本实验方案描述了如何测量埃及伊蚊（Aedes aegypti）的常见生命参数数据，包括繁殖力、翅长、生育力、性别比例、存活力、发育时间、雄蚊贡献率以及成虫寿命。这些测量指标可用于评估转基因蚊虫的适合度。
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摘要
摘要
转基因蚊子与野生型蚊子相比通常表现出适合度代价。在此类研究中，适合度代价的评估涉及采集转基因蚊子的生命参数数据，并与具有相同遗传背景但不含转基因的蚊子进行比较。本文详细说明了如何测定蚊子常见的生活史性状 埃及伊蚊包括繁殖力、翅的大小与形态、生育力、性别比例、存活率、发育时间、雄性贡献以及成虫寿命。选择这些参数是因为它们能够反映生殖成功率，易于测量，且在文献中常被报道。代表性结果量化了基因敲除或单次插入基因驱动元件所导致的适合度代价。标准化生命参数数据的收集方法非常重要，因为此类数据可用于比较不同研究中产生的转基因蚊虫的健康状况，或用于模拟野生型蚊虫群体中转基因的固定速率。尽管本方案专门针对转基因 埃及伊蚊该方案也可用于其他蚊种或其他实验处理条件，但需注意某些生物学背景可能需要进行特殊调整。
引言
“适者生存”是达尔文提出的观点，即拥有最适应其生存环境基因的个体将把这些基因传递给后代1。这意味着，正是适应度决定了其基因能否得以延续。这一已有150多年历史的概念，或许是设计转基因蚊子中成功基因驱动系统最关键的决定因素。基因驱动是指自私遗传因子以超越孟德尔遗传规律的方式在种群中扩散的现象2，目前正被探索用于遗传性害虫治理3。在媒介控制背景下，该策略旨在用对病原体具有抗性的个体取代野生型（WT）节肢动物（种群修饰），或彻底清除整个种群（种群压制）4。然而，与野生型同类相比，转基因蚊子通常表现出适应度代价（也称为遗传负荷），这意味着在竞争能力更强的种群中，外源基因将逐渐丢失。因此，必须将外源基因与基因驱动系统相结合，以抵消任何适应度代价，并推动外源基因在种群中的传播水平超过典型的孟德尔遗传预期4。
跨蚊媒种类的实验室研究表明，转基因通常表现出适合度代价5,6,7例如，Irvin 等 测量了多种生命参数 埃及伊蚊（Aedes (Ae.) aegypti） 在增强型绿色荧光蛋白（eGFP）或转座酶基因表达调控下构建 果蝇 actin 5C 或合成的 3XP3 启动子，并将其与野生型 Orlando 品系（即它们所来源的相同遗传背景）进行比较5最显著的是，他们发现所有转基因品系的繁殖适合度均显著降低5. 根据转基因的不同，某些 按蚊属（Anopheles） 表达抑制性转基因的蚊子 疟原虫 寄生虫发育也表现出适应性代价6具体而言， An. stephensi 在组成型或血餐诱导型启动子下表达蜜蜂毒液磷脂酶（PLA2）的个体，其产卵数显著少于对照组6。这些作者还发现，转基因 按蚊属 表达不同转基因时，SM1十二肽四聚体未表现出适合度代价，因此他们得出结论：转基因赋予的适合度代价至少在部分程度上取决于所表达转基因蛋白的作用效果6确实，适合度代价可能源于转基因产物、位置效应、脱靶效应、插入突变或实验室培育品系中的近交效应7因此，基因驱动必须具备足够的鲁棒性，以抵消这些由转基因引起的适应性代价，同时避免产生阻碍基因驱动本身的插入和缺失（indels）。
发育或生殖适合度代价可在实验室或笼养研究中进行测量7，但需注意的是，野外环境中未知因素也可能产生影响。尽管如此，在规划或评估转基因蚊子释放（例如基因驱动项目）时，受控的适合度研究是确定转基因品系能否在后续世代中持续存在的一个重要初步步骤。例如，Hammond et al. 评估了基于CRISPR/Cas9的An. gambiae基因驱动系统，该系统旨在破坏雌性生育力所必需的基因8。通过持续至少25代的笼养研究，作者发现蚊子产生了对基因驱动具有抗性的等位基因，这些等位基因阻断了CRISPR靶向切割并恢复了雌性生育力8。他们的建模分析表明，在模拟条件下，杂合子雌性中基因驱动相关的生育力变化对基因驱动的固定具有最显著的影响8。类似地，经过改造以在不同启动子控制下或在不同基因间位点表达自主基因驱动盒的Ae. aegypti（Higgs' White Eye品系，HWE），在模拟种群中表现出不同的基因驱动固定速率9。结合MGDrivE建模10、插入缺失（indel）形成率、母体效应以及实验室收集的生命参数数据，作者发现蚊子的适合度在模拟条件下对基因驱动的持续性影响最为显著9。最可能削弱基因驱动效率的适合度代价主要来源于体细胞中Cas9的（过量）表达或所靶向基因本身，尤其是在杂合子中，而非基因驱动机制的内在特性所致11,12,13,14,15,16,17。
鉴于其重要性，适合度是转基因品系在后续世代中持续存在的关键因素，也可作为评估转基因相关生理效应的指标。例如，脱靶效应可能与适合度代价相关。在此情况下，建议将转基因品系连续回交多代。此外，将转基因品系与代表野外种群的品系杂交，可能也有必要，以评估转基因种群在真实环境中的竞争能力。为了量化适合度代价并使其具有可比性，本文提供了测量埃及伊蚊（Ae. aegypti）常见生活史性状的简易实验方案，特别侧重于与转基因相关的适合度代价，以便此类研究更易于重复。所包括的实验方案涵盖繁殖力、生育力、性别比例、存活力、发育时间、雄性贡献以及成虫寿命。此外，选择测量翅长和翅面积作为适合度指标，因其与胸部长度18,19及体型大小相关，而体型大小又直接关联于血餐量、繁殖力和免疫力20,21。尽管评估适合度的方法众多，但本文选择这些参数是因为它们能够反映繁殖成功率，测量简便，且在文献中广泛报道。
