使用64铜作为示踪剂的正电子发射断层扫描在铜相关疾病研究中的应用

摘要

本方案描述了如何在人体中进行⁶⁴Cu PET/CT 和 PET/MRI 成像，以研究铜相关疾病（如威尔逊病）以及治疗对铜代谢的影响。

摘要

铜是一种必需的微量元素，在生物系统中参与催化和信号传导过程。放射性标记铜已使用数十年，用于研究人类和动物的基本铜代谢以及与铜相关的疾病，例如威尔逊病（WD）和门克斯病。该研究工具的最新补充是64-铜（⁶⁴铜（Cu）正电子发射断层扫描（PET），结合现代计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）设备的精确解剖成像与生物分布信息 ⁶⁴铜 PET 示踪剂信号。这使得 体内 铜通量与动力学的追踪，从而直接可视化人体和动物体内铜的器官间转运及代谢过程。因此， ⁶⁴Cu PET 非常适用于评估临床和临床前治疗效果，并已展现出准确诊断威尔逊病（WD）的能力。此外， ⁶⁴铜 PET/CT 研究在癌症和中风研究等其他科学领域已证明具有重要价值。本文介绍了如何开展 ⁶⁴人类中的铜 PET/CT 或 PET/MR。操作步骤 ⁶⁴铜的处理、患者准备和扫描仪设置在此进行演示。

引言

铜是一种重要的催化辅因子，可驱动多种对生命至关重要的生化过程，而铜稳态的缺陷直接导致人类疾病。编码铜转运ATP酶的ATP7A或ATP7B基因发生突变，分别引起门克斯病和威尔逊病。门克斯病（ATP7A）是一种罕见的致死性疾病，表现为肠道铜过度蓄积，外周组织严重缺铜，并伴有铜依赖性酶的功能缺陷¹。威尔逊病（WD）（ATP7B）是一种罕见疾病，其特征是无法将过量的铜排泄至胆汁，导致铜在体内蓄积并继发器官损伤，最严重地影响肝脏和大脑²。

铜代谢研究已采用放射性标记铜（通常为64-铜[⁶⁴铜]或67-铜）已有数十年历史，这些研究对于我们理解哺乳动物铜代谢（包括吸收部位和排泄途径）具有重要价值^3,4,5,6过去，γ计数器被用于检测放射性信号，但其解剖分辨率有限，而近年来， ⁶⁴铜正电子发射断层扫描（PET）结合计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）已应用于人类及动物研究。目前，PET扫描仪具有极高的灵敏度，能够实现对 ⁶⁴Cu 注射后最长可达 70 小时。其半衰期长达 12.7 小时， ⁶⁴铜可用于长期评估铜的转运情况。这种分辨率的提升刚刚进入铜研究领域，有关正常和病理状态下的铜代谢研究，以及评估特定治疗影响的研究正陆续出现。此外，具有扩展视野的全身影PET扫描仪的引入将进一步提高这些检查的灵敏度。

本方法学论文旨在使临床医生和科研人员能够将⁶⁴Cu PET CT/MRI作为一种可靠且易于使用的方法，纳入现有技术体系，用于在不同核医学科室之间可比地评估铜代谢。 ⁶⁴Cu的制备可通过多种方法实现，通常在专门设施中进行。在各种核反应途径中，⁶⁴Ni(p,n)⁶⁴Cu方法被广泛采用，因为该方法使用低能量质子即可获得较高的⁶⁴Cu产率^7,8。有关制备方法的详细描述不在本研究范围之内，且其可获得性因国家和地区而异。

本文首先介绍必要的放射化学试剂和示踪剂的制备方法，然后阐述正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）或正电子发射断层扫描/磁共振成像（PET/MRI）扫描仪的准备工作原理。

