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方法文章

通过鸡胚体内移植实现肾类器官的有效血管化

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DOI：

10.3791/65090

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2023年2月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种将肾类器官移植到鸡胚体腔的详细方案。该方法可在8天内诱导类器官的血管化并促进其进一步成熟，可用于高效研究这些过程。

摘要

由人类诱导多能干细胞衍生的肾类器官包含一定程度上类似于成人肾脏的肾单位样结构。然而，由于缺乏功能性血管系统，导致其成熟程度受限，从而阻碍了其临床应用 体外将肾类器官移植到鸡胚的体腔中可诱导其通过灌注血管实现血管化，包括形成肾小球毛细血管，并促进类器官的成熟。该技术效率很高，可实现大量类器官的移植与分析。本文介绍了一种详细的实验方案，用于在鸡胚中进行类器官体腔内移植，随后注射荧光标记的凝集素以标记灌注的血管系统，并收集移植后的类器官用于成像分析。该方法可用于诱导并研究类器官的血管化与成熟过程，从而为增强这些过程提供线索。 体外 并改善疾病建模。

引言

由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的肾类器官已被证明在发育研究中具有潜在应用价值1,2,3,4，毒性筛选5,6和疾病建模5,7,8,9,10,11,12,13然而，由于缺乏血管网络，这些器官在上述应用及最终的临床移植用途上受到限制。在胚胎肾脏发育过程中，足细胞、系膜细胞和血管内皮细胞（ECs）相互作用，形成肾小球的复杂结构。若缺乏这种相互作用，由足细胞、肾小球基底膜（GBM）和内皮细胞（ECs）组成的肾小球滤过屏障便无法正常发育。14,15,16尽管肾类器官 体外 确实含有一些内皮细胞，但这些细胞无法形成正常的血管网络，并且会随时间推移而减少17因此，类器官保持未成熟状态并不令人意外。在小鼠体内移植可诱导肾脏类器官的血管化和成熟18,19,20,21不幸的是，这一过程耗时耗力，不适合对大量类器官进行分析。

一百多年来，鸡胚一直被用于研究血管化和发育过程22。鸡胚易于获取，所需维护条件低，缺乏完全功能的免疫系统，并且在打开蛋壳后仍能正常发育23,24,25,26。已证明将类器官移植至其绒毛尿囊膜（CAM）可诱导血管生成27。然而，由于CAM的形成需持续至胚胎发育第7天才能完成，因此类器官在CAM上的移植持续时间以及移植物的成熟程度均受到限制。因此，近期开发出一种通过将类器官移植至鸡胚体腔内以实现高效血管化并促进肾脏类器官成熟的方法28。自20世纪30年代以来，人们已知鸡胚的体腔是胚胎组织分化的有利环境29,30。该腔体可在胚胎发育早期即可进入，并允许移植物在各个方向上相对自由地扩展。

本文概述了一种将人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的肾类器官移植到第4天鸡胚体腔的实验方案。该方法可在8天内诱导类器官的血管化并促进其进一步成熟。在处死鸡胚前注射荧光标记的扁豆凝集素（lens culinaris agglutinin, LCA），可通过共聚焦显微镜观察类器官内灌注血管的分布情况。

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方案

根据荷兰法律，本研究无需动物福利委员会批准。

1. 准备受移植的hiPSC来源的肾类器官

  1. 采用Takasato等人开发的方案将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为肾类器官4,18,31。将类器官按照该方案在孔径为0.4 µm的聚酯细胞培养小室（cell culture inserts）上培养至分化第7+12天。每个细胞培养小室将包含三个类器官。
  2. 从细胞培养小室中取出类器官。
    1. 使用解剖镊在细胞培养小室膜的中央打一个小孔，再用解剖剪从中央孔向小室边缘沿类器官之间的间隙剪出三条切口，从而将膜分为三部分，每部分均附有一个类器官，并在其外缘仍与细胞培养小室相连。
    2. 用镊子夹住其中一片膜的外缘附近，将其从细胞培养小室上撕下。将带有附着类器官的膜片放入培养皿中，并向类器官滴加数滴不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS-/-），以防止脱水。对另外两个类器官重复此操作。
  3. 用镊子固定类器官所在的膜片，使用双刃不锈钢剃须刀片将类器官切成两半（完整的类器官在此发育阶段对celom而言过大，无法容纳）。用硬脑膜剥离器轻轻将两个类器官半片从膜上推下。弃去膜片，将类器官保留在DPBS-/-中直至移植。
    注：每次最多准备三个类器官用于移植，以避免在移植前对类器官造成应激。理想情况下，由一人负责类器官准备，另一人同时进行移植操作。