方案
注意：本方案适用于已验证并建立的转基因和野生型Ae. aegypti品系。有关生成转基因Ae. aegypti的更多信息，请参见 Kistler et al.22 和 Coates et al.23 。以下所述的所有实验均在标准的Ae. aegypti饲养条件下进行。蚊子饲养环境为28 °C，相对湿度75%–80%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。出于统计学考虑，强烈建议每种蚊株至少使用100张单独的产卵纸。全面的适合度研究大约需要3个月完成（图1）。
1. 雌性蚊虫繁殖力的测定
- 孵化转基因蚊子和野生型蚊子（具有相同遗传背景但不携带转基因），将产卵纸放入无菌水中过夜，置于昆虫饲养室中，遵循标准饲养条件。让幼虫自由摄食。 随意摄取 通过提供数滴（每滴约 50 µL）研磨后的鱼食（Tetramin）悬液（浓度约为 30% w/v）进行喂养。一龄幼虫在孵化后 1 天即可识别。将幼虫转移至较大的容器中，避免拥挤，通常 1 L 水体（表面积约为 250 cm²）可培育 100–150 条幼虫2继续提供Tetramin悬浮液作为食物来源，使幼虫能够摄食 广告 随意供应将食物浆液以离散液滴形式加入 确保幼虫始终有充足的食物，且水体不呈现浑浊状态。幼虫在每一龄期都会增大体型，最终在幼虫培养盘中进入蛹期。
- 蛹在孵化后约5-6天开始羽化，此时应按性别分开，以确保成虫羽化后为处女蝇（用于后续交配），具体操作如下所述。
- 使用3 mL塑料移液器将蛹挑入盛有干净自来水的小型塑料杯中，以进行性别分选。雄性蛹通常比雌性蛹体积更小，且羽化时间较早。首先根据蛹的大小进行初步分选，然后通过形态学特征对初步筛选结果进行确认。
- 将蛹移至玻璃载玻片上，并用纸巾吸去多余水分，以固定蛹体。在体视显微镜下以2倍至4倍放大倍数，使用细尖毛笔将蛹腹面朝上摆放。
- 通过肉眼观察尾部生殖叶形态的差异（位于桨状结构后方蛹体腹部末端的体节处）； 图2）。雌性的鳍呈尖锐状，延伸超过生殖叶，大致呈冠状或类似吸血鬼牙齿的形状，而雄性的生殖叶则呈圆形，不具有这些尖锐结构。参见 Carvalho 等24 如需更多图表。
- 将雄性和雌性蛹分别放入盛水的杯子中，并置于适当的容器内，例如容量为1.9 L（1/2加仑或64盎司）的纸箱，加盖尺寸为0.2 m × 0.2 m（8英寸 × 8英寸）的白色薄纱布，每个容器放置约150只蛹。
- 在笼子顶部提供糖和水源例如，葡萄干和一个用纱布覆盖并用两根橡皮筋固定的盛水杯）。在纸箱上切一个笔杆大小的孔，并用橡胶塞封住，以便在蛹羽化时可将新出现的蛹添加到饲养箱中。
- 在成虫羽化后3-5天，将蚊子置于4 °C环境中约2-5分钟以进行麻醉。尽管蚊子可能仍有轻微抽动，但当大部分个体已掉落至纸盒底部时，即表明已达到足够的麻醉程度。随后将蚊子转移至置于冰上的玻璃培养皿中，放置约30分钟至1小时。
注意：将蚊虫置于 4 °C 环境过长时间可能会显著影响其健康状况，尽管我们发现若将其置于冰上不超过 1 小时，则未见任何不良影响。 - 杂交 WT 或转基因 GD1 或 GD29 （基于CRISPR/Cas9的基因驱动）雄性 大规模 将麻醉的蚊子以五只野生型（WT）或转基因雄蚊比一只野生型（WT）雌蚊的比例加入蚊虫饲养盒中，每个盒子约含150只蚊子，与未交配的野生型（WT）雌蚊进行交配。务必根据雄蚊类型标记饲养笼。
注意：该杂交方案用于确定 GD1 或 GD2 的适合度9 半合子 (即, 携带一个拷贝转基因的蚊子）。为了测定纯合转基因品系的适合度，可调整杂交方案，使转基因雄性和雌性个体相互交配，同时以野生型雄性和雌性个体的杂交作为对照。 - 2-3天后，按照标准饲养程序对雌性蚊虫进行血液饲喂25 通过在笼子上方提供血源。在血液喂养前24小时移除糖源，并在血液喂养前约2-3小时移除水源，以提高摄食效率。
- 吸血后，将蚊子置于4 °C条件下麻醉，步骤同1.5。
- 通过目视检查雌蚊腹部是否充血，将吸血后完全饱食的雌蚊与未吸血的雌蚊分开。丢弃未吸血、部分吸血的个体以及雄蚊。
- 将吸血后的雌虫放回各自笼中，并在笼顶提供糖和水源。
- 2-3天后，将单个雌性个体放入已用铅笔预先标记的滤纸衬里的50 mL锥形管中（图3用网罩盖住锥形管，并用两根橡皮筋密封。
- 雌虫苏醒后，向所有离心管中加入约 5 mL 自来水。在每个锥形管顶部放置一小块葡萄干或浸糖水的棉球。将雌虫置于昆虫饲养室中 1～2 天，使其产卵。
- 1至2天后，倒空每个锥形管，并将蚊子置于4 °C条件下进行麻醉。为加快处理速度，可用3 mL塑料移液器的尖端压住滤网，将每个锥形管中的水排干。将锥形管倒置，放在纸巾上继续沥干。将50 mL锥形管放入试管架中，并将试管架置于4 °C环境中。
- 收集卵纸并统计每张卵纸上的卵子数量。将未产卵的雌虫记为0枚卵，并将其纳入分析。计算平均生殖力，即每张卵纸上统计的总卵数除以筛选的雌虫总数。
注意：个体卵纸的数码照片可作为计数核对的视觉记录（图4). - 将卵纸晾干后放回昆虫饲养室。建议卵纸干燥至少3–5天，以获得最佳的孵化效果25.
