一种用于人类治疗的无异种来源创新方法分离与培养人脂肪源性干细胞

摘要

异源性（化学或动物来源）产品在细胞治疗制备/操作步骤中的引入，与宿主患者免疫反应性增加及病原体传播风险升高相关。本文介绍一种完全无异源成分的细胞分离与 体外 描述了人脂肪源性干细胞的扩增。

摘要

考虑到干细胞治疗的影响日益增加，由于在治疗过程中引入动物源性产品可能带来的污染或感染传播风险，人们对其生物安全性提出了担忧 体外 操作过程中，细胞分离和扩增步骤中常用的异种成分，如胶原酶或胎牛血清，可能与受体患者发生免疫反应或病毒、细菌及朊病毒感染的风险相关。依据药品生产质量管理规范指南，应避免使用化学方法解离组织，同时可用无异种成分的补充物替代胎牛血清（FBS）。此外，为确保细胞产品的安全性，建立更可靠且可重复的方法至关重要。我们已开发出一种创新的、完全无异种成分的细胞分离和 体外 在不改变细胞特性的前提下扩增人脂肪源性干细胞，且与使用胶原酶和胎牛血清的常规培养方案相比具有可比性。本实验中，人脂肪源性干细胞（hASCs）自腹部脂肪组织中分离获得。组织样本经剪刀或手术刀进行机械切割，随后在10 cm培养皿中进行显微解剖和机械分散，并通过手术刀切开组织以促进组织碎片的贴附及hASCs的迁移。经过洗涤步骤后，利用细胞对塑料培养表面的黏附特性进行hASCs的筛选，过程中未使用酶消化法。分离获得的hASCs采用添加5%无肝素人血小板裂解液的培养基进行培养，并使用无动物源性胰蛋白酶替代物进行细胞消化传代。根据细胞治疗产品生产相关的良好生产规范（GMP）要求，所有培养体系中均未添加抗生素。 关键词：人脂肪源性干细胞，机械分离，无酶消化，人血小板裂解液，无动物源性培养，良好生产规范

引言

近几十年来，人们对创新性治疗手段的需求不断增长，推动了转化医学领域的大量投入和资源投入¹。基于细胞的产品存在多种风险，这些风险由细胞来源、生产工艺（分离、扩增或基因修饰）以及非细胞成分添加剂（酶、生长因子、培养补充物和抗生素）决定，且这些风险因素取决于具体的治疗适应症。上述因素可能对最终产品的质量、安全性和有效性产生深远影响²。干细胞治疗必须遵循生物安全原则；在细胞培养中使用动物源性产品可能导致病原体传播的潜在风险，因此对生产过程中引入的任何产品进行彻底检测至关重要³。

分离人脂肪来源干细胞（hASCs）的传统方法包括使用胶原酶进行酶消化，随后通过离心洗涤⁴。尽管在细胞得率和活力方面，酶法分离通常被认为比其他机械方法更高效，但美国食品药品监督管理局（FDA）认为所使用的动物来源成分（如胶原酶）属于超过最低限度操作的物质。这意味着存在较高的免疫反应或疾病传播风险，从而限制了hASC治疗向临床应用的转化^5,6。

基于胰蛋白酶的消化是分离ASCs的另一种酶解方法。已有不同技术被描述，在胰蛋白酶浓度、离心速度和孵育时间方面略有差异。遗憾的是，该方法的描述尚不充分，文献中缺乏与其他方法的比较，尤其是与机械分离方法的比较⁷。然而，从方法的可转化性角度来看，胰蛋白酶具有与胶原酶相同的缺点。

基于机械力且无需添加酶的脂肪源性基质细胞（ASCs）替代分离方法，涉及对脂肪组织碎片进行高速离心（800 × g 或 1,280 × g，15 分钟）。随后，将沉淀物用红细胞裂解缓冲液孵育（5 分钟），再经600 × g 离心一次，最后重悬于培养基中。尽管在最初几天获得的细胞数量较组织块法更多，但先前的研究显示，培养超过第二周后其增殖能力较低甚至完全缺失⁸。

