利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9与腺相关病毒单导向RNA系统联合构建棕色脂肪特异性基因敲除小鼠

摘要

在本实验方案中，我们描述了利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统相结合的技术，构建脂肪组织特异性敲除小鼠的方法。所述步骤包括sgRNA的设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及将AAV显微注射至棕色脂肪组织（BAT）叶中的操作。

摘要

棕色脂肪组织（BAT）是一种专门用于能量耗散的脂肪储存库，也可通过分泌生物活性分子作为内分泌器官。via 利用Cre-LoxP系统进行基因靶向的传统策略一直是构建组织特异性基因敲除小鼠的主要方法。然而，该方法耗时且繁琐。本文介绍了一种结合Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统的快速高效敲除BAT中目标基因的实验方案。肩胛间BAT位于肌肉深层之间，因此必须暴露BAT，以便在视野范围内精确且直接地将AAV注射到BAT中。适当的外科操作至关重要，以避免损伤支配BAT的交感神经和血管（例如连接BAT的Sultzer静脉）。为最大限度减少组织损伤，必须充分理解BAT的三维解剖位置以及技术操作所需的手术技能。本方案重点阐述了关键的技术步骤，包括靶向目标基因的sgRNA设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及通过直接显微注射将AAV注入双侧BAT叶以构建BAT特异性基因敲除小鼠的手术操作，该方法可广泛应用于研究基因在BAT中的生物学功能。

引言

肥胖在全球范围内以显著速度增长，导致一系列代谢性疾病^1,2,3脂肪组织在这些病理过程中起着关键作用。目前已知存在两种功能不同的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT），负责储存多余热量；棕色脂肪组织（BAT）及其相关的米色/类棕色脂肪（beige/brite fat），则通过产热作用耗散能量。尽管BAT的能量耗散功能已被广泛认知，但它同时也具有内分泌功能。 通过 在远端器官中调控代谢的生物活性分子的产生^4,5大量啮齿类动物研究表明，增加棕色脂肪或米色脂肪的数量或活性可提高能量消耗，并改善胰岛素敏感性。在人类中，可检测到棕色脂肪组织（BAT）的人群，其心脑血管代谢性疾病的患病率显著较低。⁶因此，BAT 对肥胖相关的代谢后遗症具有良好的治疗潜力^7,8,9.

为了研究棕色脂肪组织（BAT）发育与功能的生理学及病理生理学机制，并阐明参与这些过程的分子机制，BAT特异性的转基因小鼠模型是首选方法¹⁰。Cre-LoxP重组系统是通过编辑小鼠基因组来构建条件性基因敲除小鼠最常用的方法¹¹。该系统能够以组织/细胞特异性的方式对目的基因进行修饰（过表达或敲除）。此外，该系统也可用于通过表达特异性荧光报告基因来标记特定类型的细胞。

近年来，Cre-LoxP 系统通过与 CRISPR-Cas9 技术及腺相关病毒（AAV）单导向 RNA（sgRNA）系统相结合而得到了进一步发展¹²。CRISPR-Cas9 系统是一种特异性强且高效的基因编辑工具，可用于修饰、调控或靶向基因组的特定区域¹³。基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑能够快速操纵基因组位点，因为它无需依赖基因靶向载体进行同源重组。结合使用 Cre-LoxP、CRISPR-Cas9 和 AAV-sgRNA 技术，研究人员可在特定时间对特定组织或细胞中目标基因的功能进行研究，从而更精确地理解基因功能。此外，这些联合技术减少了构建转基因小鼠所需的时间和工作量；若使用可诱导的 Cre 品系，还可实现对小鼠体内 CRISPR-Cas9 活性的时空调控，从而进行可诱导的基因组编辑¹⁴。