方案

已有多项使用该⁶⁴Cu PET/CT 或 PET/MRI 方案的临床试验获得丹麦中日德兰大区区域伦理委员会批准 [1-10-72-196-16（EudraCT 2016-001975-59）、1-10-72-41-19（EudraCT 2019-000905-57）、1-10-72-343-20（EudraCT 2020-005832-31）、1-10-72-25-21（EudraCT 2021-000102-25）和 1-10-72-15-22（EudraCT 2021-005464-21）]。所有参与者在入组时均已签署书面知情同意书。所有参与者的纳入标准为年龄  >18 岁，女性需采取可靠的避孕措施。肝豆状核变性（Wilson病）患者的排除标准包括失代偿性肝硬化、终末期肝病模型（MELD）评分 >11 或改良Nazer评分 >6。所有参与者的排除标准包括已知对⁶⁴Cu或示踪剂配方中其他成分过敏、妊娠、哺乳期，或在试验结束前有怀孕意愿。

1.  ⁶⁴CuCl₂的制备

1. 将固体⁶⁴CuCl₂溶解于盐酸（0.1 M）中，并加入醋酸钠缓冲液（0.5 M）使pH升至约5。用生理盐水配制溶液，并通过0.22 µm滤膜过滤除菌（参见材料表）。
   注：醋酸钠缓冲液（0.5 M）由三水合醋酸钠与经0.22 µm除菌滤膜过滤的无菌水配制而成。
2. 对制备的⁶⁴CuCl₂溶液进行质量控制，包括pH测定、细菌内毒素检测、放射化学纯度测定以及放射性核素鉴定^7,8。
3. 将产品置于铅容器中，室温保存，并在所有质量控制指标合格前保持隔离状态。
   注：本研究中所用的⁶⁴CuCl₂放射性核素纯度≥99%，放射化学纯度≥95%。作为起始原料的固体⁶⁴CuCl₂购自商业来源（参见材料表）。

2. PET 扫描仪的准备

1. 按照制造商的方案（参见材料表）对扫描仪进行质量检查（QC）⁹。
   注意：每天早晨在进行患者扫描前必须完成质量检查。

3. 静脉注射（IV）和口服（PO）给药示踪剂的抽取

1. 佩戴塑料手套，打开铅容器的盖子。
2. 使用长镊子夹取消毒棉签，对铅容器内含有示踪剂的玻璃瓶上的橡胶膜进行消毒。
3. 用镊子将短导管（约 0.5 mm × 16 mm）插入橡胶膜中，以防止瓶内负压导致液体外溢。
4. 用镊子插入较长的导管用于抽取液体。该导管应足够长以触及瓶底（通常为 50 mm）。
5. 确保活度计（见材料表）已针对 ⁶⁴Cu 进行校准。计算首次抽取的大致体积。
   注意：根据化学质量控制报告，可获得液体的活度和体积信息，从而计算出大致的抽取体积。
6. 佩戴塑料手套，将合适尺寸的塑料注射器插入长导管中，并抽取计算出的体积。该体积取决于产品中 ⁶⁴Cu 的浓度以及实验方案所确定的 ⁶⁴Cu 使用量（参见代表性结果部分中的剂量计算）。
7. 用镊子夹住导管，同时将注射器转移至活度计中测量放射性活度。
8. 持续抽取直至达到所需的放射性活度。注射后，约有 5% 的示踪剂会残留在注射器和导管中。
   注意：⁶⁴Cu 不应使用生理盐水稀释，因为示踪剂可能发生沉淀。因此，注射后不能用生理盐水冲洗注射器（此点不适用于口服给药）。
9. 用镊子将带帽导管（约 16 mm 导管）安装到注射器上，密封注射器，并将其存放于铅容器中，直至使用。

