量化转基因中的适合度代价 埃及伊蚊 蚊子

摘要

本实验方案描述了如何测量埃及伊蚊（Aedes aegypti）的常见生命参数数据，包括繁殖力、翅长、生育力、性别比例、存活力、发育时间、雄蚊贡献率以及成虫寿命。这些测量指标可用于评估转基因蚊虫的适合度。

摘要

转基因蚊子与野生型蚊子相比通常表现出适合度代价。在此类研究中，适合度代价的评估涉及采集转基因蚊子的生命参数数据，并与具有相同遗传背景但不含转基因的蚊子进行比较。本文详细说明了如何测定蚊子常见的生活史性状 埃及伊蚊包括繁殖力、翅的大小与形态、生育力、性别比例、存活率、发育时间、雄性贡献以及成虫寿命。选择这些参数是因为它们能够反映生殖成功率，易于测量，且在文献中常被报道。代表性结果量化了基因敲除或单次插入基因驱动元件所导致的适合度代价。标准化生命参数数据的收集方法非常重要，因为此类数据可用于比较不同研究中产生的转基因蚊虫的健康状况，或用于模拟野生型蚊虫群体中转基因的固定速率。尽管本方案专门针对转基因 埃及伊蚊该方案也可用于其他蚊种或其他实验处理条件，但需注意某些生物学背景可能需要进行特殊调整。

引言

“适者生存”是达尔文提出的观点，即拥有最适应其生存环境基因的个体将把这些基因传递给后代¹。这意味着，正是适应度决定了其基因能否得以延续。这一已有150多年历史的概念，或许是设计转基因蚊子中成功基因驱动系统最关键的决定因素。基因驱动是指自私遗传因子以超越孟德尔遗传规律的方式在种群中扩散的现象²，目前正被探索用于遗传性害虫治理³。在媒介控制背景下，该策略旨在用对病原体具有抗性的个体取代野生型（WT）节肢动物（种群修饰），或彻底清除整个种群（种群压制）⁴。然而，与野生型同类相比，转基因蚊子通常表现出适应度代价（也称为遗传负荷），这意味着在竞争能力更强的种群中，外源基因将逐渐丢失。因此，必须将外源基因与基因驱动系统相结合，以抵消任何适应度代价，并推动外源基因在种群中的传播水平超过典型的孟德尔遗传预期⁴。

跨蚊媒种类的实验室研究表明，转基因通常表现出适合度代价^5,6,7例如，Irvin 等 测量了多种生命参数 埃及伊蚊（Aedes (Ae.....

方案

注意：本方案适用于已验证并建立的转基因和野生型Ae. aegypti品系。有关生成转基因Ae. aegypti的更多信息，请参见 Kistler et al.²² 和 Coates et al.²³ 。以下所述的所有实验均在标准的Ae. aegypti饲养条件下进行。蚊子饲养环境为28 °C，相对湿度75%–80%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。出于统计学考虑，强烈建议每种蚊株至少使用100张单独的产卵纸。全面的适合度研究大约需要3个月完成（图1）。

1. 雌性蚊虫繁殖力的测定

1. 孵化转基因蚊子和野生型蚊子（具有相同遗传背景但不携带转基因），将产卵纸放入无菌水中过夜，置于昆虫饲养室中，遵循标准饲养条件。让幼虫自由摄食。 随意摄取 通过提供数滴（每滴约 50 µL）研磨后的鱼食（Tetramin）悬液（浓度约为 30% w/v）进行喂养。一龄幼虫在孵化后 1 天即可识别。将幼虫转移至较大的容器中，避免拥挤，通常 1 L 水体（表面积约为 250 cm²）可培育 100–150 条幼虫²....