2. 测量翅长、翅面积和质心大小
- 从已完成的繁殖力研究中，取至少25只野生型或转基因的年龄匹配且吸血后的雌蚊，将蚊笼置于-20 °C下冷冻约15分钟。
注意：冷冻时间不宜过长，且不得摇晃或摔落容器，以免导致蚊子翅膀脱落。 - 解剖每只蚊子的左翅，沿翅膀与胸部的关节处切下，完整移除整个翅膀，操作步骤如下：
- 一手用镊子夹住蚊子，镊子夹持部位为翅膀下方的胸部区域。
- 另一手使用另一对镊子，从翅膀与胸部的关节处轻轻施力，将左翅完整剥离，注意不要撕裂翅脉，确保整片翅膀被完整取下。
- 用镊子将翅膀放置于载玻片上，使其平展。使用移液管向载玻片上的翅膀滴加一滴15 mL储备液，该储备液由70%乙醇和一滴洗洁精组成 。
- 在盖玻片上加一滴80%甘油，然后将其覆盖在载玻片上含有乙醇-洗洁精溶液的翅膀上。
- 使用配备65 mm镜头的相机（7D-65 mm-1x；变焦=1，光圈200，f/6.3，ISO=100）拍摄固定在载玻片上的翅膀。记录像素/毫米比例尺，并确保所有图像的比例尺一致。若多个翅膀同时成像，需将照片裁剪为单个翅膀图像，并为每张图像添加比例尺。将图像以TIFF格式保存，并采用LZW压缩，每张图像需清晰标注该翅膀的全部信息。
注意：若研究需要，也可使用其他相机、放大倍数或显微镜连接相机进行拍摄，但必须保持设置一致，且每张翅膀图像的像素/毫米比例尺相同。在后续测量分析中将对像素/毫米比例进行校正。 - 下载免费的形态测量图像处理软件tpsUtil和tpsDig。有关软件的详细信息，请参见Rohlf26,27。
- 使用tpsUtil对翅膀图像进行数字化，生成用于下一步分析的TPS文件。
- 打开tpsUtil，在operation菜单下选择Build tps file from images。点击input，选择包含单个翅膀图像的文件夹，并任选一张图像以确认该路径。点击output，命名将生成的文件（格式为.tps），然后点击save。
- 接着在actions下点击setup，选择include all，点击create并关闭弹出窗口。在operation下选择Randomly order specimens，点击input选择刚刚创建的.tps文件，点击output，将该.tps文件重新命名以表明其为样本随机化后的版本，点击save，然后点击Create。完成后关闭tpsUtil程序。
注意：为减少测量误差，可将同一翅膀图像复制一份，作为技术重复使用两次。
- 使用tpsDig软件确定各标志点的二维笛卡尔坐标。在input中选择步骤2.7生成的.tps文件。根据步骤2.5确定的比例尺设置标尺；在options中选择image tools，然后点击measure。
- 点击代表数字化标志点的蓝色十字准星图标，然后按顺序从标志点1至标志点14依次点击图5中标示的翅脉关节位置，在图像上添加标志点。
注意：这些标志点的选择基于先前已在翅形标志点数字化与分析中广泛应用19，在多个样本中易于识别，且能充分覆盖翅的大小与形状特征。 - 在标记标志点时，若某些标志点因翅膀折叠或损伤而缺失或难以辨认，可在tpsDig中点击M图标将其标记为缺失，以排除其参与分析，同时保持其余标志点的正确顺序。点击红色向右箭头继续对下一张图像进行标志点数字化，直至文件中所有图像均完成。完成后保存并关闭文件。
注意：为确保翅长、翅面积和尺寸计算的准确性，每张图像上的标志点必须按正确顺序添加。 - 使用补充文件1中提供的R脚本计算翅长和翅面积，并根据实验情况修改.tps文件路径和图像比例尺参数。
- 计算翅重心大小（wing centroid size），该指标为一种在统计上独立于形状的尺寸度量，定义为各标志点到翅中心点距离的平方和的平方根28,29。
- 采用广义普罗克拉斯对齐法（generalized procrustes alignment）去除非形状变异，并绘制平均标志点坐标图，分析时仅使用所有标志点完整的翅膀样本。对于翅重心大小和平均标志点坐标的计算，使用补充文件2中提供的R脚本，并根据实验情况修改.tps文件路径和图像比例尺参数。
3. 评估卵子受精能力
- 孵化单个 F1 将单只雌性个体（步骤1中采集）的纸片上的卵放入含有约100 mL新鲜灭菌去离子水的聚丙烯透明熟食容器中。加入两到三滴研磨过的鱼食悬浮液 随意摄取 喂养。在容器顶部覆盖纱布或薄棉布，并用橡皮筋固定。
- 孵化后2-3天，将卵纸从水中取出，放入一个带有盖子或纱网覆盖的新容器中，在昆虫饲养室中过夜晾干。
- 将卵纸重新放回最初孵化所用的容器中，置于水容器内进行再次孵化。
注意：对卵纸进行干燥和重新孵化可显著提高孵化效率。此步骤可能不适用于其他蚊种。 - 在初次孵化后的3-5天，对幼虫进行肉眼观察（2nd 至 4th 龄期）用于转基因标记（如适用； 图6). 将数条幼虫置于铺有纱布或网筛并垫有纸巾的滤纸上，同时在荧光显微镜下进行观察。纸巾可吸收多余水分，使滤纸能够用于筛选和操作固定不动的幼虫。
- 记录转基因幼虫中阳性或阴性的数量。丢弃阴性幼虫。
- 清洁幼虫培养用水以确保最佳发育时间。具体操作为：用移液器将幼虫转移至小杯中，弃去脏水，更换为新鲜自来水。将阳性幼虫加入其中，并确保提供充足的碎鱼食悬浮液。
- 将转基因或对照组幼虫数量除以卵子总数，计算繁殖力。
4. 蛹的性别比例测定
- 孵化后最多14天内，继续收集并记录雄性和雌性蛹的数量（如步骤1.2.3所述）。可按性别将雌蛹或雄蛹分别集中到置于1.9 L容器中的小杯内。
- 为确定性别比例，将整个研究时间段内每只成年雌蚊所产生的F1代雌蚊数量或F1代雄蚊数量相加，再除以同一只雌蚊所产蚊株中收集到的蛹的总数。
5. 幼虫存活力的测定
- 为确定幼虫存活率，将每个个体雌性成蚊在整个研究时间段内收集到的蛹的总数相加。
- 将此数值除以在步骤3中统计的同一条蚊株每个个体雌性成蚊的幼虫总数。
6. 幼虫至蛹发育时间的测定