AAV 载体安全且有效 体内 基因递送系统。然而，靶向脂肪组织的AAV在应用上落后于其他组织（如脑、心脏、肝脏和肌肉）中的应用¹⁵由于天然血清型载体的转导效率相对较低且具有嗜性限制，腺相关病毒介导的基因递送在脂肪组织中的应用仍然具有挑战性¹⁵近五年来，我们及其他研究者已成功建立了高效且微创的腺相关病毒（AAV）介导基因递送方法，将基因靶向递送至脂肪组织，并构建了小鼠模型，使我们能够深入了解参与棕色脂肪组织（BAT）功能调控的相关基因。^16,17,18,19例如，通过使用 AAV8 递送靶向 sgRNA Alox12，该基因编码12-脂氧合酶（12-LOX），我们发现激活的棕色脂肪组织可产生12-LOX代谢物，即12-羟基二十碳五烯酸（12-HEPE）和13R,14S-二羟基二十二碳六烯酸（maresin 2），分别用于调节葡萄糖代谢和缓解肥胖相关的炎症^16,17在此，我们提供了一套逐步的技术操作方案，重点介绍通过直接向棕色脂肪组织（BAT）小叶微注射AAV-sgRNA的手术步骤，以利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9与AAV-sgRNA联合系统构建BAT特异性基因敲除小鼠。

方案

所有动物实验和护理程序均经乔斯林糖尿病中心机构动物护理和使用委员会批准。

1. 在培养细胞中筛选有效的单导向RNA

注意：为了降低检测成本，在将sgRNA包装成AAV颗粒之前，建议先在培养细胞中测试不同的sgRNA 通过 基于慢病毒的 Cas9/sgRNA 表达系统图1）并筛选出敲低效率最高的sgRNA 体内 实验。

