方法文章

通过鸡胚体内移植实现肾类器官的有效血管化

DOI：

10.3791/65090

⸱

2023年2月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

本文内容

摘要

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本文介绍了一种将肾类器官移植到鸡胚体腔的详细方案。该方法可在8天内诱导类器官的血管化并促进其进一步成熟，可用于高效研究这些过程。

摘要

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由人类诱导多能干细胞衍生的肾类器官包含一定程度上类似于成人肾脏的肾单位样结构。然而，由于缺乏功能性血管系统，导致其成熟程度受限，从而阻碍了其临床应用 体外将肾类器官移植到鸡胚的体腔中可诱导其通过灌注血管实现血管化，包括形成肾小球毛细血管，并促进类器官的成熟。该技术效率很高，可实现大量类器官的移植与分析。本文介绍了一种详细的实验方案，用于在鸡胚中进行类器官体腔内移植，随后注射荧光标记的凝集素以标记灌注的血管系统，并收集移植后的类器官用于成像分析。该方法可用于诱导并研究类器官的血管化与成熟过程，从而为增强这些过程提供线索。 体外 并改善疾病建模。

引言

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由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的肾类器官已被证明在发育研究中具有潜在应用价值1,2,3,4，毒性筛选5,6和疾病建模5,7,8,9,10,11,12,13然而，由于缺乏血管网络，这些器官在上述应用及最终的临床移植用途上受到限制。在胚胎肾脏发育过程中，足细胞、系膜细胞和血管内皮细胞（ECs）相互作用，形成肾小球的复杂结构。若缺乏这种相互作用，由足细胞、肾小球基底膜（GBM）和内皮细胞（ECs）组成的肾小球滤过屏障便无法正常发育。<....

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方案

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根据荷兰法律，本研究无需动物福利委员会批准。

1. 准备受移植的hiPSC来源的肾类器官

  1. 采用Takasato等人开发的方案将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为肾类器官4,18,31。将类器官按照该方案在孔径为0.4 µm的聚酯细胞培养小室（cell culture inserts）上培养至分化第7+12天。每个细胞培养小室将包含三个类器官。
  2. 从细胞培养小室中取出类器官。
    1. 使用解剖镊在细胞培养小室膜的中央打一个小孔，再用解剖剪从中央孔向小室边缘沿类器官之间的间隙剪出三条切口，从而将膜分为三部分，每部分均附有一个类器官，并在其外缘仍与细胞培养小室相连。
    2. 用镊子夹住其中一片膜的外缘附近，将其从细胞培养小室上撕下。将带有附着类器官的膜片放入培养皿中，并向类器官滴加数滴不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS-/-），以防止脱水。对另外两个类器官重复此操作。
  3. 用镊子固定类器官所在的膜片，使用双刃不锈钢剃须刀片将类器官切成两半（完整的....

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结果

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hiPSCs 分化为肾类器官、受精鸡胚的孵育、肾类器官的移植、LCA 注射以及类器官回收的方法与时间线总结于图1A。需协调好类器官分化与鸡胚孵育的时间，在开始孵育前15天启动分化。孵育第0、3、4和12天的操作由时间线下方的照片展示。类器官在分化第7+12天时移植至孵育第4天（HH 23-24期）的鸡胚中。移植后8天，将LCA注入鸡胚的静脉系统，以标记灌注的血管系统，随后处死鸡胚并回收类器官。组装好的注射系统如图1B所示。

在孵化第12天处死鸡胚（图1A）。仔细解剖胚胎后，通常可在肝脏上发现移植的类器官。通过解剖显微镜观察，可见其已形成血管化结构（图1A；第12天；步骤5.2.3）。对注射了LCA并针对肾单位结构和人源内皮细胞（ECs）进行染色的移植类器官进行共聚焦成像，结果显示存在灌注的血管，证实了血管化（

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讨论

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本文展示了一种将人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的肾类器官移植到鸡胚体腔内的实验方案。移植后，类器官通过含有类器官来源的人源细胞和鸡源细胞共同构成的灌注性血管网络实现血管化。这些血管遍布整个类器官，并侵入肾小球结构，促使内皮细胞与足细胞之间发生相互作用。先前研究已表明，这一过程可促进类器官中肾小球和肾小管结构的进一步成熟28。该移植方法效率高，每个胚胎操作时间约为5分钟，胚胎仅需在培养过程中定期补充孵育箱中的水槽即可。因此，该方法非常适用于对大量类器官进行分析研究。