- 为确定幼虫到蛹的发育情况，每天记录每组幼虫数量和蛹数量。
- 将幼虫到蛹的发育时间计算为孵化后发育至蛹期的平均时间。
7. 雄性贡献的测定
- 使用年龄匹配的雄性个体，将成年未交配的转基因雄蚊以及成年未交配的对照雄蚊和雌蚊置于冰上麻醉。
- 将转基因雄性成虫或对照组雄性成虫分别与对照组雌性成虫杂交：取50只转基因雄性或50只年龄匹配的对照组雄性，与100只对照组雌性一同放入64盎司纸箱中，使每个纸箱中雄性总数为50只，雌性为100只（即雌:雄比例为2:1）。务必标记清楚哪个纸箱中为转基因雄性，哪个纸箱中为对照组雄性。
- 让蚊子交配持续2-3天。此后，按照标准饲养程序为蚊子提供血餐。
- 在吸血后第三天，将每只完全吸血的雌虫单独放入已铺有预先标记好的白色滤纸的50 mL锥形管中，具体操作如步骤1（繁殖力测定）所述。丢弃未吸血的雌虫，或于次日再次提供血餐。向所有锥形管中加入约5 mL自来水。在每个锥形管顶部的网筛上放置一小块葡萄干。
- 将雌虫在昆虫饲养室中保留1-2天，使其产卵。在4-5天内目视检查产卵纸上的卵 血液餐后第几天产卵。让雌虫额外多一天产卵，以提高产卵率。
- 收集卵纸，倒掉水，并将锥形管置于 4 °C 对雌蚊进行麻醉，方法如前所述。将雌蚊弃于 70% 乙醇中销毁。
- 将纸张留在管中，在昆虫饲养室中干燥至少5天。用镊子取出纸张，放入含约100 mL新鲜灭菌去离子水的透明聚丙烯熟食容器中以促进孵化。加入2–3滴研磨的鱼食浆液用于 随意 喂食。用纱布或薄棉布覆盖容器顶部，并用橡皮筋固定。
- 孵化后2-3天，将卵纸从水中取出，放入一个带有盖子或纱网覆盖的新容器中，置于昆虫饲养室过夜晾干。
- 将卵纸重新放回相同的容器中，通过将其放回水容器来重新孵化。
- 在初次孵化后的3-5天，肉眼观察幼虫（2nd 至 4th 龄期）以检测转基因标记（如适用）。将雄性贡献率计算为F代中具有该标记的个体数2 转基因幼虫数量除以每蚊虫品系的幼虫总数。
8. 蚊虫寿命的测定
- 将50只雄性和50只雌性野生型或转基因、年龄匹配且未吸血的蚊子转移至合适的饲养容器中。可使用64盎司的纸箱，顶部开口处用连裤袜覆盖，并拧紧打结，以便在实验过程中方便接触和操作蚊子（图7）。
注意：出于统计学目的，建议设置三个重复组。 - 提供糖源和水源。本实验中使用葡萄干以及一个用纱布覆盖并以两根橡皮筋固定的盛水杯。
- 每天记录死亡的雄性和雌性蚊子数量。计算寿命时，取各饲养箱中蚊子死亡前经过的平均天数，排除因非信息性原因死亡的个体（如被压碎或溺死于糖液等非自然寿命因素导致的死亡），并排除在研究结束时仍存活的蚊子。
注意：生存率定义为存活至时间t的概率，即函数S(t) = Pr(T>t)。中位生存时间是指生存概率为0.5时对应的时间，即T_0.5 = S-1 × 0.5。
结果
根据上述方案，评估了两种蚊虫品系的适合度：（1）通过CRISPR/Cas9介导敲除埃及伊蚊（Ae. aegypti）D7L1（AAEL006424）唾液蛋白基因；（2）表达自主性CRISPR/Cas9基因驱动系统的埃及伊蚊（Ae. aegypti）品系9。对于前者，通过显微注射针对D7L1基因的特异性sgRNA至胚胎中，利用非同源末端连接（NHEJ）途径产生基因断裂，从而建立纯合D7L1基因敲除品系。为消除潜在的脱靶效应，将杂合D7L1-KO蚊虫与野生型（WT）回交四代后，获得稳定的纯合品系。对于后者，将一个基因驱动盒（gene drive cassette）敲入Carb109位点（Chr3:409699138），该盒在nanos（AAEL012107）或innexin-4（AAEL006726）启动子驱动下表达Cas9核糖核蛋白复合物（本方案中分别称为GD1和GD2），显微注射所用为CRISPR/Cas9注射混合物，操作如前所述9。阳性G1幼虫至少与野生型（WT）杂交两次以建立转基因品系，并通过PCR扩增及桑格测序对蚊虫基因组DNA进行检测，验证转基因的正确整合9。
在建立转基因/突变蚊株后，按照上述方案进行适合度研究。将纯合子D7L1-KO Ae. aegypti 的适合度与野生型（WT）Ae. aegypti 利物浦株（LVP株）进行比较，而将通过将纯合子品系与野生型回交获得的携带单拷贝基因驱动盒的半合子 Ae. aegypti 的适合度与HWE株进行比较。选择这些对照组是因为它们与其对应的转基因品系具有相同的遗传背景，但不携带转基因。从繁殖力研究（第1节）中每品系选取至少150–200只雌蚊，使其产卵以用于后续实验，以确保获得至少100份独立的F1代卵纸，满足统计学要求。下述生命参数的定义如下：（1）繁殖力：单只雌蚊在第一个 gonotrophic 周期中产卵的数量；（2）翅长、翅面积和重心尺寸：翅端到端的距离、翅的表面积，以及一种不受翅形变异影响的翅尺寸测量指标；（3）生育力：一个 gonotrophic 周期后产下的卵中发育出的幼虫总数除以该周期内产卵总数；（4）性别比例：雌性或雄性蛹的总数除以蛹的总数；（5）幼虫存活率：蛹的总数除以幼虫总数；（6）幼虫至蛹的发育时间：卵孵化后至发育为蛹所需的时间；（7）雄性贡献率：转基因阳性的F2代幼虫数除以幼虫总数；（8）寿命：成蚊在仅提供糖源条件下存活的天数。
缺乏D7L1蛋白的雄性蚊子表现出显著延迟的幼虫到蛹期以及蛹期到成虫的发育时间（图8)以及生存时间缩短（图9) 与 LVP WT 相比 埃及伊蚊此外， 埃及伊蚊 D7L1基因敲除蚊子的翅面积显著小于野生型个体，但翅大小或质心大小无显著差异图10）。该分析表明，基因改造并未改变蚊虫的体型，但可能诱发了发育压力，从而导致翅膀形态发生变化。另一方面，携带一个在表达调控下的基因驱动盒拷贝的蚊虫 纳米颗粒 （GD1）或 zpg (GD2)启动子与HWE品系相比，在适合度方面没有显著差异，但幼虫存活力除外表1). 埃及伊蚊 在基因驱动盒表达下 纳米颗粒 启动子表现出显著较低的幼虫存活率（p = 0.035).