2. 准备用于移植的鸡胚

  1. 孵育受精的白来航鸡卵。在类器官分化的第7天和第8天开始孵育鸡卵，以确保移植时间的准确性。
    1. 将受精的白来航鸡卵（Gallus domesticus）水平放置于孵育架上（图1A；第0天），并用铅笔标记朝上一侧的中心位置。
      注意：可使用自制塑料孵育架或鸡蛋托盘作为孵育容器。
    2. 将装有鸡卵的孵育架放入湿度控制的孵育箱中，温度维持在38 ± 1 ºC（图1A；第0天）。
    3. 继续孵育鸡卵3天，并保持孵育箱内水槽始终充满水。
  2. 在孵育第3天于蛋壳上开窗。
    1. 在孵育第3天，将一小片透明胶带（约1 cm × 0.5 cm）贴在鸡蛋的尖端（小头）。用解剖剪的尖端轻敲胶带中央，穿透蛋壳形成小孔。
    2. 将连接5 mL注射器的19 G针头以45°角插入孔中，避免损伤卵黄囊，抽出2–3 mL蛋清以降低胚胎在蛋内的位置。用第二片透明胶带（约1 cm × 0.5 cm）密封该孔。
    3. 在鸡蛋朝上一侧已用铅笔标记的部位贴上一大片透明胶带（约5 cm × 5 cm）。用解剖剪的尖端轻敲胶带中央，在蛋壳上打孔（图1A；第3天）。
    4. 从该孔开始，使用弯头解剖剪在蛋壳上剪出一个小的圆形窗口。透过窗口定位胚胎，随后扩大窗口以优化对胚胎的操作通路（图1A；第3天）。
    5. 使用镊子移除可能落在胚胎表面的较大蛋壳碎片。对于较小碎片，可用塑料移液管向胚胎表面滴加数滴含钙和镁的DPBS（DPBS+/+），然后将含有蛋壳碎片的DPBS+/+吸出。
    6. 用塑料移液管向蛋内加入三滴添加了0.5%青霉素/链霉素的DPBS+/+。
    7. 在将鸡蛋放回孵育箱前，用一大片透明胶带（约5 cm × 5 cm）小心密封窗口，继续孵育至第4天，此时胚胎应处于Hamburger-Hamilton 23–24期（HH 23–24）32。
      注意：密封窗口至关重要，可防止胚胎脱水和死亡。
    8. 每日通过胶带观察胚胎存活情况（切勿撕下胶带以免脱水）。在孵育初期，若胚胎死亡，卵黄颜色会由亮黄色变为哑光黄色。及时剔除已死亡的胚胎。
    9. 保持孵育箱内水槽始终充满水。

