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方法文章

一种检测运动活性的简易技术 黑腹果蝇

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DOI：

10.3791/65092

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2023年2月24日

 ,  ,  , 
1Institute of Neuroscience, Soochow University, 2Department of Neurology and Clinical Research Center of Neurological Disease, The Second Affiliated Hospital of Soochow University

本文内容

摘要

本实验方案用于评估动物的运动活动能力 果蝇 通过使用开源软件Fiji，结合插件对高清视频录制的每一帧图像进行像素分割，追踪并分析果蝇在自制实验装置中的运动，以计算速度、距离等参数。

摘要

Drosophila melanogaster 是研究多种疾病的理想模式生物，因其具备丰富的先进遗传操作技术以及多样的行为特征。在动物模型中识别行为缺陷是评估疾病严重程度的关键指标，例如在神经退行性疾病中，患者常出现运动功能障碍。然而，尽管已有多种系统可用于追踪和评估果蝇模型（如药物处理或转基因个体）的运动缺陷，但仍缺乏一种经济实惠且用户友好的多角度精确评估系统。本文开发了一种基于 AnimalTracker 应用程序编程接口（API）的方法，该方法与 Fiji 图像处理程序兼容，可系统地从录制视频中评估成虫和幼虫个体的运动活动，从而实现对其追踪行为的分析。该方法仅需一台高清摄像机和计算机外设硬件集成即可完成行为记录与分析，是一种经济高效的方法，适用于筛选具有转基因或环境诱导行为缺陷的果蝇模型。文中提供了使用药物处理果蝇进行行为测试的示例，以展示该技术如何以高度可重复的方式检测成虫和幼虫的行为变化。

引言

Drosophila melanogaster 为通过基因修饰构建的神经元疾病模型中研究细胞和分子功能提供了优良的模式生物1药物处理2，以及衰老3人类与模式生物之间在生物通路、物理特性及疾病相关同源基因方面的高度保守性 果蝇 使果蝇成为从分子到行为水平的理想模拟模型4在许多疾病模型中，行为缺陷是一个重要指标，为多种人类神经病变提供了有益的模型。5,6. 果蝇 现已被用于研究多种人类疾病、神经发育以及神经退行性疾病，如帕金森病和肌萎缩侧索硬化症7,8检测疾病模型的运动能力对于理解致病进程至关重要，并可能为疾病过程中潜在的分子机制提供表型关联。

近年来，已开发出多种商业化的软件工具和成本效益较高的程序，用于 Drosophila 运动检测策略，例如对群体果蝇进行高通量测试9,10，以及实时测量运动行为11,12。其中一种传统方法是快速互动负向趋地性（RING）实验，也称为攀爬实验，该方法包含多个通道，可容纳大量同性别、同龄的果蝇，从而在数据采集过程中减少变异9,13。另一种用于分析运动行为的预测试方法是TriKinetics Drosophila 活动监测仪（DAM），该设备利用多束红外线检测果蝇在细玻璃管内的活动情况14。该设备可连续记录果蝇位置，通过计算穿越光束的次数实现自动化运动监测，用于长期研究果蝇的活动性及昼夜节律15。尽管这些方法已被广泛用于分析果蝇的行为缺陷以确定行为运动的变化，但它们通常需要特殊的测试设备或复杂的分析流程，限制了其在某些仅具备简单装置的模型中的应用。基于动物追踪群体的成年 Drosophila 检测策略，例如FlyGrAM11 和 Drosophila 岛屿实验10，可在预设区域内实现社会性聚集与个体追踪。然而，在限定区域内个体的社会性限制可能导致果蝇在图像中发生碰撞或重叠，从而对个体识别产生负面影响。尽管一些基于开源材料的方法，如TRex16、MARGO12 和FlyPi17 已经出现，能够灵活快速地追踪果蝇行为，但这些检测方法仍涉及复杂的实验装置安装、特定软件需求或专业的计算机语言。对于幼虫而言，测量单位时间内穿越网格边界线的总距离18，或手动粗略计数个体体壁收缩次数19，是评估其运动能力的主要方法。由于设备或仪器在精度以及分析方法上的不足，部分幼虫的行为运动可能无法被检测到，导致难以准确评估其行为运动，尤其是细微运动15。

本研究所建立的方法利用了 AnimalTracker 应用程序编程接口（API），可与 Fiji（ImageJ）图像处理程序兼容，用于通过分析高清（HD）视频中成年果蝇和幼虫果蝇的追踪行为，系统评估其运动活性。Fiji 是一种开源的 ImageJ 软件发行版，能够将强大的软件库与多种脚本语言相结合，从而实现图像处理算法的快速原型开发，因其出色的图像分析能力而在生物学家群体中广受欢迎20在当前方法中，Fiji 软件的集成到 AnimalTracker API 被用于开发一种独特的 果蝇 结合个性化算法插入的行为学检测，并为运动行为的稳健分析能力提供详细的记录和教程支持图1）。为了规避果蝇在图像中因碰撞或重叠而导致的客观识别困难，每个实验区域仅限容纳一只果蝇。在评估了该方法的追踪精度后，已将其用于追踪并量化果蝇的运动行为 黑腹果蝇 给予毒性药物鱼藤酮（rotenone）处理后，该药物通常用于帕金森病的动物模型，最终发现药物处理组出现运动功能障碍21该方法采用开源且免费的软件，无需昂贵的仪器设备，能够精确且可重复地分析 黑腹果蝇 行为运动。