通过在小鼠体内移植已证明肾脏类器官的血管化与成熟18,20在这些劳动密集型小鼠模型中，类器官被移植的时间为2周至最长12周。而在本研究所展示的卵黄囊腔内移植实验中，移植持续时间被限制在8天。这使得胚胎可在孵化第13天前被处死，从而避免其进入可能开始感知疼痛的发育阶段。33,

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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我们感谢荷兰莱顿大学医学中心（LUMC）的 George Galaris 在鸡胚注射方面的帮助。我们感谢解剖学系的 Saskia van der Wal-Maas 提供的支持。 & 胚胎学，荷兰莱顿大学医学中心（LUMC）)，Conny van Munsteren（解剖学系 & 胚胎学，荷兰莱顿大学医学中心（LUMC，Leiden，the Netherlands），Manon Zuurmond（LUMC，Leiden，the Netherlands）以及 Annemarie de Graaf（LUMC，Leiden，the Netherlands）。M. Koning 的研究得到“Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC”项目的资助。本工作部分由莱顿大学基金（Leiden University Fund）支持。 "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma 基金" GWF2019-02。本工作由再生医学跨界合作（Regenerative Medicine Crossing Borders，RegMedXB）合作伙伴及荷兰健康荷兰生命科学顶尖领域（Health Holland, Top Sector Life Sciences）资助 & 健康。C.W. van den Berg 和....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µm 滤器：Whatman Puradisc 30 注射器滤器 0.2 µmWhatman10462200
35 mm 玻璃底培养皿 MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
校准微毛细管移液器用吸管管组件Sigma-AldrichA5177-5EA包含硅胶管、口件和连接器
共聚焦显微镜：Leica 白光激光共聚焦显微镜 LeicaTCS SP8
解剖镊，简易型。钛制，弯曲，尖端细而锋利Hammacher KarlHAMMHTC091-10
解剖镊，简易型。钛制，直头，尖端细而锋利Hammacher KarlHAMMHTC090-11
解剖显微镜 Wild Heerbrugg355110
解剖剪，弯型，手术专用，超锐利/锐利Hammacher KarlHAMMHSB391-10
驴血清Sigma-AldrichD9663
驴-α-小鼠 Alexa Fluor 488赛默飞世尔科技A-212-02稀释比例 1:500
驴-α-羊 Alexa Fluor 647赛默飞世尔科技A-21448稀释比例 1:500
双刃不锈钢剃须刀片电子显微科学72000
DPBS，不含钙、镁（DPBS-/-）赛默飞世尔科技14040133
不含钙、不含镁的DPBS（DPBS+/+）赛默飞世尔科技14190094
鸡蛋托盘或定制的鸡蛋架 NANA
受精的白来航鸡鸡蛋（Gallus gallus domesticus) Drost Loosdrecht B.V.NA
培养箱Elbanton BVET-3 combi
生物素标记的四棱豆凝集素（LTL）Vector LaboratoriesB-1325稀释比例 1:300
显微剪刀，直型，尖头/尖头，切割长度10 mmHammacher KarlHAMMHSB500-09
微毛细管：薄壁玻璃毛细管，1.5 mm，带丝World Precision InstrumentsTW150F-3
微量移液器拉制仪Sutter Instrument CompanyModel P-97我们使用以下参数设置：加热 533，拉力 60，速度 150，时间 200
微型手术刀架：Castroviejo刀片及针持架，12 cm，圆形手柄，锥形10 mm钳口。EuronexiaL-120
封片剂：Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 赛默飞世尔科技P36930
Olivecrona硬组织解剖镊 18 cm Reda41146-18
Parafilm Heathrow ScientificHS234526B
青霉素-链霉素 5,000 U/mL赛默飞世尔科技15070063
带孔勺子 EuronexiaS-20-P
培养皿 60 × 15 mm CELLSTAR628160
塑料移液管 赛默飞世尔科技PP89SB
纯化小鼠抗人CD31抗体BD 生物科学555444稀释比例 1:100
罗丹明标记的扁豆凝集素（LCA）Vector LaboratoriesRL-1042该产品最近已停产。Vectorlabs 仍生产 Dylight 649 标记的 LCA（DL-1048-1）和荧光素标记的 LCA（FL-1041-5）。
羊抗人NPHS1抗体R&D 系统AF4269稀释比例 1:100
无菌皮下注射针头，19 GBD 微型采血针301500
链霉亲和素 Alexa Fluor 405赛默飞世尔科技S32351稀释比例 1:200
5 mL 注射器BD Emerald307731
透明胶带 Tesa4124大多数五金店有售
Triton XSigma-AldrichT9284
钨丝，直径0.25 mm 赛默飞世尔科技010404.H2

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al.

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