结果

根据上述方案，评估了两种蚊虫品系的适合度：（1）通过CRISPR/Cas9介导敲除埃及伊蚊（Ae. aegypti）D7L1（AAEL006424）唾液蛋白基因；（2）表达自主性CRISPR/Cas9基因驱动系统的埃及伊蚊（Ae. aegypti）品系⁹。对于前者，通过显微注射针对D7L1基因的特异性sgRNA至胚胎中，利用非同源末端连接（NHEJ）途径产生基因断裂，从而建立纯合D7L1基因敲除品系。为消除潜在的脱靶效应，将杂合D7L1-KO蚊虫与野生型（WT）回交四代后，获得稳定的纯合品系。对于后者，将一个基因驱动盒（gene drive cassette）敲入Carb109位点（Chr3:409699138），该盒在nanos（AAEL012107）或innexin-4（AAEL006726）启动子驱动下表达Cas9核糖核蛋白复合物（本方案中分别称为GD1和GD2），显微注射所用为CRISPR/Cas9注射混合物，操作如前所述⁹。阳性G_1<.......

讨论

Ae. aegypti 的适合度研究通常在实验室中进行，以评估与转基因载荷（例如， 基因驱动元件）或基因敲除相关的适合度代价，如本文所述；然而，这些研究也可用于多种其他目的——任何旨在评估 Ae. aegypti 群体健康状况的研究，例如感染 Wolbachia 的蚊株^30,31、具有杀虫剂抗性的蚊株^32,33，或感染节肢动物病毒的蚊株³⁴。因此，由于这些实验可应用于广泛的目的，相关实验方案被设计为简单、高效且可重复。

研究人员在将实验室收集的适合度数据外推至野外蚊虫时应谨慎。在本方案中，对照组应为具有相同遗传背景但不含转基因（或处理条件）的蚊虫。然而，实验室中常用的野生型Ae. aegypti品系已近交.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 盎司半透明塑料苏芙蕾杯	WebstaurantStore	301100PC
2 盎司半透明聚苯乙烯苏芙蕾杯	WebstaurantStore	760P200N
3 mL 塑料移液器	Cornin	357524
50 mL 圆锥形离心管	任意品牌
64 盎司白色双层聚乙烯涂层纸制食品杯	WebstaurantStore	999SOUP64WB	用于蚊虫饲养
65 mm 镜头	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	佳能 MP-E 65mm 宏观摄影镜头，7D-65mm-1X；变焦=1, 200, 6.3, ISO=100；用于拍摄翅膀或产卵纸，尽管其他相机也可能满足需求
Aedes aegypti 蚊子	BEI	多种品系的卵均可获得
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高压灭菌器			用于孵化用水的灭菌
佳能 EOS 7D 相机	Canon	3814B004	用于拍摄翅膀或产卵纸，尽管其他相机也可能满足需求
脱纤维绵羊血	Colorado Serum Co.	60 ml，每两周一次	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
双臂可弯曲显微镜照明灯	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 系统
乙醇
镊子	Dumont	5SF
纱布		omnisorb ii	4" 无纺海绵
玻璃显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-2
玻璃培养皿，100 × 15 mm	VWR	75845-546	用于将蚊子置于冰上进行麻醉或操作
猪肠	任意熟食店		我们批量购买，分割、清洗后分装为约 4×12" 小份，于 -20°C 保存在 50 mL 离心管中
冰
冰桶
Kimwipe 纸巾	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 立体变倍显微镜			用于筛选转基因蚊子（如适用）
画笔	AIT 合成刷	10-0 号	用于操作幼虫/蛹（可在亚马逊购买）
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用于 2° 储存纸箱的塑料容器	沃尔玛		Sterilite 58 夸脱透明底白色盖储物箱，8 件套
用于饲养幼虫的塑料容器	沃尔玛		Sterilite 28 夸脱塑料储物箱，白色，10 件套
用于孵化幼虫的塑料容器	沃尔玛		Sterilite 6 夸脱塑料储物箱，白色
聚丙烯透明熟食容器	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 盎司，或根据需要使用更大的 16 盎司型号（127RD16BULK）
橡皮筋	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12"，#64 和 #10
橡胶塞	VWR	217-0515	用于蚊虫饲养
糖源，如方糖或葡萄干
Tetramin 鱼粮片	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook 形态测量学实验室		一款免费的形态测量图像处理软件，可在线获取，网址为 https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook 形态测量学实验室		一款免费的形态测量图像处理软件，可在线获取，网址为 https://www.sbmorphometrics.org/
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Whatman 1 号定性滤纸	Whatman	1001-824	用于产卵纸。白色背景有助于观察黑色虫卵。