图 1：适合度研究时间线。完成本文所述所有适合度研究方案所需的预计时间。每个生活史参数以红色突出显示。缩写：TG = 转基因型；WT = 野生型；O/N = 过夜。本图由 Biorender.com 制作。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：通过生殖节叶区分雌性和雄性蛹。 雌性蛹在生殖节叶后方具有延伸的鳍状结构（黑色箭头），而雄性蛹则无此特征。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：50 mL锥形管用作单个产卵室。 50 mL锥形管内衬白色滤纸（由红箭头指示），滤纸被裁成矩形后卷起，并用铅笔预先标记，可作为独立的产卵室。管口覆盖网膜，用两个橡皮圈固定，可在其上提供糖源。每个管中加入近5 mL水，作为水源。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：白色滤纸作为单只雌虫的产卵纸。 将裁成矩形的白色滤纸从单个产卵室中取出，并肉眼检查是否有卵，如此处所示。用铅笔在纸张左上角标记，有助于识别亲代雌虫。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：Aedes aegypti 翅片标志点。 共使用 14 个标志点（以红色显示），用于在 tpsDig 软件中进行翅片数字化，以生成二维笛卡尔坐标。在对所有图像进行坐标数字化的过程中，必须始终保持翅片坐标的顺序。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：转基因幼虫筛选。 经基因工程改造后，在光感受器特异性启动子（3XP3）驱动下表达mCherry的转基因幼虫，可通过其眼部是否存在阳性荧光进行筛选（左图），而在非转基因幼虫中则无此荧光信号（右图）。使用体视显微镜观察，放大倍数为0.5x–4x。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：用于寿命测定的蚊虫 containment 装置。 一个 64 盎司的纸盒，其顶部开口处覆盖丝袜材料，扭紧并打结封闭，可在实验过程中方便地接触和操作蚊虫，是进行寿命测定实验时理想的蚊虫 containment 装置。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：雄性D7L1基因敲除型埃及伊蚊（Ae. aegypti）的幼虫至蛹期及蛹至成虫期发育时间延长。 幼虫至蛹期和蛹至成虫期的发育时间通过Kruskal-Wallis方差分析及Dunn's事后检验进行评估。野生型雄蚊化蛹所需时间短于野生型雌蚊（Dunn's检验，p < 0.05），而D7L1基因敲除型雄蚊与其雌性个体在化蛹时间上无显著差异（Dunn's检验，p > 0.05）。D7L1基因敲除型雌蚊达到化蛹的时间长于野生型雌蚊（Dunn's检验，p < 0.05），D7L1基因敲除型雄蚊也长于野生型雄蚊（Dunn's检验，p < 0.05）。在蛹至成虫发育时间方面，野生型与D7L1基因敲除型雌蚊之间无显著差异。野生型雄蚊化蛹速度较野生型雌蚊更快（p < 0.05），也快于D7L1基因敲除型雄蚊（p < 0.05）。D7L1基因敲除型雄蚊与雌蚊之间无显著差异（p > 0.05）。然而，D7L1基因敲除型雌蚊的发育速度慢于野生型雌蚊（p < 0.05）。缩写：WT = 野生型利物浦品系；F = 雌性；M = 雄性；D7L1 KO = D7L1基因敲除型Ae. aegypti。每种蚊株使用25只年龄匹配的雄性和25只雌性，N = 25。* = p < 0.05，Dunn's事后检验，Kruskal-Wallis方差分析；ns = 无显著性差异。柱状图表示均值 ± 标准误。请点击此处查看该图的放大版本。
图 9：野生型（利物浦品系）与 D7L1 基因敲除的埃及伊蚊（Aedes aegypti）雌雄个体在生存率上存在显著差异。 在研究期间，野生型雌蚊从未达到其中位生存时间：第 40 天时的生存概率 p(survival) = 0.83。其余各组均在 40 天前达到中位生存时间，且中位生存时间表现出明显的时间差异（野生型雄蚊 ≈ 33 天，D7L1 雌蚊 ≈ 39 天，D7L1 雄蚊 ≈ 22 天）。采用 Kaplan-Meier 法生成生存曲线，以模拟各品系随时间推移的生存情况并估算中位生存时间，同时考虑删失数据和非正态生存分布。通过 Log-Rank 检验评估组间差异。Log-Rank 检验假设删失为非信息性删失且风险成比例。随后使用 Cox 比例风险模型评估风险比，即在时间 t 时（在死亡尚未发生的情况下）每组相对于其他组的瞬时死亡风险。模型的比例风险假设成立，经 Schoenfeld 残差检验验证（通过 cox.zph 函数验证；性别和品系的 p > 0.05）。每种 Ae. aegypti 品系包含 50 只雄性和 50 只年龄匹配、未吸血的雌性蚊虫。 请点击此处查看该图的放大版本。
图10野生型（利物浦品系）和 D7L1 基因敲除 埃及伊蚊 雌性个体在翅面积上存在显著差异，但在翅长或重心大小上无显著差异。 通过成像翅膀并数字化标志点来测量翅长、翅面积和重心大小，以评估其大小和形状的变化。野生型与D7L1基因敲除型之间的翅面积存在差异，表明该基因敲除并未影响个体体型，但可能引发发育压力，从而改变翅的形态。A长度：野生型平均值 = 2.4 mm，σ = 0.21；D7L1 平均值 = 2.498 mm，σ = 0.35；差异无统计学意义（Mann-Whitney T 检验， p = 0.6370). (B面积：野生型均值 = 529,740 像素/平方毫米，σ = 58,852；D7L1 均值 = 457,879 像素/平方毫米，σ = 143,633。差异具有统计学意义（Mann-Whitney T检验，p = 0.0158）。C）质心尺寸：野生型均值 = 2,321 像素，σ = 61.08；D7L1 均值 = 2,296 像素，σ = 76.77，排除两个离群值。差异无统计学意义（Mann-Whitney T检验， p = 0.2993). 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 组别 | 野生型（HWE） | GD1 | GD2 |