1. CRISPR-Cas9 sgRNA设计
   1. 使用在线工具（如 Broad sgRNA 设计工具，https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）设计 sgRNA^20,21，CRISPOR 在线工具（http://crispor.tefor.net/）²²及其他可用工具。
   2. 在基因名称框中输入基因名称或DNA靶序列，并选择 NGG 作为SpCas9生成潜在sgRNA序列的原间隔序列邻近基序（PAM）。
   3. 选择具有高预测靶向效率和低脱靶活性的sgRNA。例如，建议使用CRISPOR输出结果中特异性评分至少为50的sgRNA。在通过筛选的特异性sgRNA中，选择效率评分较高的序列²³.
      注意：通常选择三到四个单导向RNA（sgRNA），以确保鉴定出有效的sgRNA。
2. CRISPR-Cas9 sgRNA 质粒的构建
   1. 合成编码20个核苷酸（nt）靶向序列的sgRNA寡核苷酸对，其两端（5'和3'）带有来自BsmBI限制性酶切位点的突出端表1）通过DNA合成平台。
   2. 使用BsmBI线性化的lentiCRISPR v2载体连接退火的寡核苷酸对。
   3. 将连接产物转化至 Stbl3 感受态细胞中 大肠杆菌 品系，并使用U6正向引物通过Sanger DNA测序确认sgRNA插入。
      注意：请参见 Addgene 公司的实验方案《LentiCRISPRv2 和 lentiGuide-Puro：慢病毒 CRISPR/Cas9 与单导向 RNA》中详细的克隆步骤²⁴.
3. 生产慢病毒颗粒
   1. 转染前约24小时，将7 x 10⁵ 6 cm 组织培养板中含 4 mL 完全生长培养基的 HEK-293 细胞。
   2. 加入15 µL的LT1转染试剂加入250 µL 无血清培养基，室温孵育 5 分钟。
   3. 为每种sgRNA配制转染混合液 表2 在250 µL 无血清培养基中。将步骤 1.3.2 中配制的转染试剂与质粒混合物混合，室温孵育 20–30 分钟。
   4. 将完全培养基替换为 3.5 mL 新鲜的 HEK-293 细胞培养基，然后将 DNA 转染试剂混合物逐滴加入培养在 3.5 mL 新鲜培养基中的 HEK-293 细胞中。
   5. 转染后12-15小时，更换培养基以去除转染试剂，并加入4 mL新鲜生长培养基。
   6. 孵育24小时后，收集含有慢病毒颗粒的细胞培养基，并通过0.45 μm滤膜过滤培养基。 µm 滤器去除任何 HEK-293 细胞。病毒可在 4 °C下保存数天。对于长期储存，病毒应于−80 °C.
      注意：制备慢病毒颗粒时应遵循生物安全指南，并在适合处理慢病毒的环境（如生物安全二级或以上实验室）中进行操作。慢病毒的详细制备步骤请参见Addgene发布的《pLKO.1 - TRC克隆载体操作指南》（https://www.addgene.org/protocols/plko/#G）。
4. 棕色前脂肪细胞的感染及sgRNA介导的敲低效果检测
   1. 1 x 10 孔板⁶ 1 mL 含 8 的新鲜培养基中的小鼠永生化棕色前脂肪细胞 µ每孔加入含聚凝胺（polybrene）g/mL的溶液，置于6孔板中。
      注意：本研究中，永生化的棕色前脂肪细胞是使用SV40 T抗原建立的²⁵棕色前脂肪细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。
   2. 从步骤1.3中加入1 mL慢病毒颗粒溶液以感染细胞。同时平行培养一孔未感染的细胞，作为抗生素筛选对照。
   3. 感染后24小时更换为新鲜培养基。加入相应的抗生素（例如，嘌呤霉素，终浓度为1 µg/mL）加入培养基中，以杀死未感染的细胞并筛选出感染成功的细胞。每隔一天更换一次含有筛选抗生素的新鲜培养基，直至所有未感染的对照细胞完全死亡。
   4. 收集病毒感染细胞的蛋白质，通过蛋白质印迹分析测定sgRNA的敲低效率。参照Eslami和Lujan提供的详细蛋白质印迹实验步骤进行操作。²⁶由于不同蛋白质的 turnover 速率存在差异，应检测多个时间点（例如病毒转染后第6天至第12天），以观察蛋白质信号的丢失情况。
      注意：如果无法获得识别目的基因所编码蛋白的抗体，可 alternatively 使用 Sanger 测序来确定每种 sgRNA 的基因组编辑效率。简言之，使用位于 sgRNA 靶向区域侧翼的引物扩增基因组 DNA，以生成长度约为 700 bp 的 PCR 扩增子。预计的断裂位点应位于测序起始位点下游约 200 bp 处。随后，对 PCR 产物进行 Sanger 测序。利用在线分析工具（如通过分解追踪插入缺失突变（TIDE））分析测序结果，以确定每种 sgRNA 在细胞群体中产生小片段插入缺失突变的频率。²⁷.

2. AAV-sgRNA 质粒的构建

注意：在此步骤中，从上述筛选中鉴定出的有效sgRNA被克隆至pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP载体中²⁸（图2）。同时，将一个不靶向任何序列的sgRNA（例如TCTGATAGCGTAGGAGTGAT²⁹），即不识别小鼠基因组中任何序列的非靶向sgRNA，也克隆到相同载体中，作为未编辑对照。

1. 使用 BbsI 线性化 pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP 载体，该酶可产生与合成的 sgRNA 寡核苷酸相同的黏性末端。
2. 将退火后的寡核苷酸双链与线性化的 pAAV 载体进行连接，并按照步骤 1.2 中所述方法确认 sgRNA 插入正确。
   ​注意：lentiCRISPRv2-sgRNA 的克隆流程同样适用于 AAV-sgRNA 质粒的构建。

3. AAV 包装

1. 将第2节中产生的AAV载体包装为AAV血清型8。根据先前的方案制备高滴度AAV。³⁰，或向病毒核心实验室或商业服务机构申请 AAV 包装服务。将病毒滴度稀释至 1 x 10¹³ 基因组拷贝数/mL
   ​注意：表达单导向RNA的改造型AAV2基因组被包装至AAV8血清型中。选择该血清型是因其对脂肪组织具有高效转导效率。^18,31为防止细胞碎片和少量培养基成分等污染物引发免疫反应，需要使用超纯化的 AAV 在体 注射。通过碘克沙醇梯度和超速离心可实现超纯化。³⁰.