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方案

W1118 成虫和三龄幼虫用于本研究。

1. 实验准备

注意：用于跟踪黑腹果蝇（Drosophila）运动的开放场地由无色无味的硅胶制成。

  1. 按照二氧化硅试剂盒的制造商说明，将试剂A与试剂B以1:10的比例混合（参见 材料表）。搅拌至混合物颜色变为白色，确保碳酸氢钠已加入其中。将混合物转移至洁净的培养皿中，置于40 °C烘箱内干燥48 h。
  2. 设置高清摄像机（参见 材料表三脚架上放置相机，并调整相机位置，使镜头垂直于硅胶 arena 表面。调节相机的焦距和光圈，确保相机对准硅胶表面并使显示画面获得充分照明。实验装置示意图如图所示 图1.
  3. 将一只果蝇转移至开放场实验区域，以录制至少61秒的连续视频。
    注意：由于幼虫活动迟缓，建议视频录制时间超过10分钟。
    1. 使用 Fiji 打开视频，将进度条拖动至初始帧，并默认确认。使用以下方法选择果蝇的整个身体 "徒手选择" 工具（图2B，C).
    2. 点击 图像 > 调节 > 亮度 & 对比 调整白平衡，直至所选区域的灰度值接近大范围背景的灰度值（图2D- F).
      ​注意：对第一帧进行背景均一化处理，可使软件识别无物体时的背景状态，并在果蝇出现时产生对比，从而实现对果蝇的追踪。
  4. 在温度为 25 °C、相对湿度为 60% 的环境中进行整个实验，实验区域应保持安静且避免强光照射。

2. 视频录制与预处理

  1. 使用95%二氧化碳（CO2）进行短暂麻醉后，将果蝇转移至开放场地（open-filed arena），并按下摄像应用程序的录制按钮，开始视频记录。
    注意：为尽量减少麻醉对运动行为的影响，应在开始视频记录前让果蝇恢复10分钟。推荐采用低温冷却方式进行麻醉。
    1. 果蝇从麻醉中恢复后，将盛有果蝇的场地培养皿置于摄像头下方，并迅速左右晃动培养皿，以确保记录开始时果蝇处于运动状态。
  2. 完成录制后，按下停止按钮以结束视频记录。
    注意：应确保视频录制时间比目标追踪时间略长少许。此外，为提高实验效率，可同时对多只果蝇进行自发行为追踪，这取决于摄像头的分辨率是否足以实现高质量的视频裁剪。
  3. 将录制的视频转换为采用MJPEG编码的AVI格式，以便使用Fiji软件打开并进行分析。同时，将视频的帧率（fps）设置为：成年果蝇15 fps，幼虫12 fps。

3. 视频分析

  1. 打开已转换的视频 "使用虚拟堆栈" 和 "转换为灰度图像"，使用 Fiji 打开视频时弹出窗口中的两个选项图2A).
  2. 如上所述，先制作一个空白的第一帧。
  3. 通过使用获得一个处理窗口 "设置活动图像" 工具的 AnimalTracker 插件，并在原始视频窗口中创建一个环绕竞技场的追踪区域 "椭圆形" 工具（图3A).
  4. 设置滤光片（图3A,3）以及两个滤光片的参数（图4A- G) 作为处理窗口中第一个空白帧。然后，在原始视频窗口中选择下一帧，并选择处理窗口中的滤波表面图 5A- C).
    注意：过滤步骤旨在降低图像噪声和/或去除背景，从而在帧图像二值化过程中更易于将前景与背景分离。
  5. 选择过滤处理窗口后，使用处理窗口内覆盖红色轮廓的目标果蝇进行转向操作 "设定阈值" 工具图3A,4, 图 5D-，以及 图6A).
  6. 使用 "设置斑点检测器" 让计算机识别处理窗口中带有红色轮廓的果蝇图3A,5 和 图6B).
  7. 将第901帧设为成年果蝇的结束帧，该数值根据视频的录制时长和帧率（fps）计算得出图3A,6, 图6C).
    注意：以下针对幼虫的实验已持续追踪10分钟，因此将第7200帧设置为最后一帧。
  8. 使用 "显示斑点" 用于在原始视频窗口中显示跟踪矩形的工具（图3A,7 和 图6D，E）。然后开始追踪，在监测完成后导出追踪文件（图3A,8,9 和 图7A，B).

