种抗体只能使用一次细胞样本。这与免疫印迹不同，后者可以对同一张印迹膜进行多次重复使用。然而，根据可用的抗体种类以及流式细胞仪检测通道的数量，有可能同时检测多达十余种标志物。
目前该方法仅能捕获蛋白质表达的整体水平，而无法反映其在基因组上的特定位点信息，且整体水平的变化可能无法体现单个基因组位点的变化。同样，整体水平无变化并不意味着没有任何基因组位点发生改变，而可能仅仅是各变化相互抵消，导致处理组之间整体无显著差异。因此，该技术主要用于筛选出与基因组分析相关的组蛋白翻译后修饰（HPTMs）。此外，该方法不允许在不同蛋白质修饰标记之间进行直接比较，除非以相对于对照组的倍数变化形式进行评估。因此，与基于标准曲线的蛋白质定量方法（如ELISA）相比，该方法存在一定的局限性。
本方案提供了一种分离活体脑内小胶质细胞的策略。该方案依赖于P2RY12蛋白的表达来分离小胶质细胞。然而，P2RY12是小胶质细胞的一种稳态标志物，在疾病模型（如5XFAD22）中其表达可能下调。因此，在使用疾病模型动物时，务必选择其他标志物蛋白（如TMEM119、CD11b或CD45）以辅助小胶质细胞的分离23。同样，本方案以从海马和/或皮层中分离小胶质细胞为例进行介绍。该方案也可用于从其他脑区（包括白质区域）分离小胶质细胞，但根据目标区域的大小，可能需要使用多只动物才能获得足够数量的小胶质细胞。
本文所述方案可有效分离活体脑内小胶质细胞，但在分离阶段存在若干步骤，若操作不当，可能导致细胞得率降低，具体如下所述。
本方案中的灌流操作可使免疫富集片段中获得更高比例的小胶质细胞，从而减少分选仪上的操作时间。然而，灌流并非必需步骤，若有必要，也可采用其他安乐死方法。
在小胶质细胞分离过程中，应完全去除髓鞘。流式细胞仪依赖细胞以快速通过狭窄的管道。由于髓鞘具有黏性且易于聚集，会导致流式细胞仪出现故障，常常引起堵塞，这不仅可能损坏仪器，还会破坏样本，显著降低得率。在收集免疫细胞富集片段时，务必小心彻底去除所有髓鞘，以避免后续实验出现问题。
平板染色与离心管染色的比较：本方案中，我们描述了在1.5 mL离心管或96孔板中进行细胞染色的两种选择。每种方法的适用情况取决于具体实验；但通常而言，离心管染色对得率的影响风险低于平板染色，因为在平板操作中，倾倒步骤若操作不当可能导致细胞丢失。而平板染色速度更快，因为逐个离心管吸取上清液较为耗时。在固定前（如用于分选等操作）建议采用离心管染色，以最大化细胞得率并降低丢失风险。然而，对于HPTM分析，在细胞经固定用于核内染色后，细胞沉淀更为稳定，此时进行倾倒操作导致细胞丢失的风险显著降低。
建立不连续密度梯度：在进行分层操作时，正确设置各层对于获得免疫细胞富集组分至关重要。如果各层受到扰动或混合而变得浑浊，细胞将无法迁移至目标位置，从而难以获取免疫富集的细胞组分。若出现此情况，应将样本连同密度介质一同离心以去除髓鞘，然后收集所有剩余组分，每1 mL密度介质加入3 mL FACS缓冲液进行稀释，并充分混匀（此过程可能需要使用多个离心管）。在制动设为0的条件下，以500 × g 离心10分钟。弃去上清液，仅保留约300 µL溶液。收集全部样本并进行染色。此方法可能导致分选效率降低，并延长流式细胞仪检测时间，但最终得率仍可保持在可接受水平。
使用分离方法时，能够从同一只小鼠脑中获取细胞用于RNA分析以及HPTM评估是十分有利的。在此情况下，分选活的髓系小胶质细胞后，可将细胞分为两部分：一部分用于RNA评估（为获得足够的RNA产量，最少需要75,000个细胞），另一部分用于进一步的流式细胞术分析（每孔至少10,000个细胞，以准确测定MFI）。此时需要进行流式细胞仪分选。然而，若仅计划对细胞进行HPTM分析，则无需分选，可直接对免疫富集组分使用P2RY12抗体和HPTM抗体进行染色。随后可在流式细胞仪上设门圈选P2RY12+的小胶质细胞，如同进行流式分选时的操作，以特异性分析小胶质细胞内的HPTM信号。省去分选步骤可使实验流程更加快速且经济高效。此外，若对培养细胞中的HPTM进行评估，则直接从染色步骤开始即可，无需使用细胞标志物抗体，如图6所示。HPTM评估方案适用于多种细胞类型，包括培养细胞、原代细胞以及诱导多能干细胞（iPSC）来源的细胞。
最后，尽管我们仅介绍了小胶质细胞分离后的两种潜在用途，但实际上还有许多其他应用，包括表观遗传学技术，如ChIP、CUT&Tag和CUT&RUN。在基因组表观遗传学技术中，若需分析特定基因位点的变化，应针对实验目的选择特异性的染色质修饰“书写”和“擦除”酶抑制剂11，以确保所检测到的小胶质细胞表观遗传修饰谱并非来源于分离过程（如酶消化步骤）中的技术性假象。而在评估表观遗传标记的全局水平变化时（例如通过定量流式细胞术），通常不会因实验操作引起足够显著的变化以致在全局水平上被检测到。
总体而言，所讨论的方法提供了一种新颖的单细胞技术，可通过流式细胞术定量检测组蛋白修饰及其他表观遗传改变的全局水平。我们证明了该方法具有足够的灵敏度，可检测小胶质细胞在脂多糖（LPS）刺激下增强子标志物H3K27ac的全局变化 体内这与先前在LPS刺激后进行的H3K27ac ChIP-测序结果一致，显示对LPS有响应的增强子发生了显著的重塑28该方法的应用将有助于研究发育和疾病过程中不同脑细胞类型的全基因组表观遗传学变化。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢白艳阳协助完成图5中的免疫印迹实验。本研究由加拿大卫生研究院 [CRC-RS 950-232402 至 AC]、加拿大自然科学与工程研究理事会 [RGPIN-2019-04450、DGECR-2019-00069 至 AC]、苏格兰礼慈善基金会 [21103 至 AC] 和加拿大脑基金会 [AWD-023132 至 AC] 提供资助；不列颠哥伦比亚大学原住民研究生奖学金（6481 至 MT）；不列颠哥伦比亚省研究生奖学金（6768 至 MT）；加拿大开放神经科学平台学生学者奖（10901 至 JK）；不列颠哥伦比亚大学四年博士奖学金（6569 至 JK）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| 15 mL Falcon 离心管，聚丙烯，无菌 | Falcon | 352196 | |
