利用银纳米颗粒改善小鼠骨关节炎

摘要

本文介绍了一种利用银纳米颗粒有效缓解II型胶原酶诱导的骨关节炎小鼠急性症状的实验方案，包括滑膜炎症、滑膜增生、血管增生等。

摘要

膝骨关节炎（KOA）是45岁以上人群中最常见的关节退行性疾病之一。目前尚无针对KOA的有效治疗手段，最终治疗方案仅为全膝关节置换术（TKA）；因此，KOA带来了沉重的经济负担和社会成本。免疫炎症反应参与了KOA的发生与发展过程。我们先前利用II型胶原建立了KOA小鼠模型，该模型中存在滑膜组织增生，并伴有大量炎性细胞浸润。银纳米颗粒具有显著的抗炎作用，已被广泛应用于肿瘤治疗和外科药物递送。因此，我们评估了银纳米颗粒在胶原酶II诱导的KOA模型中的治疗效果。实验结果表明，银纳米颗粒显著减轻了滑膜增生以及中性粒细胞在滑膜组织中的浸润。本研究揭示了一种治疗骨关节炎的新策略，为延缓KOA进展提供了理论依据。

引言

膝骨关节炎（KOA）是最常见的骨关节炎类型之一，涉及整个滑膜关节的复杂病理过程¹。随着全球人口逐渐老龄化，KOA 的发病率显著上升。膝关节持续性疼痛通常促使 KOA 患者寻求医疗干预。KOA 中疼痛的病因可能与炎症反应、滑膜增生以及软骨退变有关²。滑膜组织由两种细胞组成：滑膜成纤维细胞和巨噬细胞^3,4,5。滑膜成纤维细胞负责产生滑液。滑膜巨噬细胞通常处于静息状态，可被炎症反应激活。滑膜的初期炎症可引起膝关节疼痛⁶。

滑膜组织的炎症免疫反应在膝骨关节炎（KOA）的发病机制中起着关键作用。既往研究已证实，KOA患者的滑膜组织中存在炎症反应，即滑膜炎，且KOA的滑膜炎程度与滑膜组织中炎性细胞的浸润密切相关^7,8,9。滑膜炎是滑膜的一种炎症反应，其病理特征包括滑膜细胞增生、新生血管形成以及炎性细胞浸润^5,10,11。

膝骨关节炎（KOA）治疗的目标是缓解滑膜的炎症反应并延缓疾病进展。目前，临床上治疗KOA的主要药物是非甾体抗炎药（NSAIDs）；然而，这类药物具有明显的副作用，例如肾毒性^12,13。关节腔内注射糖皮质激素是治疗KOA的另一种选择；但糖皮质激素在关节腔内容易快速扩散，并可能被关节积液迅速代谢。同时，伴有基础高血糖的糖尿病患者应谨慎使用长期的糖皮质激素注射¹⁴。综上所述，目前尚无有效的药物治疗策略可用于KOA。因此，探索治疗KOA的新药极为紧迫。

银纳米颗粒的尺寸小于100 nm。由于其显著的抗炎、抗菌和抗氧化作用，已在医疗保健和医学的多个方面得到广泛应用，例如伤口愈合和烧伤治疗^15,16。它们还被用于靶向药物递送、医学成像以及分子诊断¹⁷。与其他金属纳米颗粒（如铜（Cu）、锌（Zn）和铁（Fe））相比，银（Ag）具有更强的抗炎和抗菌活性¹⁵。银纳米颗粒作为一种新型纳米材料，具有广谱且高效的抗菌性能。先前的研究发现，在烧伤和腹膜炎小鼠模型中^18,19，银纳米颗粒能够有效抑制炎症因子的产生并促进伤口愈合。另一项研究还表明，银纳米颗粒通过促进生长因子的合成和胶原沉积，改善了糖尿病伤口的愈合²⁰。

基于银纳米颗粒的抗炎作用，我们旨在利用银纳米颗粒治疗小鼠II型胶原诱导的膝骨关节炎（KOA）。结果表明，经该治疗后，小鼠关节滑膜中炎性浸润细胞数量显著减少。结果还表明，银纳米颗粒可显著缓解小鼠KOA的症状。因此，银纳米颗粒的应用可能有助于推动临床KOA新型治疗方案的研发。