| 幼虫至蛹发育时间（天） | 9.8 ± 4.3 | 9.5 ± 5.6 | 9.5 ± 7.0 |
| 幼虫存活率（%存活） | 44.2 ± 7.3 | 30.9 ± 2.9* | 44.8 ± 2.5 |
| 成虫中雌性比例（%） | 45.4 ± 1.6 | 47.8 ± 1.5 | 48.2 ± 1.1 |
| 成虫中雄性比例（%） | 54.6 ± 1.7 | 52.2 ± 1.5 | 51.8 ± 1.1 |
| 50%雌性存活时间（天） | 34 ± 6.2 | 44.5 | 41.5 |
| 50%雄性存活时间（天） | 20.7 ± 3.3 | 16 ± 1.6 | 18 ± 4.5 |
| 繁殖力（产卵数） | 62.6 ± 2.8 | 57.6 ± 2.6 | 64.6 ± 2.0 |
| 生育力（卵孵化率，%） | 49.2 ± 8.2 | 44.0 ± 3.6 | 58.3 ± 3.4 |
| 雄性贡献率 | 35.3 ± 1.02 (1931/5447) | 25.6 (1035/4049) | |
表1：两种生物的生命参数数据 埃及伊蚊 与Higgs' White Eye（HWE）对照品系相比，携带基因驱动盒（gene drive cassettes）的半合子品系（GD1和GD2）。 来自半合子雄性或允许与野生型雌性交配的HWE雄性所得的数据。* = 0.01 < p < 0.05，采用单尾t检验。无星号表示单因素方差分析无显著性差异。数据以均值±标准误表示。本表格经修改自9.
补充文件 1：用于计算翅长和翅面积的 R 代码。代码文件名为：Supplemental_File_R_Winglengtharea.R。 请点击此处下载该文件。
补充文件 2：用于确定翅形质心大小和平均标志点的 R 代码。代码文件名为：Supplemental_File_R_Wingcentroidsize_meanlandmarks.R。请点击此处下载该文件。
讨论
Ae. aegypti 的适合度研究通常在实验室中进行，以评估与转基因载荷（例如， 基因驱动元件）或基因敲除相关的适合度代价，如本文所述；然而，这些研究也可用于多种其他目的——任何旨在评估 Ae. aegypti 群体健康状况的研究，例如感染 Wolbachia 的蚊株30,31、具有杀虫剂抗性的蚊株32,33，或感染节肢动物病毒的蚊株34。因此，由于这些实验可应用于广泛的目的，相关实验方案被设计为简单、高效且可重复。
研究人员在将实验室收集的适合度数据外推至野外蚊虫时应谨慎。在本方案中，对照组应为具有相同遗传背景但不含转基因（或处理条件）的蚊虫。然而，实验室中常用的野生型Ae. aegypti品系已近交繁殖多代，因此可能无法准确代表来自野外的蚊虫。例如，常用的实验室品系洛克菲勒（Rockefeller，ROCK）被认为最早于1881年从古巴采集的Ae. aegypti建立35。研究表明，洛克菲勒品系雌蚊在实验室中的寿命显著长于野外蚊虫36。另一个常用于转基因研究的实验室品系是希格斯白眼（Higgs' White Eye，HWE），该品系以Stephen Higgs博士命名，因其具有白眼突变表型而被选育37。由于这些蚊虫缺乏眼色素，相较于具有黑眼的野生型Ae. aegypti，其转基因表达的荧光标记更容易被检测 。然而，这些蚊虫的适合度显著低于野外来源的蚊虫38。此外，实验室中的适合度研究也不能完全反映蚊虫在野外所经历的环境条件。尽管如此，受控的实验室适合度研究仍能较好地反映一些在自然条件下难以测量的生命参数。在完成实验室适合度研究后，可能还需进行更大规模的笼养实验，以评估蚊虫在半野外条件下的适合度。
尽管本手稿主要针对埃及伊蚊（Ae. aegypti），但其中许多实验方案可经适当调整后适用于其他物种；然而，我们建议研究人员充分考虑目标物种的生物学特性，因为这些特性可能存在差异，从而需要对方案进行细微修改。例如，我们发现将干燥的单份卵纸进行两次孵化——即先将卵纸在水中孵化一次，随后将卵纸过夜干燥，再对同一批卵纸进行第二次水中孵化——相较于仅进行一次孵化，能更高效地反映实际的孵化率。但需要注意的是，埃及伊蚊（Ae. aegypti）的卵具有较强的抗干燥能力39,40，而其他蚊种可能不耐干燥，包括按蚊属（Anopheles）的大多数物种。
这些实验方案中最关键且耗时的步骤，可能是准确区分雄性和雌性蛹的性别。成虫在羽化后36-48小时交配41，因此必须正确鉴定蛹的性别，以确保后续杂交实验中使用的是处女蝇。雌性果蝇为一夫一妻制，而雄性为一夫多妻制，一只雄蝇可有效使至少五只雌蝇受精41,42,43。这意味着，若一只基因型错误的雄蝇被放入饲养笼中，可能会使至少五只雌蝇受精，导致该饲养笼在后续实验中基本失去价值；而单只基因型错误的雌蝇对一群雄蝇的影响则相对较小。
总之，我们概述了测量埃及伊蚊（Ae. aegypti）常见生活史性状的基本实验方案。这类研究在评估转基因蚊虫中与外源基因相关的适合度代价时具有极其重要的意义，因为这些数据可用于后续应用，例如建模分析。对于评估新型遗传控制策略的研究，在实际应用之前，还需在半野外条件下进行更大规模的笼养实验。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢密苏里大学的 Bill Reid 博士和 Alexander Franz 博士在本实验方案中提供的支持。作者还感谢美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）的 Benjamin Krajacich 博士在 R 分析方面提供的支持。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 R01 AI130085（KEO），以及美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所内部研究计划项目编号 AI001246（EC）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 盎司半透明塑料苏芙蕾杯 | WebstaurantStore | 301100PC | |
