基于细胞的电学阻抗平台实时评估寨卡病毒抑制剂

摘要

本文展示了细胞电学阻抗（CEI）技术作为一种极为简便直接的方法，用于实时研究寨卡病毒在人细胞中的感染与复制过程。此外，CEI检测法还可用于抗病毒化合物的评估。

摘要

基于细胞的电学阻抗（CEI） 技术通过测量贴壁细胞单层在嵌有电极的培养板孔中生长或受到干预时引起的阻抗变化，实现对细胞状态的监测。该技术可用于实时监测寨卡病毒（ZIKV）感染及其在贴壁细胞中复制所造成的影响，因为该病毒具有高度的细胞病变效应。该检测方法操作简便，无需使用标记物或侵入性手段，且能够提供实时数据。ZIKV感染的动力学过程高度依赖于所使用的细胞系、病毒株以及感染复数（MOI），而这些因素难以通过传统的终点检测方法进行充分研究。此外，CEI检测还可用于抗病毒化合物的评估与表征，尤其适用于研究那些在感染过程中表现出动态抑制效应的化合物。本文详细阐述了CEI检测的实际操作步骤及其在ZIKV研究和抗病毒研究中的潜在应用。

引言

寨卡病毒（ZIKV）暴发与多种严重疾病并发症相关，例如小头症和吉兰-巴雷综合征^1,2,3。尽管由于蚊媒分布范围扩大和城市化进程加快等多种风险因素，未来仍有可能出现新的流行疫情，但迄今为止，尚无获批上市的寨卡病毒疫苗或抗病毒药物^3,4。因此，传统的ZIKV研究方法亟需结合新型工具，以更有效地研究该病毒及其潜在的抗病毒化合物。抗病毒研究通常依赖于表型检测，其终点指标为特定参数的存在，例如病毒诱导的细胞病变效应（CPE）的出现，或通过报告基因检测某种病毒诱导蛋白的表达^5,6,7。然而，这些方法通常为终点检测，操作繁琐且可能需要复杂的分析流程。因此，基于阻抗的检测方法提供了一种具有吸引力的替代方案。

基于细胞的电学阻抗（CEI）是指当细胞接种于含有电极的孔板中并形成贴壁细胞层后，对电流从一个电极流向另一个电极所产生的阻力。本方法所采用的成熟CEI技术为电阻抗细胞形态检测技术（Electric Cell-substrate Impedance Sensing, ECIS），最初由Giaever和Keese^8,9开发。该技术广泛应用于多种生物学研究领域，如癌症转移、毒理学以及伤口愈合研究^10,11,12。其原理依赖于通过在一定频率范围内连续施加交流电（AC）电压而产生的电场¹³。细胞暴露于这些无创电场中，并在预设的时间间隔内，检测因细胞生长、细胞贴附性或形态变化所引起的阻抗改变¹⁴。此外，细胞活力的改变也会导致阻抗变化，使该技术成为监测具有细胞病变效应病毒（cytopathogenic viruses）感染的有力工具^15,16,17。由于该技术可检测到细胞层在纳米尺度范围内的形态变化，因而提供了一种高度灵敏的检测手段。本文所述的CEI检测方法是一种简便、无创、实时且无需标记的检测技术，可用于动态测量细胞层随时间推移发生的阻抗变化。

尽管细胞病变效应抑制（CEI）法尚未用于评估寨卡病毒（ZIKV）感染进程或其潜在抗病毒药物，但其作为诊断工具的应用此前已有研究¹⁸。在最近的一项研究中，首次验证了在A549细胞中利用CEI检测法测定多种ZIKV抑制剂抗病毒活性的可行性¹⁹。本文对该CEI检测方法进行了更详细的描述，并将其拓展应用于多种贴壁细胞系以及不同感染复数（MOI）下的多种ZIKV毒株。由此展示了该方法在黄病毒抗病毒研究中的广泛适用性。该方法的关键优势在于可对细胞进行实时监测，从而能够识别关键的感染时间点，并动态评估潜在抗病毒化合物的抑制活性。综上所述，CEI技术为现有抗病毒研究方法体系提供了一种强大而有价值的补充工具。

方案

所有步骤均在生物安全二级实验室的超净工作台内无菌条件下进行。所使用的所有病毒均根据比利时机构审查委员会（Departement Leefmilieu, Natuur en Energie，方案编号 SBB 219 2011/0011）以及鲁汶大学生物安全委员会的规定，经批准后获取和使用。

1. 细胞培养的维持

注意：本实验方案使用一系列细胞系进行，但当然可适用于任何贴壁细胞系，仅需优化细胞接种密度。

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，于T75培养瓶中培养A549人肺腺癌细胞系、U87人恶性胶质母细胞瘤细胞系以及HEL 299人胚肺成纤维细胞₂ 在湿润的培养箱中。
2. 在细胞融合度达到80%–95%时进行传代培养。所有试剂在使用前应置于室温（RT）。
3. 从细胞中移除培养过的培养基，用 5 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞单层一次。
4. 将1 mL 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）均匀覆盖于细胞单层上，于37 °C孵育最多3分钟，直至细胞开始脱落。
5. 加入9 mL新鲜的完全培养基（参见 材料表 （详见说明）。轻轻吹打混匀以重悬细胞。
6. 将所需体积的细胞悬液转移至新的T75培养瓶中，并加入适量新鲜培养基，使总体积达到15 mL。
   ​注意： 体外 本方案中使用的细胞系根据具体细胞系的不同，以1:4至1:10的比例传代培养，以维持最佳生长条件。传代培养每3-4天进行一次，因此所需的细胞悬液体积也可根据培养天数的不同而有所变化。