方案

所有动物实验均经广州赛业生物医学实验动物中心动物伦理与福利委员会（AEWC）批准（2018-0186）。

1. 建立骨关节炎小鼠模型

1. 将 BALB/c 小鼠（18–24 g；12–14 周龄）饲养在湿度为 70%、温度为 26 °C、光照/黑暗周期为 12 小时的环境中。本实验中，动物饲养于广州赛业生物医学实验动物中心。
2. 采用 II 型胶原酶建立 KOA 小鼠模型，方法如先前所述²¹。关节腔注射操作步骤如下：
   1. 使用 2% 戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，并皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）进行镇痛。随后用胶带固定小鼠四肢，用剃刀去除毛发，并交替使用 0.1% 碘伏和酒精擦拭消毒三次。
   2. 佩戴无菌手套，使用无菌剪刀依次暴露皮肤、皮下组织和髌下韧带。切口范围应保持在 0.5 cm 以下。
      NOTE：手术过程中使用加热垫维持小鼠体温。
   3. 使用 1 mL 胰岛素注射器将 10 U 的 II 型胶原酶（30 mg/kg，0.4 mg/mL）注入关节腔（髌下韧带下方）²²。
      ​NOTE：针头与皮肤之间的角度应约为 15°；随后应改变针头方向，并完全撤出针头。
   4. 注射完成后，先缝合皮下组织，再缝合皮肤。使用 0.1% 碘伏对缝合部位进行消毒。待小鼠从麻醉中苏醒后，分别放入独立通风笼具（IVCs）中饲养。

2. 银纳米颗粒的合成

注意：银纳米颗粒的制备方法此前已有详细描述¹⁹。整个配制过程需在冰上进行。制备完成后，混合物应储存于 4 °C；否则，该混合物在室温下容易凝固。

1. 向一个1.5 mL微量离心管中加入总共400 µL I型胶原蛋白（4 mg/mL），并置于冰上。
2. 向上述胶原蛋白中加入总共200 µL磷酸盐缓冲液（PBS），充分混匀溶液，然后置于冰上。
3. 最后，向上述溶液中加入400 µL银纳米颗粒，充分混匀。纳米颗粒溶液的最终浓度为1 mM。
   注意：银纳米颗粒的平均直径范围为5 nm至15 nm²³，该结果已通过电子显微镜确认。

3. Ⅱ型胶原酶诱导的 KOA 小鼠的银纳米颗粒处理

1. 1 周后将经 II 型胶原酶诱导的 KOA 小鼠从笼中取出，注射银纳米颗粒。每周注射一次银纳米颗粒，30 天后采集标本。
2. 注射2%戊巴比妥钠（剂量：2 mL/kg）进行麻醉 通过 腹腔注射，然后固定、备皮，并按照步骤1.2所述进行消毒。
3. 佩戴无菌手套，使用无菌剪刀依次暴露皮肤、皮下组织和膝关节韧带。
4. 使用1 mL胰岛素注射器，以15°角将针头刺入关节腔。缓慢注入约20 µL的银纳米颗粒胶原混合物，然后缓慢拔出针头²⁴.
5. 依次缝合皮下组织和皮肤，并进行消毒。待小鼠从麻醉状态下苏醒后，分别放入独立通风笼具（IVC）中饲养。
6. 每周一次，共进行四次银纳米颗粒-胶原蛋白混合物注射（20 µL）。
   ​注意：使用银纳米颗粒胶原混合物处理的小鼠应单独饲养在独立的笼具中。若将小鼠共同饲养，可能发生争斗行为，从而影响实验结果。注射过程中，当针头到达关节腔时会产生紧张感，注射后膝关节会出现肿胀。结合这两种现象，研究人员可确认药物已成功注入膝关节。

4. 膝关节和滑膜组织的采集

1. 使用二氧化碳窒息法或其他经相关动物伦理委员会批准的方法处死小鼠。
2. 依次消毒并解剖皮肤及皮下组织，充分暴露膝关节。
3. 取下包括股骨和胫骨在内的膝关节，并去除肌肉组织。
4. 将膝关节组织（包括股骨、胫骨及周围软组织（韧带和关节囊））收集至10%福尔马林中，以进行保存和固定。

5. 苏木精-伊红染色

1. 过夜固定后，将组织切片进行石蜡包埋，并使用切片机将石蜡包埋的组织切成0.4 µm厚度。使用制备好的切片进行后续染色（苏木精-伊红染色、番红O/快绿染色以及免疫组织化学（IHC）染色）。
2. 用二甲苯对切片脱蜡两次，随后依次在100%、95%、80%和70%乙醇中各浸泡5分钟，再进行水化处理。
3. 用苏木精（0.1 g/100 mL）对切片染色5分钟，然后直接放入1% HCl中10秒，再用伊红（0.5 g/100 mL）染色1分钟。
4. 在显微镜下观察滑膜的组织病理学变化。