| 2 盎司半透明聚苯乙烯苏芙蕾杯 | WebstaurantStore | 760P200N | |
| 3 mL 塑料移液器 | Cornin | 357524 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | 任意品牌 | ||
| 64 盎司白色双层聚乙烯涂层纸制食品杯 | WebstaurantStore | 999SOUP64WB | 用于蚊虫饲养 |
| 65 mm 镜头 | Canon | MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo | 佳能 MP-E 65mm 宏观摄影镜头，7D-65mm-1X；变焦=1, 200, 6.3, ISO=100；用于拍摄翅膀或产卵纸，尽管其他相机也可能满足需求 |
| Aedes aegypti 蚊子 | BEI | 多种品系的卵均可获得 | |
| 人工膜饲喂器 | https://lillieglassblowers.com/ | 中型膜饲喂器，定制，33 mm | Chemglass 也提供此类产品，但尺寸不适合我们使用。我们的饲喂器直径约为 3 cm？ |
| ATP | MP Biomedical | ICN15026605 | 任何高质量 ATP，10 mM 过滤除菌分装后于 -20°C 保存 |
| 高压灭菌器 | 用于孵化用水的灭菌 | ||
| 佳能 EOS 7D 相机 | Canon | 3814B004 | 用于拍摄翅膀或产卵纸，尽管其他相机也可能满足需求 |
| 脱纤维绵羊血 | Colorado Serum Co. | 60 ml，每两周一次 | https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated |
| 双臂可弯曲显微镜照明灯 | Dolan Jenner Fiber-Lite 180 | 181-1 系统 | |
| 乙醇 | |||
| 镊子 | Dumont | 5SF | |
| 纱布 | omnisorb ii | 4" 无纺海绵 | |
| 玻璃显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 玻璃培养皿，100 × 15 mm | VWR | 75845-546 | 用于将蚊子置于冰上进行麻醉或操作 |
| 猪肠 | 任意熟食店 | 我们批量购买，分割、清洗后分装为约 4×12" 小份，于 -20°C 保存在 50 mL 离心管中 | |
| 冰 | |||
| 冰桶 | |||
| Kimwipe 纸巾 | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Leica GZ4 立体变倍显微镜 | 用于筛选转基因蚊子（如适用） | ||
| 画笔 | AIT 合成刷 | 10-0 号 | 用于操作幼虫/蛹（可在亚马逊购买） |
| 连裤袜 | 沃尔玛 | L'eggs Everyday | 女性尼龙加码及膝袜透明袜尖，16 双装（需适配纸箱） |
| 铅笔 | 任意品牌 | ||
| 用于 2° 储存纸箱的塑料容器 | 沃尔玛 | Sterilite 58 夸脱透明底白色盖储物箱，8 件套 | |
| 用于饲养幼虫的塑料容器 | 沃尔玛 | Sterilite 28 夸脱塑料储物箱，白色，10 件套 | |
| 用于孵化幼虫的塑料容器 | 沃尔玛 | Sterilite 6 夸脱塑料储物箱，白色 | |
| 聚丙烯透明熟食容器 | WebstaurantStore | 127DM12BULK | 12 盎司，或根据需要使用更大的 16 盎司型号（127RD16BULK） |
| 橡皮筋 | Office Max | #100736/#909606 /#3777415 | 12"，#64 和 #10 |
| 橡胶塞 | VWR | 217-0515 | 用于蚊虫饲养 |
| 糖源，如方糖或葡萄干 | |||
| Tetramin 鱼粮片 | Tetramin | 16106 | |
| tpsDig | Stony Brook 形态测量学实验室 | 一款免费的形态测量图像处理软件，可在线获取，网址为 https://www.sbmorphometrics.org/ | |
| tpsUtil | Stony Brook 形态测量学实验室 | 一款免费的形态测量图像处理软件，可在线获取，网址为 https://www.sbmorphometrics.org/ | |
| 白色欧根纱布料 8” × 8” | FabricWholesale.com | 4491676 | Joann Casa Collection 欧根纱布料，Casa Collection 品牌 |
| Whatman 1 号定性滤纸 | Whatman | 1001-824 | 用于产卵纸。白色背景有助于观察黑色虫卵。 |
参考文献
- Dawkins, R. The Selfish Gene. New edition. , University Press. Oxford, New York. Oxford. (1989).
- Crow, J. F. Unmasking a Cheating Gene. Science. 283 (5408), 1651-1652 (1999).
- Gould, F. Broadening the application of evolutionarily based genetic pest management. Evolution. 62 (2), 500-510 (2008).
