本文介绍了一种将肾类器官移植到鸡胚体腔的详细方案。该方法可在8天内诱导类器官的血管化并促进其进一步成熟，可用于高效研究这些过程。
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本文内容
摘要
摘要
由人类诱导多能干细胞衍生的肾类器官包含一定程度上类似于成人肾脏的肾单位样结构。然而，由于缺乏功能性血管系统，导致其成熟程度受限，从而阻碍了其临床应用 体外将肾类器官移植到鸡胚的体腔中可诱导其通过灌注血管实现血管化，包括形成肾小球毛细血管，并促进类器官的成熟。该技术效率很高，可实现大量类器官的移植与分析。本文介绍了一种详细的实验方案，用于在鸡胚中进行类器官体腔内移植，随后注射荧光标记的凝集素以标记灌注的血管系统，并收集移植后的类器官用于成像分析。该方法可用于诱导并研究类器官的血管化与成熟过程，从而为增强这些过程提供线索。 体外 并改善疾病建模。
引言
由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的肾类器官已被证明在发育研究中具有潜在应用价值1,2,3,4，毒性筛选5,6和疾病建模5,7,8,9,10,11,12,13然而，由于缺乏血管网络，这些器官在上述应用及最终的临床移植用途上受到限制。在胚胎肾脏发育过程中，足细胞、系膜细胞和血管内皮细胞（ECs）相互作用，形成肾小球的复杂结构。若缺乏这种相互作用，由足细胞、肾小球基底膜（GBM）和内皮细胞（ECs）组成的肾小球滤过屏障便无法正常发育。<....
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方案
根据荷兰法律，本研究无需动物福利委员会批准。
1. 准备受移植的hiPSC来源的肾类器官
- 采用Takasato等人开发的方案将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为肾类器官4,18,31。将类器官按照该方案在孔径为0.4 µm的聚酯细胞培养小室（cell culture inserts）上培养至分化第7+12天。每个细胞培养小室将包含三个类器官。
- 从细胞培养小室中取出类器官。
- 使用解剖镊在细胞培养小室膜的中央打一个小孔，再用解剖剪从中央孔向小室边缘沿类器官之间的间隙剪出三条切口，从而将膜分为三部分，每部分均附有一个类器官，并在其外缘仍与细胞培养小室相连。
- 用镊子夹住其中一片膜的外缘附近，将其从细胞培养小室上撕下。将带有附着类器官的膜片放入培养皿中，并向类器官滴加数滴不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS-/-），以防止脱水。对另外两个类器官重复此操作。
- 用镊子固定类器官所在的膜片，使用双刃不锈钢剃须刀片将类器官切成两半（完整的....
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结果
hiPSCs 分化为肾类器官、受精鸡胚孵育、肾类器官移植、LCA 注射以及类器官回收的方法与时间线总结于图 1A。必须协调好类器官分化与鸡胚孵育的时间，在开始孵育前 15 天启动分化。时间线下方的图片展示了孵育第 0、3、4 和 12 天的操作。在分化第 7+12 天将类器官移植至孵育第 4 天（HH 23–24 期）的鸡胚中。移植后 8 天，将 LCA 注入胚胎的静脉系统以标记灌注的血管，随后处死胚胎并回收类器官。组装好的注射系统见图 1B。
在孵化第12天处死鸡胚（图1A）。仔细解剖胚胎后，通常可在肝脏上发现移植的类器官。通过解剖显微镜观察，可见其已形成血管化结构（图1A；第12天；步骤5.2.3）。对注射了LCA并针对肾单位结构和人源内皮细胞（ECs）进行染色的移植类器官进行共聚焦成像，结果显示存在灌注的血.......