此外，使用异种来源的培养基添加剂（如胎牛血清（FBS））也存在风险，FBS 在细胞培养中常作为生长因子补充物，但其使用与宿主患者发生免疫反应以及暴露于病毒、细菌或朊病毒感染的风险增加相关^9,10。已有报道显示，接受多剂量FBS培养的间充质干细胞治疗的个体中出现免疫反应及荨麻疹样皮疹¹¹。此外，FBS 存在批间差异，可能影响最终产品的质量¹²。

根据药品生产质量管理规范（GMP）指南，应避免使用酶法进行组织解离，并需用无异源性成分的补充剂替代胎牛血清（FBS）。这些措施，连同更可靠且可重复的实验方案，对于支持细胞治疗的应用至关重要^3,13。

在此背景下，人血小板裂解物（hPL）已被提议作为胎牛血清（FBS）的替代物，因其是一种无细胞、含蛋白质且富含生长因子的补充剂，并已较早作为生长培养基添加剂引入临床级细胞产品的生产中 体外 细胞培养与扩增^14,15由于人血小板裂解物（hPL）是一种人源性产品，常被用作胎牛血清（FBS）的替代物 体外 用于临床应用的hASCs培养，从而减少与FBS可转化性相关的免疫反应和感染问题^15,16.

尽管生产成本较高，但已有研究表明，与胎牛血清（FBS）相比，人血小板裂解物（hPL）能够支持多种细胞类型的细胞活力，促进细胞增殖，延缓细胞衰老，维持基因组稳定性，并在晚期细胞传代中仍保持细胞的免疫表型；上述各项因素均支持向这种培养补充剂的转换¹¹。

本研究的目的是建立一种标准化的方案，采用完全无动物成分的方法分离和培养人脂肪源性间充质干细胞（hASCs），并在细胞生理状态和干性特性方面与传统的胎牛血清（FBS）培养的hASCs保持一致（图1）。

方案

人脂肪来源的间充质干细胞（hASCs）取自一位在瑞士洛桑洛桑大学医院（CHUV）接受腹部自体皮瓣（腹壁下动脉穿支皮瓣，[DIEP]）乳房重建手术的健康女性。在患者签署知情同意书后，获取了手术中废弃的皮瓣及脂肪组织。所有实验方案均经医院生物样本库部门DAL（编号314 GGC）以及伦理委员会审核批准，符合《赫尔辛基宣言》的规定。

注意：所有步骤必须在层流罩内并在无菌条件下进行。应始终佩戴手套和实验服以进行个人防护，所有表面均需用适当的生物杀菌剂清洗。多余的组织应作为生物医学废物妥善处理。

1. 所需材料及培养液的制备

1. 进行细胞分离、扩增和冻存时，需准备以下仪器：无菌剪刀；无菌手术刀；无菌镊子；10 cm 培养皿；15 mL 离心管；T25 培养瓶；血细胞计数板；冻存管；细胞冻存盒；配备 4x 和 10x 放大倍数物镜的光学显微镜；以及水平转子离心机。
2. 进行免疫表型分析时，需准备以下仪器和试剂：FACS 管、无菌磷酸盐缓冲液（PBS）；杜氏必需培养基（DMEM）；hPL；二甲基亚砜；以及无动物成分的胰蛋白酶。
3. 通过在 DMEM 中添加 5% 无肝素 hPL 配制完全培养基。将培养基在 4 °C 下保存，最长可保存 3 周，并始终使用预温的培养基（室温至 37 °C 之间）。根据用于人体治疗的细胞药物生产的 GMP 指南，培养基中不得添加任何抗生素。
4. 在 DMEM 中配制含 20% hPL 和 10% 二甲基亚砜的冻存液。