| 24孔透明未处理板 | Costar | 3738 | |
| 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 96孔透明聚苯乙烯微孔板，透明圆底，未处理表面 | Corning | 3788 | |
| 乙酰化组蛋白 H3 K9 (C5B11) | Cell Signalling Technology | 9649S | 稀释比例：1:100 |
| 乙酰化组蛋白 H4 K8 (2594) | Cell Signalling Technology | 2594S | 稀释比例：1:100 |
| 乙酰化组蛋白 H3 K27 (D5E4) | Cell Signalling Technology | 8173S | 稀释比例：1:100 |
| 乙酰化组蛋白 H3 Lys27 (MA523516) | Invitrogen | MA523516 | 稀释比例：1:100 |
| 放线菌素 D | New England Biolabs | 15021S | |
| 茴香霉素 | New England Biolabs | 2222S | |
| 抗组蛋白 H3（三甲基化 K4） | Abcam | ab213224 | 稀释比例：1:100 |
| 抗乳酸化组蛋白 H4（Lys 12）兔单克隆抗体 | PTM Biolabs | PTM-1411RM | 稀释比例：1:250 |
| 抗 L-乳酸赖氨酸兔多克隆抗体 | PRM Biolabs | PTM-1401RM | 稀释比例：1:250 |
| Apc 抗 P2RY12 抗体，克隆：S16007D | BioLegend | 848006 | |
| BSA | Tocris | 5217 | |
| Cyto-Last 缓冲液 | BioLegend | 422501 | |
| 二甲基亚砜，无菌 | Cell Signalling Technology | 12611S | |
| DNase I | STEMCELL Technologies | 07900 | |
| 驴抗小鼠 AlexaFluor488 | Jackson ImmunoResearch | 715-546-150 | 稀释比例：1:500 |
| 驴抗兔 AlexaFluor488 | ABclonal | AS035 | 稀释比例：1:500 |
| 驴抗兔 AlexaFluor568 | Invitrogen | A10042 | 稀释比例：1:500 |
| 驴抗兔 Brilliant Violet 421 | BioLegend | 406410 | 稀释比例：1:500 |
| Fisherbrand 一次性刻度移液管 | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Fisherbrand 一次性 PES 滤器单元，250 mL | Fisherbrand | FB12566502 | |
| H3K18ac 多克隆抗体 | Invitrogen | 720095 | 稀释比例：1:100 |
| HBSS (10X)，无钙，无镁，无酚红 | Gibco | 14185052 | |
| HBSS，无钙，无镁，无酚红 | Gibco | 14175103 | |
| 组蛋白 H3 三甲基化 K27 (ab6002) | Abcam | ab6002 | 稀释比例：1:100 |
| KONTES Dounce 组织研磨器 125 mm 7 mL | VWR | 885300-0007 | |
| 乳酸化组蛋白 H3（Lys 18）兔单克隆抗体 | PTM BIolabs | PTM-1406RM | 稀释比例：1:250 |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L5418 | |
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OneComp eBeads 补偿微珠 | Invitrogen | 01-1111-41 | |
| PDS 试剂盒，木瓜蛋白酶小瓶 - Worthington Biochemical | Cedarlane | LK003178 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | GE17-0891-02 | |
| 酚红 | VWR | RC57004 | |
| QIAshredder | Qiagen | 79656 | |
| 彩虹荧光微粒，单峰（3.0-3.4 μm - 中等强度） | BioLegend | 422905 | |
| 无RNase 微离心管，1.5 mL | Invitrogen | AM12400 | |
| RNeasy Plus Micro 试剂盒 | Qiagen | 74034 | |
| 带盖圆底聚丙烯管，5 mL | Corning | 352063 | |
| 雷公藤甲素 | New England Biolabs | 97539 | |
| True Nuclear 转录因子缓冲液套装 | BioLegend | 424401 | |
| TruStain FcX PLUS（抗小鼠 CD16/32）抗体 | BioLegend | 156604 | |
| 台盼蓝 | VWR | 97063-702 | |
| Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒 | BioLegend | 423102 |
参考文献
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