3. 孵育第4天的体内移植

  1. 进入体腔
    1. 用弯头解剖剪剪开窗口上的胶带。
    2. 将鸡蛋置于橡胶支架或蛋托上，并在解剖显微镜下观察。
    3. 此时鸡胚处于Hamburger-Hamilton（HH）23-24期，侧卧于左侧，右侧朝向观察者（图1A；第4天）。定位胚胎的右翼芽和后肢芽，体腔将通过这两个肢芽之间的区域进入。在右翼芽与后肢芽之间的区域，使用两对解剖镊夹住卵黄膜、绒毛膜和羊膜，轻轻向相反方向牵拉，依次在这些膜上制造开口。
      注：卵黄膜是打开鸡蛋后首先遇到的膜，在某些情况下，第3天开窗时可能已受损。如果胚胎发生旋转，以右侧朝下、左侧朝向观察者（图1A；第4天）的方式卧位，则必须将其翻转以方便移植操作。此时可在卵黄膜和绒毛膜上制造一个较大的开口，然后用镊子小心地将胚胎翻转。
    4. 检查是否可无障碍进入体腔：用一对解剖镊轻轻夹住翼芽与肢芽之间体壁边缘并向观察者方向轻拉。体腔必须清晰可见。将一根钝头但细长的工具（例如安装在显微手术刀柄上的钝钨丝）小心插入体腔。
      注：若无法将钝头工具插入体腔，说明一个或多个膜未完全打开。
  2. 移植操作
    1. 使用硬脑膜剥离器将半个类器官放置于尿囊上方的蛋内。
    2. 用解剖镊小心夹住体壁边缘并向观察者方向轻拉，使体壁上的开口清晰可见。
      注：避免损伤体壁中的血管。
    3. 使用安装在显微手术刀柄上的钝钨丝，轻柔地将类器官移向并穿过体壁开口进入体腔。将类器官略向头侧推动，使其固定于体腔内。此时类器官应刚好位于翼芽后方，清晰可见（图1A；第4天）。
    4. 使用塑料移液管向蛋内加入三滴DPBS+/+。
    5. 在将鸡蛋放回培养箱前，用一块较大的透明胶带（约5 cm × 5 cm）小心封住窗口，继续孵育至孵育第12天（移植后第8天）。
    6. 每日通过胶带观察胚胎存活情况（切勿揭开胶带以免脱水），淘汰已死亡的胚胎。
      注：随着胚胎及其绒毛尿囊膜的生长，透过胶带可更清晰地观察到胚胎。胚胎无活动迹象，以及血管塌陷或稀疏，是胚胎死亡的征象。
    7. 每日检查培养箱内的水盘，并保持其充满水。

4. 注射荧光标记的凝集素

  1. 准备注射
    1. 使用显微拉针仪将玻璃毛细管拉制成玻璃显微注射针，设置参数如下：加热温度 533，拉力 60，速度 150，时间 200。在解剖显微镜下，用解剖镊子小心折断显微注射针的尖端，形成开口。
      注意：不同型号的显微拉针仪所需参数可能有所不同。
    2. 组装注射系统。取两段长度为 38 cm 的硅胶管，将一个 0.2 µm 滤器夹在中间，连接两段硅胶管。将吹嘴插入与滤器出口相连的管端（硅胶管 1），将连接头插入与滤器入口相连的管端（硅胶管 2）。最后，将显微注射针插入连接头中（图 1B）。
    3. 在 0.5 mL 离心管中，用不含钙镁离子的 Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（DPBS-/-）将荧光标记的刀豆球蛋白 A（lens culinaris agglutinin, LCA）稀释至浓度为 2.5 mg mL-1，并在微量离心机中离心约 30 秒，使聚集物沉降至管底。
    4. 将 20 µL LCA 滴加至一片 Parafilm 膜上。
    5. 用已组装好的注射系统的显微毛细针从 Parafilm 膜上吸取 20 µL LCA。
  2. 注射
    1. 用弯头解剖剪剪开窗口处的封口胶带。将鸡胚置于橡胶支架中，并放置在解剖显微镜下观察。
    2. 观察血管系统，定位静脉。静脉可通过其略偏亮红色的颜色与动脉区分（图 1A；第 12 天）。为便于接近血管，可用弯头解剖剪小心扩大窗口。根据可及性和血管大小选择合适的静脉进行注射。
    3. 以 0°–20º 角度将显微毛细针尖插入选定的静脉。通过轻微左右移动针尖确认其已进入静脉内。然后平稳、轻柔地向注射系统吹气，注入 LCA（图 1A；第 12 天）。
      注意：若针尖位置正确，应始终保持在静脉边界内。
    4. 将鸡胚放回培养箱孵育 10 分钟，使 LCA 充分循环。
      ​注意：此期间无需用胶带密封鸡胚窗口。

5. 在孵育第12天收集移植的类器官

  1. 处死鸡胚
    1. 将鸡蛋放置在实验台上的橡胶支架中。使用弯头解剖剪剪开窗口上的胶带，然后用同一把剪刀剪开包裹鸡胚的膜结构。
      注意：此步骤无需使用解剖显微镜。
    2. 用带孔的勺子将鸡胚从蛋中舀出，并立即用剪刀将其头部剪除。将鸡胚躯体置于培养皿中，并放置于解剖显微镜下。
  2. 定位并采集类器官
    1. 将鸡胚仰面放置于培养皿中，并展开其四肢。
    2. 使用镊子沿鸡胚的纵轴小心切开腹壁。
    3. 在鸡胚体内寻找类器官。类器官最常附着于右肝叶，位置多在尾端尖部，或稍靠头侧、紧邻肋弓下方（图1A；第12天）。因此建议优先在这些区域进行查找。
    4. 一旦发现类器官，使用显微剪在其周围剪切，将其从鸡胚中取出。将类器官及其不可避免附带的鸡胚组织一同置于解剖显微镜下的培养皿中。使用双刃不锈钢剃须刀片尽可能去除附着的鸡胚组织。
    5. 根据所需的分析方法对类器官进行后续处理。