2. 从脂肪组织样本中分离人脂肪源性间充质干细胞（hASCs）

1. 在获取脂肪组织样本后6小时内进行处理。在进行既定的无异种来源机械分离方法之前，用PBS清洗组织2次，每次10分钟，直至去除结缔组织和血液。
2. 将来自腹壁成形术的脂肪组织样本置于PBS中，4°C保存直至处理，且无论如何不得超过24小时，以避免影响hASC的活力。
3. 使用无菌剪刀将脂肪组织切成约1 cm²的小块。
4. 用手术刀将每一块组织精细解剖为直径<5 mm的小碎片，并将其中五块分散置于一个10 cm的培养皿中（图2A）。
5. 为固定每个组织碎片，可用手术刀在塑料表面制造切口，然后拖动碎片使其牢固附着于培养皿底部。可使用镊子辅助操作（图2B）。
6. 轻柔加入10 mL完全培养基，覆盖所有组织碎片，注意避免使其脱落。
7. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。hASC将从组织中迁移出来，并因其对塑料表面的贴壁特性而被自然筛选，无需酶消化。
8. 在细胞达到融合前，每天在光学显微镜下以4倍放大倍数观察hASC的增殖情况。当hASC开始从组织中迁移出来时，表现为围绕组织块的小细胞簇，具有典型的成纤维细胞样形态。hASC因其能够贴附于塑料表面而被筛选出来。每72小时尽可能移除旧培养基，并更换新鲜完全培养基，以清除细胞碎片。
9. 保留组织碎片在原位，直至细胞首次传代，通常在7天后进行。

3. 分离阶段后的hASC培养

1. 当hASC培养达到70%-80%融合度时，hASC已准备好进行消化，并可进一步扩增用于其他实验或长期保存。
2. 使用无菌镊子从培养皿中移除并丢弃所有组织碎片。移除并丢弃耗尽的培养基，注意不要触碰hASC，以免使其脱落。
3. 用10 mL PBS轻柔地清洗细胞一次。加入1 mL 1x无动物成分胰蛋白酶，将培养皿置于37 °C培养箱中孵育5分钟。
4. 在光学显微镜下以4倍放大倍数检查细胞是否已全部脱落；若未完全脱落，则将培养皿在培养箱中再孵育2分钟，并可轻轻敲击塑料表面以促进细胞脱落。
5. 加入2 mL完全培养基以终止胰蛋白酶作用，并将所有细胞收集至15 mL离心管中。
6. 为彻底去除残留的胰蛋白酶，将离心管在300 x g 条件下离心5分钟。弃去上清液，用5 mL完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至新的T25培养瓶中。继续培养hASC，并根据需要进行扩增。

4. 通过流式细胞术进行免疫表型分析

1. 当hASC培养达到70%-80%融合度时，按照第3节所述方法将hASCs消化下来。
2. 收集细胞后，将其重悬于1 mL完全培养基中，并在光学显微镜10倍物镜下用细胞计数仪对部分细胞进行计数。
3. 以300 × g 离心5分钟，将hASCs重悬于FACS缓冲液中，浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL。取含1 × 10⁵ 个细胞的100 µL悬液加入一个FACS管中。每种待检测抗原使用一个FACS管，另为每种同型对照各设一管。
4. 加入以下用FACS缓冲液稀释的抗体各100 µL对细胞进行染色：抗CD73抗体（1:1,000，IgG1，FITC标记）、抗CD105抗体（1:200，IgG1，PE标记）、抗CD34抗体（1:66，IgG1，FITC标记）、抗CD45抗体（1:66，IgG1，FITC标记）；以及针对每种荧光染料的同型对照抗体，分别为IgG1 FITC标记（1:1,000）和IgG1 PE标记（1:50）。
5. 将样品在4 °C避光、振荡条件下孵育1小时。以300 × g 离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于500 µL FACS缓冲液中。
6. 使用流式细胞仪分析细胞免疫表型，对每个FACS管在设定的门控范围内记录50,000个事件，排除细胞碎片。以特异性同型对照为基准，计算阳性表达细胞的百分比。