6. 沙黄O/快绿

1. 将组织包埋于石蜡中，并按照步骤 5.1 所述方法制备组织学切片。
2. 用二甲苯脱蜡两次，然后通过梯度乙醇系列（如 100%、95%、80% 和 70% 乙醇溶于蒸馏水中）进行水化，每步 5 分钟。
3. 用苏木精对制备好的切片染色，并用 PBS 洗涤三次，每次 2 分钟。
4. 用盐酸酒精对切片进行分化，再用 PBS 洗涤三次，每次 2 分钟。
5. 将切片浸入 0.02% 快绿染色液中染色 5–10 分钟，随后用 0.1% 沙黄 O 染色 1–2 分钟。
6. 用 1% 乙酸进行分化，然后用 PBS 洗涤。
7. 在切片中检测并分析纤维软骨的形成。

7. 免疫组织化学（IHC）染色

1. 将组织包埋于石蜡中，并按照步骤5.1所述制备组织学切片。
2. 用二甲苯脱蜡两次，然后通过梯度乙醇溶液（如100%、95%、80%和70%乙醇，溶于蒸馏水中，每步5分钟）对切片进行水化。将切片浸入Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris碱，1 mM EDTA溶液；pH 9.0）中，在微波炉中95 °C加热10分钟，以进行抗原修复。
3. 用3%过氧化氢溶液处理切片10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
4. 用5%山羊血清处理切片，以阻断非特异性结合。
5. 加入稀释的一抗（抗CD177抗体，1:1,000稀释），4°C孵育过夜。随后用PBS洗涤切片三次。
6. 将切片浸入PBS中，再与适当的二抗（HRP标记的聚合物抗兔系统）在室温下孵育30分钟。
7. 使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）作为显色剂进行免疫组化染色的显色。
8. 在显微镜下观察切片，并对获取的图像进行分析。

结果

采用II型胶原酶诱导KOA小鼠模型。自造模后第1周开始，每周向关节腔内注射1次制备好的银纳米颗粒胶原混合物，连续注射4周（图1）。每日观察并记录各组小鼠体重。结果显示，KOA模型组小鼠的平均体重显著低于正常对照组。然而，II型胶原酶+AgNPs组小鼠的平均体重高于KOA模型组，尽管该差异无统计学意义（图2）。造模30天后，采集小鼠膝关节滑膜组织进行病理学检查，分析滑膜增生、血管增殖、炎症细胞浸润及软骨损伤情况^5,10,11。结果表明，KOA组小鼠滑膜厚度显著高于正常对照组；而银纳米颗粒胶原混合物治疗组的滑膜厚度较KOA组有所降低（图3）。与正常对照组相比，KOA模型组小鼠滑膜中出现明显的血管增生，而经银纳米颗粒胶原混合物治疗后，滑膜中的血管增生显著减少（图4）。番红O染色结果显示，KOA模型组小鼠的软骨基质遭到破坏，而银纳米颗粒胶原混合物治疗组小鼠的软骨基质完整性明显改善（图5）。各组形态学特征评分按先前描述的方法进行评估²²，结果分别为：生理盐水组0 ± 0，II型胶原酶组7 ± 0.63，II型胶原酶+AgNPs组4.2 ± 1.17（图6）。CD177是中性粒细胞的主要标志物²⁵，在正常情况下，40%–60%的中性粒细胞表达CD177，但在急性炎症期间，中性粒细胞中CD177的表达显著升高。免疫组化染色结果显示，与KOA模型组相比，AgNPs治疗组滑膜区域浸润的中性粒细胞显著减少（图7），提示AgNPs治疗可改善KOA的症状。

图1：注射位置。（A）II型胶原酶注射的代表性图像。（B）II型胶原酶注射后的代表性图像。（C）骨关节炎（KOA）小鼠模型中银纳米颗粒-胶原混合物注射的代表性图像。（D）KOA模型小鼠注射银纳米颗粒-胶原混合物后的代表性图像。红色虚线表示与小鼠膝关节韧带平行的线。黑色箭头表示胰岛素注射器针头与皮肤之间的角度。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：各组小鼠体重变化情况。 本图显示了各组小鼠在不同时间点的平均体重；横轴表示注射II型胶原酶后的天数，纵轴表示体重的倍数变化。生理盐水组（n = 7），II型胶原酶组（n = 5），II型胶原酶 + AgNPs组（n = 5）。*p < 0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：苏木精-伊红（H&E）染色显示滑膜增生。 术后30天，收集各组小鼠的滑膜组织，经固定、切片后进行H&E染色。双箭头表示检测到的滑膜厚度。比例尺 = 0.1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：滑膜周围血管增生的代表性图像。 箭头指示血管。比例尺 = 0.05 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：各组小鼠膝关节的番红O染色结果。 比例尺 = 0.2 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：各组形态学特征评分。采用各组小鼠的滑膜组织测定其形态学特征评分。每组选取5个组织切片，分析滑膜衬里细胞层增生/肥大程度、滑膜组织中中性粒细胞浸润程度以及滑膜间质活化程度（表1），并以平均值作为最终评分。**p < 0.01，***p < 0.001，通过Student's t检验将各组与未治疗的KOA组进行比较。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 7：各组小鼠滑膜组织中中性粒细胞标志物的免疫组化染色。 采用免疫组化染色法检测各组小鼠滑膜组织中中性粒细胞标志物 CD177 的表达。箭头指示中性粒细胞。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：形态学特征评分。 请点击此处下载该表格。