6. 整体免疫荧光染色

  1. 将移植的类器官置于24孔板中，加入500 µL 4%多聚甲醛（PFA），4 °C固定24 h。用DPBS洗涤3次-/-.
  2. 在300 µL封闭液（含0.3% Triton-X的DPBS）中对类器官进行透化和封闭处理-/- 含10%驴血清）室温孵育2小时。
  3. 制备一抗混合液：对于一个类器官，将一抗 NPHS1（sheep-α-human，1:100 稀释）、CD31（mouse-α-human，1:100 稀释）和 LTL（生物素标记，1:300 稀释）加入 300 µL 封闭液中稀释。将抗体混合液加入类器官中，于 4 °C 孵育 72 小时。
  4. 用含0.3% TritonX的DPBS洗涤3次-/-.
  5. 配制二抗混合液：针对一个类器官，将驴抗羊Alexa Fluor 647（1:500稀释）、驴抗鼠Alexa Fluor 488（1:500稀释）和链霉亲和素Alexa Fluor 405（1:200稀释）加入300 µL封闭液中混合。将二抗混合液加入类器官样本中，室温孵育2–4小时，并用铝箔包裹以避免二抗暴露于光照。
  6. 用DPBS洗涤3次-/-.
  7. 将类器官置于35 mm玻璃底培养皿中约30 µL封片剂内，铝箔覆盖，室温下过夜干燥。4 °C保存。
  8. 使用共聚焦显微镜进行成像。

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结果

hiPSCs 分化为肾类器官、受精鸡胚孵育、肾类器官移植、LCA 注射以及类器官回收的方法与时间线总结于图 1A。必须协调好类器官分化与鸡胚孵育的时间，在开始孵育前 15 天启动分化。时间线下方的图片展示了孵育第 0、3、4 和 12 天的操作。在分化第 7+12 天将类器官移植至孵育第 4 天（HH 23–24 期）的鸡胚中。移植后 8 天，将 LCA 注入胚胎的静脉系统以标记灌注的血管，随后处死胚胎并回收类器官。组装好的注射系统见图 1B。

在孵化第12天处死鸡胚（图1A）。仔细解剖胚胎后，通常可在肝脏上发现移植的类器官。通过解剖显微镜观察，可见其已形成血管化结构（图1A；第12天；步骤5.2.3）。对注射了LCA并针对肾单位结构和人源内皮细胞（ECs）进行染色的移植类器官进行共聚焦成像，结果显示存在灌注的血...

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讨论

本文展示了一种将人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的肾类器官移植到鸡胚体腔内的实验方案。移植后，类器官通过含有类器官来源的人源细胞和鸡源细胞共同构成的灌注性血管网络实现血管化。这些血管遍布整个类器官，并侵入肾小球结构，促使内皮细胞与足细胞之间发生相互作用。先前研究已表明，这一过程可促进类器官中肾小球和肾小管结构的进一步成熟28。该移植方法效率高，每个胚胎操作时间约为5分钟，胚胎仅需在培养过程中定期补充孵育箱中的水槽即可。因此，该方法非常适用于对大量类器官进行分析研究。