4. Ucp1 Cre/Cas9 小鼠的准备

1. 购买在 Ucp1 启动子控制下表达 Cre 重组酶的 Ucp1-Cre 小鼠品系（参见材料表）。购买纯合的 Rosa26-floxed STOP-Cas9 基因敲入小鼠³²（参见材料表），其中 Cas9 的表达受 Cre 重组酶依赖性调控。
2. 如先前所述^16,17，将上述品系杂交以获得 Ucp1-Cre/Cas9 小鼠。将所有小鼠饲养于温湿度受控的环境中（23 °C，30% 湿度），维持 12 小时光照-黑暗循环（光照时间：上午 6:30 至下午 6:30），并可自由摄取普通饲料和饮水。
3. 通过下述方法，用携带对照 sgRNA 或靶向目的基因的 sgRNA 的 AAV 处理所获得的 Ucp1-Cre/Cas9 小鼠。本研究中使用约 30 g 重的 12–15 周龄雄性 Ucp1-Cre/Cas9 小鼠。

5. 小鼠棕色脂肪组织AAV注射手术

1. 使用2.5%异氟烷持续吸入麻醉，对小鼠进行诱导和维持麻醉。
2. 润滑双眼以防止干燥。然后，给予镇痛药（氟尼辛葡甲胺，2.5 mg/kg 体重 [BW]，皮下注射，参见 材料表)以尽量减少和预防术后疼痛与不适。
3. 使用剃毛器剃除小鼠肩胛间区的毛发，并用碘伏或氯己定消毒液与70%乙醇交替擦拭至少三遍，对手术区域进行消毒。然后，在切口周围铺放无菌手术巾。
4. 切开皮肤 肩胛骨之间 使用解剖刀图3A- B），然后用手术剪将剃毛后的皮肤剥离，以暴露颈部的脂肪组织 (图3C- D切口的大小取决于动物体型，但通常切口应约为2厘米，以暴露肩胛间区域的脂肪组织。
5. 使用单一切口，在脂肪组织远端区域与肌肉交界处切割脂肪组织。图3E-F切口大小应约为1厘米，仅需打开足以插入手术剪以进行脂肪组织钝性剥离的入口。
6. 用惯用手持手术剪，钝性并垂直剥离脂肪组织以暴露棕色脂肪组织，同时用非惯用手捏住包括棕色脂肪组织在内的脂肪组织。图3G以Sultzer静脉作为解剖标志，确定棕色脂肪组织（BAT）的精确位置。
   注意：棕色脂肪组织（BAT）在 图3H 为拍摄图片演示而完全暴露组织。过度解剖可能损伤周围棕色脂肪组织（BAT）的神经。手术剪方向错误可能损伤周围肌肉及引流BAT的Sultzer静脉，导致过度出血。
7. 每只小鼠注射40 µ将 AAV 缓慢注入两侧 BAT 叶（每侧 20 微升） µL 每个 BAT 叶）使用锐利针头（32 G，参见 材料表) 连接到一个汉密尔顿注射器（100 µL，参见 材料表; 图3I通过观察腺相关病毒（AAV）给药期间注射部位无液体渗漏，判断注射是否成功。
   注意：在暴露过程中，无法在不造成组织过度损伤的情况下精确定位棕色脂肪组织（BAT）。 图3I 完全暴露以进行图片展示。注射到棕色脂肪组织（BAT）叶中的AAV溶液体积由受体小鼠BAT的大小决定。我们已确定20 µ对于一只体重约30 g的普通C57BL/6J小鼠，每片约0.05 g的棕色脂肪组织（BAT）小叶使用L量的AAV溶液是合适的。如有必要，可能需要浓缩病毒溶液以达到所需体积。
8. 确认注射的棕色脂肪组织（BAT）或周围组织无出血。用浸有双氧水溶液的纱布按压（参见 材料表) 用于出血部位以止血。
9. 将暴露的脂肪组织复位至正常位置。使用5-0可吸收单股缝线缝合脂肪组织与肌肉边缘。图3J用5-0涂层未染色编织薇乔线缝合开放的皮肤图3K-L).
   注意： 图4 描述了缝合剥离后的脂肪组织与肌肉的步骤。
10. 手术后将动物置于加热垫上直至完全恢复。为动物提供食物、饮水以及充足的垫料用于筑巢。在实验开始前，对动物进行为期7天的恢复期观察，定期监测其是否有任何痛苦或疾病的迹象。
11. 通过蛋白质印迹分析确认从小鼠分离的棕色脂肪组织中靶基因删除的效率，如Sugimoto等所述。¹⁶.