- Williams, A. E., Franz, A. W. E., Reid, W. R., Olson, K. E. Antiviral effectors and gene drive strategies for mosquito population suppression or replacement to mitigate arbovirus transmission by Aedes aegypti. Insects. 11 (1), (2020).
- Irvin, N., Hoddle, M. S., O'Brochta, D. A., Carey, B., Atkinson, P. W. Assessing fitness costs for transgenic Aedes aegypti expressing the GFP marker and transposase genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (3), 891-896 (2004).
- Moreira, L. A., Wang, J., Collins, F. H., Jacobs-Lorena, M. Fitness of anopheline mosquitoes expressing transgenes that inhibit Plasmodium development. Genetics. 166 (3), 1337-1341 (2004).
- Dilani, P. V. D., Dassanayake, R. S., Tyagi, B. K., Silva Gunawardene,, N, Y. I. The impact of transgenesis on mosquito fitness: A review. Frontiers in Insect Science. 38, (2022).
- Hammond, A. M., et al. The creation and selection of mutations resistant to a gene drive over multiple generations in the malaria mosquito. PLOS Genetics. 13 (10), (2017).
- Reid, W., et al. Assessing single-locus CRISPR/Cas9-based gene drive variants in the mosquito Aedes aegypti via single-generation crosses and modeling. 3 (12), (2022).
- Wu, S. L., et al. MGDrivE 2: A simulation framework for gene drive systems incorporating seasonality and epidemiological dynamics. PLOS Computational Biology. 17 (5), (2021).
- Oberhofer, G., Ivy, T., Hay, B. A. Gene drive and resilience through renewal with next generation Cleave and Rescue selfish genetic elements. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (16), 9013-9021 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553(2020).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Champer, J., et al. A CRISPR homing gene drive targeting a haplolethal gene removes resistance alleles and successfully spreads through a cage population. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24377-24383 (2020).
- Champer, S. E. 15, et al. Computational and experimental performance of CRISPR homing gene drive strategies with multiplexed gRNAs. Science Advances. 6 (10), (2020).
- Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9. 51701, (2020).
- Champer, S. E., Kim, I. K., Clark, A. G., Messer, P. W., Champer, J. Anopheles homing suppression drive candidates exhibit unexpected performance differences in simulations with spatial structure. eLife. 11, 79121(2022).
- Petersen, V., et al. Assessment of the correlation between wing size and body weight in captive Culex quinquefasciatus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 49 (4), 508-511 (2016).
- Yeap, H. L., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M., Ritchie, S. A., Johnson, P. H. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 89 (1), 78-92 (2013).
- Fecundity Briegel, H. metabolism, and body size in Anopheles (Diptera: Culicidae), vectors of malaria. Journal of Medical Entomology. 27 (5), 839-850 (1990).
- Hurd, H., Hogg, J. C., Renshaw, M. Interactions between bloodfeeding, fecundity and infection in mosquitoes. Parasitology Today. 11 (11), 411-416 (1995).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Coates, C. J., Jasinskiene, N., Miyashiro, L., James, A. A. Mariner transposition and transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (7), 3748-3751 (1998).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), (2014).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2010).
- Rohlf, F. J. TpsDig (2.32) [Computer software. , (2018).
- Rohlf, F. J. TpsUtil (1.79) [Computer software. , (2018).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric Morphometrics for Biologists. , Elsevier Academic Press. New York, NY. (2017).
- Size Klingenberg, C. P., shape, and form: concepts of allometry in geometric morphometrics. Development Genes and Evolution. 226 (3), 113-137 (2016).
- Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: Parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
- Ross, P. A., Hoffmann, A. A. Fitness costs of Wolbachia shift in locally-adapted Aedes aegypti mosquitoes. Environmental Microbiology. 24 (12), 5749-5759 (2022).
- Rigby, L. M., Johnson, B. J., Peatey, C. L., Beebe, N. W., Devine, G. J. The impact of sublethal permethrin exposure on susceptible and resistant genotypes of the urban disease vector Aedes aegypti. Pest Management Science. 77 (7), 3450-3457 (2021).
- Smith, L. B., Silva, J. J., Chen, C., Harrington, L. C., Scott, J. G. Fitness costs of individual and combined pyrethroid resistance mechanisms, kdr and CYP-mediated detoxification, in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009271(2021).
- Chaves, B. A., et al. Vertical transmission of Zika virus (Flaviviridae, Flavivirus) in Amazonian Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) delays egg hatching and larval development of progeny. Journal of Medical Entomology. 56 (6), 1739-1744 (2019).
- Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
- David, M., Garcia, G., Valle, D., Maciel-de-Freitas, R. Insecticide resistance and fitness: the case of four Aedes aegypti populations from different Brazilian regions. BioMed Research International. , (2018).
- Wendell, M. D., Wilson, T. G., Higgs, S., Black, W. C. Chemical and gamma-ray mutagenesis of the white gene in Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 9 (2), 119-125 (2000).
- Koenraadt, C. J., Kormaksson, M., Harrington, L. C. Effects of inbreeding and genetic modification on Aedes aegypti larval competition and adult energy reserves. Parasites and Vectors. 3, (2010).
- Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Developmental Biology. 8, (2008).
- Farnesi, L. C., Vargas, H. C. M., Valle, D., Rezende, G. L. Darker eggs of mosquitoes resist more to dry conditions: Melanin enhances serosal cuticle contribution in egg resistance to desiccation in Aedes, Anopheles and Culex vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), (2017).
- Carvalho, D. O., et al. Mosquito pornoscopy: Observation and interruption of Aedes aegypti copulation to determine female polyandric event and mixed progeny. PLoS ONE. 13 (3), (2018).
- Helinski, M. E., Harrington, L. C. Male mating history and body size influence female fecundity and longevity of the dengue vector Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 48 (2), 202-211 (2011).
- Felipe Ramarez-Sanchez,, Camargo, L., Avila, C., W, F. Male sexual history influences female fertility and re-mating incidence in the mosquito vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Insect Physiology. 121, 104019(2020).
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