讨论

银纳米颗粒具有抗炎、抗菌、抗氧化和免疫调节作用，这意味着它们可通过减少活性氧物质的生成来保护细胞和组织免受损伤²⁶一些研究人员对银纳米颗粒的毒性表示关注²⁷银纳米颗粒的毒性与游离银离子的存在直接相关。由于银纳米颗粒具有纳米级尺寸，可轻易干扰生物分子、细胞及人体器官^15,28,29已有若干研究报道，银纳米颗粒可在人类细胞中诱导氧化应激并损害线粒体功能³⁰此外，大量使用银纳米颗粒后，可在人体器官中检测到银，尤其是在肝脏和脾脏中。研究人员还报道，银纳米颗粒具有穿过血脑屏障的能力。 通过 跨突触运输并在脑内蓄积³¹尚未对银纳米颗粒的生物毒性进行系统性报告，尽管一些研究者认可银纳米颗粒的安全性。³².

在本研究中，我们制备了一种银纳米颗粒与胶原蛋白的混合物。实际上，银纳米颗粒在人体组织中的存留时间较短，但当其与胶原蛋白混合物联合使用时，可延长其存留时间；这不仅能够减轻创伤，还能降低药物剂量。考虑到银纳米颗粒的毒性，本研究中所使用的银纳米颗粒剂量为30 mg/kg，与既往研究一致³³。

实验操作中有几项关键注意事项如下。II型胶原酶配制后应于−20 °C保存，以防止因酶切作用导致降解。银纳米颗粒-胶原混合物的制备必须在室温下持续置于冰上进行，因为该混合物会迅速形成半固体凝胶，从而无法用于注射。溶液配制后应于4 °C保存。关节腔内给药应选用带有较细针头的1 mL胰岛素注射器，这可有效防止注射药物外漏。注射时针头应以15°角刺入。当针头推进无阻力时，表明已进入膝关节腔。注射完毕后应改变注射角度，并缓慢拔出针头，以避免注射药物外漏。

在本研究中，银纳米颗粒有效改善了由II型胶原酶诱导的小鼠膝骨关节炎（KOA）症状，表明银纳米颗粒具有抗炎作用。已有若干研究报道，在含有银纳米颗粒的培养条件下细胞出现凋亡现象 体外 使用银纳米颗粒^34,35,36滑膜增生的减轻可能是由于银纳米颗粒影响了线粒体功能所致，或者这些效应可能由活性氧介导。在膝骨关节炎（KOA）模型组小鼠的滑膜中观察到血管增生。在此过程中，趋化因子可能促使中性粒细胞从血管迁移至滑膜组织，炎症爆发导致细胞耗氧量增加，从而引发血管增生。因此，尚需进一步实验验证该假说的可靠性。本研究为临床膝骨关节炎治疗的研究提供了理论依据。在后续研究中，我们拟结合前交叉韧带（ACL）切断法与化学诱导的KOA模型方法，观察银纳米颗粒的作用效果。实验结果表明，银纳米颗粒可显著减少KOA小鼠滑膜中炎性细胞的浸润，但其作用机制仍需深入研究，有望揭示KOA的发病机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 胰岛素注射器	BD	305932	无
CD177 多克隆抗体	ThermoFisher Scientific	PA5-98759	无
水合氯醛	Sigma-Aldrich	302-17-0	无
DAB	MCE	HY-15912	无
伊红	碧云天生物技术	C0109	无
福尔马林	Sigma-Aldrich	HT501128	无
苏木精	碧云天生物技术	C0107	无
光学显微镜	Leica	DM500	无
银纳米颗粒	Wolcacvi	S-10-20	将产品避光保存于 4°C
番红O-快绿FCF软骨染色试剂盒	Solarbio	90-15-3	无
II型胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C6885-500mg	无