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讨论
本文展示了一种将人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的肾类器官移植到鸡胚体腔内的实验方案。移植后，类器官通过含有类器官来源的人源细胞和鸡源细胞共同构成的灌注性血管网络实现血管化。这些血管遍布整个类器官，并侵入肾小球结构，促使内皮细胞与足细胞之间发生相互作用。先前研究已表明，这一过程可促进类器官中肾小球和肾小管结构的进一步成熟28。该移植方法效率高，每个胚胎操作时间约为5分钟，胚胎仅需在培养过程中定期补充孵育箱中的水槽即可。因此，该方法非常适用于对大量类器官进行分析研究。
通过在小鼠体内移植已证明肾脏类器官的血管化与成熟18,20在这些劳动密集型小鼠模型中，类器官被移植的时间为2周至最长12周。而在本研究所展示的卵黄囊腔内移植实验中，移植持续时间被限制在8天。这使得胚胎可在孵化第13天前被处死，从而避免其进入可能开始感知疼痛的发育阶段。33,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢荷兰莱顿大学医学中心（LUMC）的 George Galaris 在鸡胚注射方面的帮助。我们感谢解剖学系的 Saskia van der Wal-Maas 提供的支持。 & 胚胎学，荷兰莱顿大学医学中心（LUMC）)，Conny van Munsteren（解剖学系 & 胚胎学，荷兰莱顿大学医学中心（LUMC，Leiden，the Netherlands），Manon Zuurmond（LUMC，Leiden，the Netherlands）以及 Annemarie de Graaf（LUMC，Leiden，the Netherlands）。M. Koning 的研究得到“Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC”项目的资助。本工作部分由莱顿大学基金（Leiden University Fund）支持。 "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma 基金" GWF2019-02。本工作由再生医学跨界合作（Regenerative Medicine Crossing Borders，RegMedXB）合作伙伴及荷兰健康荷兰生命科学顶尖领域（Health Holland, Top Sector Life Sciences）资助 & 健康。C.W. van den Berg 和....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µm 滤器：Whatman Puradisc 30 注射器滤器 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| 校准微毛细管移液器用吸管管组件 | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | 包含硅胶管、口件和连接器 |
| 共聚焦显微镜：Leica 白光激光共聚焦显微镜 | Leica | TCS SP8 | |
| 解剖镊，简易型。钛制，弯曲，尖端细而锋利 | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| 解剖镊，简易型。钛制，直头，尖端细而锋利 | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| 解剖显微镜 | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| 解剖剪，弯型，手术专用，超锐利/锐利 | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 驴-α-小鼠 Alexa Fluor 488 | 赛默飞世尔科技 | A-212-02 | 稀释比例 1:500 |
| 驴-α-羊 Alexa Fluor 647 | 赛默飞世尔科技 | A-21448 | 稀释比例 1:500 |
| 双刃不锈钢剃须刀片 | 电子显微科学 | 72000 | |
| DPBS，不含钙、镁（DPBS-/-） | 赛默飞世尔科技 | 14040133 | |
| 不含钙、不含镁的DPBS（DPBS+/+） | 赛默飞世尔科技 | 14190094 | |
| 鸡蛋托盘或定制的鸡蛋架 | NA | NA | |
| 受精的白来航鸡鸡蛋（Gallus gallus domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| 培养箱 | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| 生物素标记的四棱豆凝集素（LTL） | Vector Laboratories | B-1325 | 稀释比例 1:300 |
| 显微剪刀，直型，尖头/尖头，切割长度10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| 微毛细管：薄壁玻璃毛细管，1.5 mm，带丝 | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Company | Model P-97 | 我们使用以下参数设置：加热 533，拉力 60，速度 150，时间 200 |
| 微型手术刀架：Castroviejo刀片及针持架，12 cm，圆形手柄，锥形10 mm钳口。 | Euronexia | L-120 | |
| 封片剂：Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | 赛默飞世尔科技 | P36930 | |
| Olivecrona硬组织解剖镊 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| 青霉素-链霉素 5,000 U/mL | 赛默飞世尔科技 | 15070063 | |
| 带孔勺子 | Euronexia | S-20-P | |
| 培养皿 60 × 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| 塑料移液管 | 赛默飞世尔科技 | PP89SB | |
| 纯化小鼠抗人CD31抗体 | BD 生物科学 | 555444 | 稀释比例 1:100 |
| 罗丹明标记的扁豆凝集素（LCA） | Vector Laboratories | RL-1042 | 该产品最近已停产。Vectorlabs 仍生产 Dylight 649 标记的 LCA（DL-1048-1）和荧光素标记的 LCA（FL-1041-5）。 |
| 羊抗人NPHS1抗体 | R&D 系统 | AF4269 | 稀释比例 1:100 |
| 无菌皮下注射针头，19 G | BD 微型采血针 | 301500 | |
| 链霉亲和素 Alexa Fluor 405 | 赛默飞世尔科技 | S32351 | 稀释比例 1:200 |
| 5 mL 注射器 | BD Emerald | 307731 | |
| 透明胶带 | Tesa | 4124 | 大多数五金店有售 |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 钨丝，直径0.25 mm | 赛默飞世尔科技 | 010404.H2 |
参考文献
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al.
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重印与许可
