本实验方案用于评估动物的运动活动能力 果蝇 通过使用开源软件Fiji，结合插件对高清视频录制的每一帧图像进行像素分割，追踪并分析果蝇在自制实验装置中的运动，以计算速度、距离等参数。
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本文内容
摘要
摘要
Drosophila melanogaster 是研究多种疾病的理想模式生物，因其具备丰富的先进遗传操作技术以及多样的行为特征。在动物模型中识别行为缺陷是评估疾病严重程度的关键指标，例如在神经退行性疾病中，患者常出现运动功能障碍。然而，尽管已有多种系统可用于追踪和评估果蝇模型（如药物处理或转基因个体）的运动缺陷，但仍缺乏一种经济实惠且用户友好的多角度精确评估系统。本文开发了一种基于 AnimalTracker 应用程序编程接口（API）的方法，该方法与 Fiji 图像处理程序兼容，可系统地从录制视频中评估成虫和幼虫个体的运动活动，从而实现对其追踪行为的分析。该方法仅需一台高清摄像机和计算机外设硬件集成即可完成行为记录与分析，是一种经济高效的方法，适用于筛选具有转基因或环境诱导行为缺陷的果蝇模型。文中提供了使用药物处理果蝇进行行为测试的示例，以展示该技术如何以高度可重复的方式检测成虫和幼虫的行为变化。
引言
Drosophila melanogaster 为通过基因修饰构建的神经元疾病模型中研究细胞和分子功能提供了优良的模式生物1药物处理2，以及衰老3人类与模式生物之间在生物通路、物理特性及疾病相关同源基因方面的高度保守性 果蝇 使果蝇成为从分子到行为水平的理想模拟模型4在许多疾病模型中，行为缺陷是一个重要指标，为多种人类神经病变提供了有益的模型。5,6. 果蝇 现已被用于研究多种人类疾病、神经发育以及神经退行性疾病，如帕金森病和肌萎缩侧索硬化症7,8检测疾病模型的运动能力对于理解致病进程至关重要，并可能为疾病过程中潜在的分子机制提供表型关联。
近年来，已开发出多种商业化的软件工具和成本效益较高的程序，用于 Drosophila 运动检测策略，例如对群体果蝇进行高通量测试9,10
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方案
W1118 成虫和三龄幼虫用于本研究。
1. 实验准备
注意：用于跟踪黑腹果蝇（Drosophila）运动的开放场地由无色无味的硅胶制成。
- 按照二氧化硅试剂盒的制造商说明，将试剂A与试剂B以1:10的比例混合（参见 材料表）。搅拌至混合物颜色变为白色，确保碳酸氢钠已加入其中。将混合物转移至洁净的培养皿中，置于40 °C烘箱内干燥48 h。
- 设置高清摄像机（参见 材料表三脚架上放置相机，并调整相机位置，使镜头垂直于硅胶 arena 表面。调节相机的焦距和光圈，确保相机对准硅胶表面并使显示画面获得充分照明。实验装置示意图如图所示 图1.
- 将一只果蝇转移至开放场实验区域，以录制至少61秒的连续视频。
注意：由于幼虫活动迟缓，建议视频录制时间超过10分钟。- 使用 Fiji 打开视频，将进度条拖动至初始帧，并默认确认。使用以下方法选择果蝇的整个身体 "徒手选择" 工具（图2B，C).
- ....
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结果
本研究检测并比较了经鱼藤酮处理的成年果蝇和三龄幼虫与对照组果蝇（饲喂溶剂二甲基亚砜，DMSO）在运动活性方面的运动功能缺陷。已有研究表明，在黑腹果蝇（Drosophila）中使用鱼藤酮处理可导致脑内多巴胺能神经元的丢失22，并引发显著的运动功能障碍23。如图11和图12所示，与饲喂DMSO的对照组果蝇相比，经鱼藤酮处理的成年果蝇和三龄幼虫表现出显著的运动功能缺陷。图11和图12B-E展示了经鱼藤酮处理与未处理果蝇在运动参数（包括移动距离、速度和静止时间）方面的相对变化。图11和图12F-<.......
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讨论
我们设计了一种基于开源材料AnimalTracker的应用程序编程接口（API）的方法，该接口与Fiji图像处理程序兼容，可使研究人员通过追踪成虫及单个幼虫果蝇，系统地评估其运动活动。AnimalTracker是一种用Java编写的工具，可轻松集成到现有数据库或其他工具中，以促进针对特定应用设计的动物追踪行为分析24。通过软件计算公式对视频帧进行逐帧分析，以量化成虫和幼虫的运动活性，可灵活分析多个参数，包括移动速度、移动距离、静止时间以及运动方向改变的角度。这些参数代表了行为运动的不同方面，可通过绘图展示随时间变化的运动特征。此外，通过构建图形用户界面、提供详细的使用文档以及应用程序编程接口，我们旨在使该方法 对缺乏编程经验的研究人员以及需要构建自定义实验范式的资深用户均具有良好的可及性。
为验证该方法能否准确监测行为，已对经鱼藤酮处理的成年果蝇和幼虫进行运动能力测试，并将其运动活性与饲喂药物溶剂的对照组果蝇进行比较。使用Fiji软件及其插件分析视频录像中每一帧的像素坐标，从而计算实验果蝇.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了苏州大学专项启动基金和国家自然科学基金（NSFC）（82171414）的支持。我们感谢刘春凤教授实验室成员的讨论和意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物追踪器 | Hungarian Brain Research Program | 版本：1.7 | 官方网站：http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| 摄像头软件 | Microsoft | 版本：2021.105.10.0 | Windows 10 系统内置 |
| 计算机 | DELL | Vostro-14-5480 | 配备运行 Windows 10 系统的计算机 |
| 果蝇二氧化碳麻醉工作站 | 武汉易宏科技 | #YHDFPCO2-018 | 官方网站：http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji 软件 | Fiji 团队 | 版本：1.53v | 官方网站：https://fiji.sc/ |
| 格式工厂软件 | Pcfreetime | 版本：X64 5.4.5 | 官方网站：http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 版本：8.0.2 | 官方网站：https://www.graphpad-prism.cn |
| 高清摄像头 | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | 官方网站：http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| 办公软件 | Microsoft | 版本：Office 2019 | 官方网站：https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| 培养皿 | Bkman | 110301003 | 尺寸：60 mm |
| 硅胶 | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | 按照说明书充分混合 |
| 碳酸氢钠 | Macklin | #144-55-8 | 与硅胶充分混合 |
参考文献
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M.
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重印与许可