结果

在整个上述操作过程中，将AAV-sgRNA精确递送至棕色脂肪组织（BAT）是本实验方案成功的关键。为了最大化AAV-sgRNA的作用效果并尽量减少手术过程中的组织损伤，必须充分了解BAT的三维（3D）解剖位置。如图3E所示，在未暴露组织的情况下很难准确定位BAT。然而，过度暴露BAT可能会造成组织损伤（图3H, I）；因此，操作应确保在有限的解剖空间内完成AAV溶液的注射（图3G）。图5A对于确保AAV注射的成功以及小鼠术后快速恢复至关重要。图5B-D展示了可能导致注射失败的几种潜在问题，包括将AAV溶液注射到错误区域（图5B）、针头穿透组织（图5C...

讨论

现有的关于通过腺相关病毒（AAV）介导将基因递送至肩胛间棕色脂肪组织（BAT）的方法，均未包含详细描述手术技术及直接向BAT注射AAV操作过程的图片和视频。在大多数已发表的方法中^33,34，将AAV注射到肩胛间棕色脂肪组织（BAT）周围的脂肪组织中，而非直接注射到BAT本身。因此，本实验方案中有多个关键步骤决定了研究的成败，包括sgRNA的设计、AAV的包装与浓缩、BAT特异性Cas9小鼠的构建以及手术操作。完成该过程需要精细且高超的外科手术技能 体内 操作步骤。特别是，在暴露棕色脂肪组织（BAT）和注射腺相关病毒（AAV）时，尽量减少组织损伤至关重要。由于多种遗传和环境因素（如饲养温度、运动训练和饮食），围绕BAT的白色脂肪体积以及BAT本身的组成在不同动物之间可能存在差异。例如，肥胖小鼠的BAT周围存在大量白色脂肪组织，而在热中性环境（30 °C）下饲养的小鼠则表现出BAT的“白色化”。因此，在不切开皮肤的情况下，精确确定BAT的三维位置具有挑战性。在AAV注射过程中，尽可能小范围地暴露BAT是一项...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂、多肽与重组蛋白
OPTI-MEM 无血清培养基	Invitrogen	31985
Polybrene 感染/转染试剂	Sigma	TR-1003-G
TransIT-LT1 转染试剂	Mirus	MIR 2300
重组DNA
lentiCRISPR v2 载体	Addgene	52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP	Addgene	89060
pMD2.G 包装质粒	Addgene	12259
psPAX2 包装质粒	Addgene	12260
实验模型：细胞系
HEK-293 细胞	ATCC	CRL-1573
WT-1 细胞	Tseng 实验室构建	PMID: 14966273
实验模型：生物体/品系
Cas9 基因敲入小鼠	Jackson 实验室	24857
Ucp1-CRE 小鼠	Jackson 实验室	24670
其他
Banamine	Patterson	07-859-1323
Hamilton 注射器	Hamilton	Model 710 RN Syringe
过氧化氢溶液	Fisher Scientific	H325-500
针头	Hamilton	32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2
缝合线 5-0 Unify PCL25 P-3 无色 18 英寸 单股 12/盒	Henry Schein	1273504
缝合线 5-0 Unify 丝线 P-3 黑色 18 英寸 12/盒	Henry Schein	1294522