5. hASC 增殖实验

1. 当hASC培养达到70%-80%融合度时，按照第3节所述方法解离hASCs。
2. 收集细胞后，将其重悬于1 mL完全培养基中，并在光学显微镜下以10倍放大倍数使用细胞计数仪对等分试样进行计数。
3. 在96孔透明培养板中，每孔加入200 µL完全培养基，接种5 × 10²个hASCs。每个时间点设技术重复孔，每孔对应一个时间点。
4. 接种后第3天开始，按照增殖检测试剂盒的说明书检测细胞增殖情况。简要步骤如下：每孔加入含20 µL检测试剂的新鲜培养基100 µL，替换原有培养基。将hASCs在37 °C、5% CO₂条件下孵育2.5小时以使试剂充分反应，随后使用分光光度计在490 nm波长处检测吸光度。
5. 以扣除空白对照吸光度后的吸光度值表示hASC增殖水平。

6. hASCs 的冷冻保存与储存

1. 按照第3节所述方法消化细胞，并使用细胞计数仪在光学显微镜下以10倍放大倍数对部分细胞进行计数。
2. 将细胞在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。用冻存液重悬细胞，调整密度为1 × 10⁶ hASCs/mL，将1 mL细胞悬液转移至一支冻存管中。
3. 将冻存管放入−80 °C冷冻容器中，使温度以1 °C/min的速率下降，随后将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

结果

采用上述分离方法，成功从腹部脂肪组织样本中获取了无需使用胶原酶的hASCs。此外，hASCs在完全无异源成分的条件下扩增，培养过程中添加了hPL，且不含任何其他动物来源成分。以下结果支持本方案的有效性，数据来源于在hPL条件下培养的hASCs以及以FBS作为对照条件平行培养的hASCs。

初次出现细胞簇后，hASCs 呈现出典型的纺锤形形态，与含 FBS 的对照组细胞相比，细胞体积更小且更为细长（图3）。通过流式细胞术评估的细胞免疫表型显示，两种添加物培养的 hASCs 之间表型相似。具体而言，超过 80%-90% 的 hASCs 对 CD73¹⁷ 和 CD105¹⁷ 呈阳性，而表达 CD34¹⁷ 和 CD45¹⁷ 的细胞比例低于 5%（图4）。最后，增殖实验表明，与含 FB...

讨论

脂肪来源的干细胞因其来源丰富、分离方法快速且经济、增殖能力高，在过去十年中引起了转化研究的广泛关注 体外/体内 增殖速率，以及干性/分化特性^18,19,20因此，hASCs 被认为是再生医学中细胞治疗策略的理想候选细胞²¹从脂肪组织分离后，hASCs 需要扩增 体外 在某些情况下，在用于特定治疗应用之前，应进行分化步骤。整个过程包括分离、扩增 体外 扩增以及最终的分化过程必须依照GMP指南进行，以从转化角度降低任何潜在风险^22,23.

关于分离过程，尽管酶消化和离心步骤可在相对较短的时间内快速获得大量人脂肪源性间充质干细胞（hASCs），但既往研究报道，与机械分离...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	euroclone	et5015b
抗-CD105 抗体	BD Biosciences	BD560839
抗-CD34 抗体	BD Biosciences	BD555821
抗-CD45 抗体	BD Biosciences	BD555482
抗-CD73 抗体	BD Biosciences	BD561254
autoMACS 冲洗液（FACS 缓冲液）	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 仪器（流式细胞仪）	BD accuri	-
血细胞计数板	Blaubrand	717810
细胞冻存盒	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒	Promega	G3582
CoolCell 冻存容器	Corning	CLS432002
冻存管	clearline	390701
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	D2650-100mL
一次性刀片手术刀	paragon	bs 2982
杜尔贝科改良伊格尔培养基-高糖	GIBCO	11965092
人血小板裂解物 FD（GMP 级）	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 分光光度计	Tecan	-
配备 4x 和 10x 放大物镜的光学显微镜	Olympus	CKX41
10 cm 培养皿	Greiner bio-one	664160
无菌手术刀	Reda	07104-00
无菌剪刀	Bochem	4071
无菌镊子	Bochem	1152
摆动桶式离心机	Sigma	3-16K
T25 培养瓶	Greiner bio-one	6910170
TrypLe（无动物源胰蛋白酶替代物）	GIBCO	12604-013