4. 示踪剂的应用

1. 静脉注射
   1. 插入静脉留置针（约22 G，25 mm），优先选择肘静脉，并用生理盐水冲洗以确认位置正确。
      注意：应准备一份工作表，包含受试者姓名、示踪剂质量控制放行的盖章或签名，以及取样、注射和剩余示踪剂的时间点与放射性活度记录。
   2. 使用现有的剂量校准仪测量注射器中的放射性活度，并在工作表上记录时间和活度。
   3. 将注射器置于铅容器中，运送至受试者床旁。
   4. 若注射时发生溢出，应在受试者肘部下方放置吸水纸巾，以便测量溢出的放射性物质。
   5. 使用镊子取下注射器的针帽/留置针护帽，戴塑料手套将注射器连接至静脉通路。在工作表上记录时间，并以稳定动作一次性完成注射。
      注意：如前所述，不应使用生理盐水冲洗注射器，因为示踪剂可能发生沉淀。
   6. 从静脉通路取下注射器，重新戴上针帽/护帽，必要时连同纸巾一起放回铅容器中。
   7. 用生理盐水冲洗静脉通路。
   8. 在工作表上记录注射后的时间及注射器内剩余的放射性活度。
      注意：实际注射的放射性活度通过注射前后注射器内活度之差计算，但需根据PET扫描协议校正衰变。因此，在对受试者进行扫描时（见步骤5），需将三个时间点（取样、注射、剩余测量）以及取样和剩余测量时的放射性活度值输入PET扫描协议中。
   9. 根据机构安全规定，妥善处理剩余材料。
   10. 移除静脉通路。若出现任何过敏反应，应保留静脉通路30分钟。
2. 口服给药
   注意：应准备一份工作表，包含受试者姓名、示踪剂质量控制放行的盖章或签名，以及取样、给药和剩余示踪剂的时间点与放射性活度记录。
   1. 在一次性软质塑料杯中倒入约100 mL水或果汁；⁶⁴Cu无味。应备有一次性塑料吸管和一个小的一次性塑料袋。
   2. 使用现有的剂量校准仪测量注射器中的放射性活度，并在工作表上记录时间和活度。
   3. 将注射器置于铅容器中，运送至受试者床旁。受试者应坐在病床或椅子上。
   4. 使用镊子取下注射器的针帽/护帽，戴塑料手套将示踪剂注入杯中，注意避免溢出。吸取少量液体后再次注入杯中，以确保完全转移。
   5. 将塑料吸管放入杯中（以减少受试者饮用时溢出的风险）。
   6. 在工作表上记录时间，让受试者饮用，尽量将杯中液体喝尽。
   7. 将空杯和吸管与空注射器一起放入一次性塑料袋中，再置入铅容器内。
   8. 记录时间并测量注射器内剩余的放射性活度，在工作表上注明。
      注意：实际给药的放射性活度通过注射前后注射器内活度之差计算，但需根据PET扫描协议校正衰变。因此，在对受试者进行扫描时（见“扫描”部分），需将三个时间点（取样、给药、剩余测量）以及取样和剩余测量时的放射性活度值输入PET扫描协议中。
   9. 根据机构安全规定，妥善处理剩余材料。
      注意：建议在受试者服药后观察30分钟，以监测是否出现急性过敏反应。

5. 正电子发射断层扫描（PET扫描）

1. 将受试者以仰卧位放置于扫描仪中。
2. 进行CT或MR概览扫描，以规划PET扫描期间需检查的特定区域。
3. 在PET扫描方案中记录采血时间、注射时间、残余放射性测量时间，以及采血和残余测量时的放射性活度。
4. 按照以下步骤进行PET扫描。
   注意：在同一项研究中，所有受试者的PET扫描方案必须在扫描持续时间和图像重建参数方面保持标准化；应遵循已发表的报告^10,11,12。
   1. 在示踪剂注射后24小时内，以每个床位位置4.5分钟的扫描时间进行静态PET扫描；在示踪剂注射后68小时内，以每个床位位置10分钟的扫描时间进行静态PET扫描（详见代表性结果部分中的“扫描”说明）。
      注意：在动态PET扫描过程中，衰变信号被持续记录，随后被分割为帧结构。这允许选择短时间间隔的帧以突出⁶⁴Cu分布的动力学特征，或选择较长时间间隔的帧以提高灵敏度。通常在注射后立即采用较短的时间间隔，并随时间逐渐延长¹⁰。

6. 图像重建

1. 使用最佳的衰减、散射、飞行时间及点扩散函数校正方法重建图像。
   注意：必须仔细选择图像重建参数，以优化图像特性，如信号恢复能力和信噪比。对于多中心研究，各中心之间图像质量的标准化至关重要。

7. 数据分析

注意：本研究描述了一种定量肝脏中⁶⁴Cu含量的简单方法。PET信号以标准摄取值（SUV）表示，即根据受试者体重、注射活性和/或每毫升组织千贝可（kBq/mL）校正后的组织放射性浓度。