通过在小鼠体内移植已证明肾脏类器官的血管化与成熟18,20在这些劳动密集型小鼠模型中，类器官被移植的时间为2周至最长12周。而在本研究所展示的卵黄囊腔内移植实验中，移植持续时间被限制在8天。这使得胚胎可在孵化第13天前被处死，从而避免其进入可能开始感知疼痛的发育阶段。33,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢荷兰莱顿大学医学中心（LUMC）的 George Galaris 在鸡胚注射方面的帮助。我们感谢解剖学系的 Saskia van der Wal-Maas 提供的支持。 & 胚胎学，荷兰莱顿大学医学中心（LUMC）)，Conny van Munsteren（解剖学系 & 胚胎学，荷兰莱顿大学医学中心（LUMC，Leiden，the Netherlands），Manon Zuurmond（LUMC，Leiden，the Netherlands）以及 Annemarie de Graaf（LUMC，Leiden，the Netherlands）。M. Koning 的研究得到“Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC”项目的资助。本工作部分由莱顿大学基金（Leiden University Fund）支持。 "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma 基金" GWF2019-02。本工作由再生医学跨界合作（Regenerative Medicine Crossing Borders，RegMedXB）合作伙伴及荷兰健康荷兰生命科学顶尖领域（Health Holland, Top Sector Life Sciences）资助 & 健康。C.W. van den Berg 和 T.J. Rabelink 获得诺和诺德基金会干细胞医学中心（reNEW）的支持，诺和诺德基金会干细胞医学中心获得诺和诺德基金会资助（NNF21CC0073729）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µm 滤器：Whatman Puradisc 30 注射器滤器 0.2 µmWhatman10462200
35 mm 玻璃底培养皿 MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
校准微毛细管移液器用吸管管组件Sigma-AldrichA5177-5EA包含硅胶管、口件和连接器
共聚焦显微镜：Leica 白光激光共聚焦显微镜 LeicaTCS SP8
解剖镊，简易型。钛制，弯曲，尖端细而锋利Hammacher KarlHAMMHTC091-10
解剖镊，简易型。钛制，直头，尖端细而锋利Hammacher KarlHAMMHTC090-11
解剖显微镜 Wild Heerbrugg355110
解剖剪，弯型，手术专用，超锐利/锐利Hammacher KarlHAMMHSB391-10
驴血清Sigma-AldrichD9663
驴-α-小鼠 Alexa Fluor 488赛默飞世尔科技A-212-02稀释比例 1:500
驴-α-羊 Alexa Fluor 647赛默飞世尔科技A-21448稀释比例 1:500
双刃不锈钢剃须刀片电子显微科学72000
DPBS，不含钙、镁（DPBS-/-）赛默飞世尔科技14040133
不含钙、不含镁的DPBS（DPBS+/+）赛默飞世尔科技14190094
鸡蛋托盘或定制的鸡蛋架 NANA
受精的白来航鸡鸡蛋（Gallus gallus domesticus) Drost Loosdrecht B.V.NA
培养箱Elbanton BVET-3 combi
生物素标记的四棱豆凝集素（LTL）Vector LaboratoriesB-1325稀释比例 1:300
显微剪刀，直型，尖头/尖头，切割长度10 mmHammacher KarlHAMMHSB500-09
微毛细管：薄壁玻璃毛细管，1.5 mm，带丝World Precision InstrumentsTW150F-3
微量移液器拉制仪Sutter Instrument CompanyModel P-97我们使用以下参数设置：加热 533，拉力 60，速度 150，时间 200
微型手术刀架：Castroviejo刀片及针持架，12 cm，圆形手柄，锥形10 mm钳口。EuronexiaL-120
封片剂：Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 赛默飞世尔科技P36930
Olivecrona硬组织解剖镊 18 cm Reda41146-18
Parafilm Heathrow ScientificHS234526B
青霉素-链霉素 5,000 U/mL赛默飞世尔科技15070063
带孔勺子 EuronexiaS-20-P
培养皿 60 × 15 mm CELLSTAR628160
塑料移液管 赛默飞世尔科技PP89SB
纯化小鼠抗人CD31抗体BD 生物科学555444稀释比例 1:100
罗丹明标记的扁豆凝集素（LCA）Vector LaboratoriesRL-1042该产品最近已停产。Vectorlabs 仍生产 Dylight 649 标记的 LCA（DL-1048-1）和荧光素标记的 LCA（FL-1041-5）。
羊抗人NPHS1抗体R&D 系统AF4269稀释比例 1:100
无菌皮下注射针头，19 GBD 微型采血针301500
链霉亲和素 Alexa Fluor 405赛默飞世尔科技S32351稀释比例 1:200
5 mL 注射器BD Emerald307731
透明胶带 Tesa4124大多数五金店有售
Triton XSigma-AldrichT9284
钨丝，直径0.25 mm 赛默飞世尔科技010404.H2

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