4. 跟踪文件分析

  1. 使用Animal tracker > Tracking analyzer插件加载轨迹和区域文件（图8A）。
  2. 利用区域设置选择所需的索引，并调整参数设置（图8）。根据帧率计算帧间隔时间。
    注意：在此条件下，帧率为15 fps，帧间隔约为0.067 s，此为默认设置（图8D）。
  3. 在Tracking analyzer中完成分析后，使用电子表格软件和GraphPad Prism生成定量分析图表（图9）。

每帧分析

  1. 按帧间隔进行速度分析。若需更详细的研究，可不使用Fiji分析轨迹文件。
    1. 打开轨迹文件，将所有坐标复制到 Microsoft Office Excel 中，并使用空格键拆分单元格。
      注意：例如，一旦文件被分割为 "C" 和 "D" 柱，速度的 果蝇 每帧间隔通过以下公式计算 SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2)，如图所示 "E" 柱图10A）。列中的数据 "E" 表示果蝇在两帧之间移动的像素数量，第一帧不计入。选择所有计算结果，插入折线图以直观展示每帧间隔的果蝇运动速度，折线图上会出现一个峰值图10B).
  2. 计算每个帧间隔的静止时间。文件被分割成 "C" 和 "D" 柱，计算固定状态 果蝇 使用公式按每帧间隔计算 IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1)，如图所示 "E" 柱。图10C).
    注意：与速度分析不同，本实验对第一帧的结果进行了定义。移动距离少于20像素的果蝇被视为静止，并记录为 "0" 在列中 "E".
    1. 选择所有计算结果，插入柱状图，通过柱状图的整体边距直观展示不动时间图10D).
  3. 确保方向角度发生变化。
    注意：方向改变角度分析用于反映果蝇的方向选择。一旦文件被分割为 "C" 和 "D" 柱，方向变化角度通过以下公式计算 ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI()，该内容在视频中展示 "E" 柱图10E计算结果表示三个坐标点之间的夹角。
    1. 选择所有计算结果，插入散点图以展示果蝇运动方向变化的角度（图10F).

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结果

本研究检测并比较了经鱼藤酮处理的成年果蝇和三龄幼虫与对照组果蝇（饲喂溶剂二甲基亚砜，DMSO）在运动活性方面的运动功能缺陷。已有研究表明，在黑腹果蝇（Drosophila）中使用鱼藤酮处理可导致脑内多巴胺能神经元的丢失22，并引发显著的运动功能障碍23。如图11和图12所示，与饲喂DMSO的对照组果蝇相比，经鱼藤酮处理的成年果蝇和三龄幼虫表现出显著的运动功能缺陷。图11和图12B-E展示了经鱼藤酮处理与未处理果蝇在运动参数（包括移动距离、速度和静止时间）方面的相对变化。图11和图12F-<...

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讨论

我们设计了一种基于开源材料AnimalTracker的应用程序编程接口（API）的方法，该接口与Fiji图像处理程序兼容，可使研究人员通过追踪成虫及单个幼虫果蝇，系统地评估其运动活动。AnimalTracker是一种用Java编写的工具，可轻松集成到现有数据库或其他工具中，以促进针对特定应用设计的动物追踪行为分析24。通过软件计算公式对视频帧进行逐帧分析，以量化成虫和幼虫的运动活性，可灵活分析多个参数，包括移动速度、移动距离、静止时间以及运动方向改变的角度。这些参数代表了行为运动的不同方面，可通过绘图展示随时间变化的运动特征。此外，通过构建图形用户界面、提供详细的使用文档以及应用程序编程接口，我们旨在使该方法 对缺乏编程经验的研究人员以及需要构建自定义实验范式的资深用户均具有良好的可及性。

为验证该方法能否准确监测行为，已对经鱼藤酮处理的成年果蝇和幼虫进行运动能力测试，并将其运动活性与饲喂药物溶剂的对照组果蝇进行比较。使用Fiji软件及其插件分析视频录像中每一帧的像素坐标，从而计算实验果蝇...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了苏州大学专项启动基金和国家自然科学基金（NSFC）（82171414）的支持。我们感谢刘春凤教授实验室成员的讨论和意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物追踪器Hungarian Brain Research Program版本：1.7官方网站：http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
摄像头软件Microsoft版本：2021.105.10.0Windows 10 系统内置
计算机DELLVostro-14-5480配备运行 Windows 10 系统的计算机
果蝇二氧化碳麻醉工作站武汉易宏科技#YHDFPCO2-018官方网站：http://www.yhkjwh.com/
Fiji 软件Fiji 团队版本：1.53v官方网站：https://fiji.sc/
格式工厂软件Pcfreetime版本：X64 5.4.5官方网站：http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
GraphPad PrismGraphPad Software版本：8.0.2官方网站：https://www.graphpad-prism.cn
高清摄像头TTQJingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)官方网站：http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
办公软件Microsoft版本：Office 2019官方网站：https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
培养皿Bkman110301003尺寸：60 mm
硅胶DOWSYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit按照说明书充分混合
碳酸氢钠Macklin#144-55-8与硅胶充分混合

参考文献

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