1. 将数据下载到合适的程序中，例如，将Dicom文件导入PMOD。
   注意：可能有多种不同的程序可用于分析PET图像，例如Hermes或PMOD（参见材料表）。
2. 调整CT/MR扫描的灰度以区分解剖结构。
3. 确保解剖扫描图像与PET扫描图像相互重叠。
4. 在MRI或CT扫描图像最清晰的横断面上，定位肝脏及主要结构。
5. 在肝脏内放置适当大小的感兴趣体积（VOI）或多个VOI。
   注意：VOI是指用于测量标准摄取值（SUV）的特定组织区域。一个VOI由多个感兴趣区域（ROI）组成，每个ROI代表一个层面中的组织区域。许多软件预设了球形VOI，因此无需逐层绘制多个ROI即可构成一个VOI。右肝叶通常更为均质，是放置VOI的理想位置。
6. 在右肝叶的不同横断面上放置多个VOI，以获得最精确的活性测量值，因为右肝叶内的SUV可能存在一定程度的差异（约5%）。计算这些VOI的平均SUV值。
7. 如需定量整个肝脏的SUV值，可在每个层面绘制覆盖整个肝脏体积的ROI，用于剂量测定研究。
   注意：使用此方法时应避开大血管结构，如动脉和静脉。

结果

剂量计算
根据剂量测定计算，示踪剂静脉注射的有效辐射剂量为 62 ± 5 µSv/MBq¹⁰。因此，可根据检查时间范围推荐使用 50 MBq 的剂量。对于较长时间的检查，可使用高达 75–80 MBq 的剂量，在不超出伦理批准限值的前提下获得高质量图像。由于示踪剂在肠道内蓄积，口服给药的有效剂量为 113 ± 1 µSv/MBq。因此需考虑较低的给药剂量，注射后 24 小时内，30 MBq 即可获得高质量图像。对有生育能力的女性受试者，每次使用示踪剂前均应确认其妊娠试验结果为阴性。

扫描
对于持续数小时甚至数天、用于追踪⁶⁴Cu在体内分布与动力学的长时间检查，正电子发射断层扫描（PET）需分为多次独立的静态PET扫描进行。这样可使患者在每次扫描之间得到休息。每次PET扫描的持续时间需根据情况调整，以获得最佳图像质量（即随着注射示踪剂的衰变，逐渐延长扫描时间）。例如，在示踪剂注射后20小时内，每个床位位置扫描4.5分钟；在注射后68...

讨论

该方法与其他PET方法类似，但12.7小时的较长半衰期为研究长期铜代谢通量提供了机会（我们在静脉注射示踪剂后长达68小时的时间点仍获得了良好的结果）。尽管本方案中的各个步骤并不比其他PET检查更具挑战性，但所有操作必须由熟悉PET技术的人员完成。

故障排除
由于我们经常使用 ⁶⁴Cu 进行长期研究，PET 信号将比通常情况更嘈杂。在对 PET 信号进行定量分析时，尤其是对于胆囊等较小器官，这一点尤为重要。胆囊中的信号将难以与来自肝脏和结肠的溢出信号区分开来。在这种情况下，选择器官中心区域较小的感兴趣体积（VOI）最为可靠。

根据我们的经验，尽管采用静脉注射方式，肝脏中的⁶⁴Cu含量在个体之间仍往往存在差异（若使用口服示踪剂，则必须预期肠道对示踪剂摄取存在较大的个体间差异）。这限制了个体间的直接比较，因此需要使用比值而非绝对数值进行分析。如果选择口服途径给予示踪剂，建议在示踪剂摄入前至少24小时让受试者保持标准化饮食，以减少个体内差异，因为...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 微米除菌滤器	Merck Life Science
21 G 50 mm 套管针	BD Microlance	301155
25 G 16 mm 套管针	BD Microlance	300600
剂量校准仪	Capintec CRC-PC 校准仪
PET/CT 扫描仪	西门子：Biograph
PET/MR 扫描仪	GE Signa
PMOD 4.0 版本	PMOD Technologies LLC
0.9% 氯化钠生理盐水溶液	Fresenius Kabi
三水合乙酸钠 BioUltra	Sigma Aldrich	71188
固体 64CuCl2	丹麦技术大学 Risø
无菌水	Fresenius Kabi
22 G 25 mm 静脉留置针	BD Venflon Pro Safety	393280