2. CEI 平板的制备

1. 取一个带有叉指电极的96孔板（参见材料表），并向所有孔中加入100 µL培养基。
2. 用DPBS填充孔之间的空隙。
   注意：这样做是为了减少在96孔板中培养细胞时因蒸发引起的边缘效应。
3. 将板在含5% CO₂的培养箱中于37 °C孵育4小时。

3. 细胞接种

1. 按照第1节所述方法从培养瓶中分离细胞，并将细胞重悬于50 mL离心管中的新鲜培养基中。
2. 使用选定的方法计数活细胞数量。
   注意：对于A549细胞，活力通常可达约100%。为确定细胞数量，我们采用基于吖啶橙/碘化丙啶染色的自动细胞分析系统（参见材料表）。其他细胞计数方法同样适用。
3. 将细胞重悬于新鲜培养基中，以获得所需细胞密度。本研究中，A549细胞的最佳密度为0.15 × 10⁶（活细胞）/mL。
4. 从培养箱中取出带有叉指电极的96孔板，并用多通道移液器移除培养基。
5. 向96孔板的每孔中加入100 µL细胞悬液（本例中相当于15 × 10³ 个细胞）。
6. 将细胞在室温下平衡15分钟后，再放入CEI装置中。

4. 建立并运行CEI检测

1. 将装有 CEI 设备板架的培养箱置于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下。
2. 将 96 孔板放入设备中。
3. 打开设备软件，通过点击 采集数据面板 中的 设置 来建立新实验。等待笔记本电脑连接至 ECIS 设备，并通过检测各孔的阻抗来配置板。检查所有孔是否均已正确配置（以绿色显示为准）。若未全部显示为绿色，请重复步骤 4.2，直至所有孔均显示为绿色。
4. 在 孔板配置面板 中，根据所用培养器皿选择相应的 阵列类型。
5. 选择 多频率/时间模式。
   注：在此模式下，设备将在一系列频率范围内测量阻抗变化。
6. 点击 开始 启动测量。
   ​注：可在软件界面上实时监测阻抗变化。选择要显示的 目标频率，本示例中选择 16 kHz。

5. 化合物的制备与孵育

注意：以抗病毒化合物为例，本文使用迷宫肽A1（见材料表）。由于本方案可推广至所有具有潜在抗病毒活性的化合物，因此我们将其统称为“该化合物”。

1. 将不含胎牛血清（FBS）的完全细胞培养基（称为“检测缓冲液”）置于室温下平衡。
2. 将化合物置于冰上保存。
3. 在5 mL聚丙烯管中，用检测缓冲液配制每种化合物的10倍浓缩稀释液。
4. 在5 mL聚丙烯管中，用检测缓冲液对化合物进行系列稀释，以获得所需的10倍浓度。
5. 单击数据采集设置面板中的暂停按钮，暂停CEI设备。等待当前时间点采集完成，取出96孔板。
6. 在光学显微镜下检查细胞的贴壁情况和单层形成状态。
7. 用多通道移液器从每个孔中移除20 µL培养基。
8. 在目标孔中加入20 µL化合物溶液或溶剂对照。根据具体条件设计加样布局，以便准确移液。
9. 将培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育15分钟。
   注意：此孵育步骤使用常规细胞培养箱，而非CEI设备。细胞对照（CC）孔为仅加溶剂的孔。

6. 病毒制备与感染

1. 解冻一管病毒储备液。本示例中使用的是ZIKV MR766和ZIKV PRVABC59。
2. 在15 mL聚丙烯管中，用检测培养基将病毒稀释至所需的MOI或指定稀释度。
   注意：在此代表性示例中，使用的MOI分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.005和0.00005。
3. 向96孔板指定孔中加入100 µL病毒稀释液。向CC孔中加入检测培养基。
4. 对使用过的病毒容器进行去污染处理。
5. 将培养板重新放入CEI设备中，点击继续实验，连续6天继续进行检测。
   注意：病毒对照（VC）孔为感染后给予溶剂处理的细胞，而CC孔则不加病毒稀释液，仅加入检测培养基。若需评估化合物的细胞毒性，则用100 µL检测缓冲液替代病毒稀释液。

7. 数据分析

1. 通过点击Finish结束实验，并在弹出窗口中添加可选的总结性评论，例如有关特定实验条件的信息。当数据采集完成后，点击OK。
2. 在Graph pane中选择所需的频率，该频率应在实验结束时使CC与VC之间的阻抗差异最大。
   1. 为确定最佳频率，使用未感染和已感染的细胞进行预实验，并选择在感染细胞阻抗降至基线水平的时间点处，未感染与感染细胞之间阻抗差异最大的频率。对于A549 cells infected with ZIKV，该频率为16 kHz。
3. 若要以电子表格格式导出所有数据，请确保在Well Configuration pane中已选中所有孔，并点击File | Export data | Graph data。
4. 通过从所有数据点中减去实验结束时测得的VC平均阻抗值，再除以感染前最后时间点测得的CC平均阻抗值，对数据进行归一化处理。
5. 将归一化后的数据对时间作图，以获得CEI谱型图。
6. 计算每种条件下归一化曲线下面积（AUC_n），以确定如50%抑制浓度（IC₅₀）等参数。
7. 计算其他有用参数，例如CIT₅₀，可用于比较不同病毒株的感染性。

结果

本文详细描述了CEI检测在寨卡病毒（ZIKV）研究中的应用。该检测的工作流程如图1所示。我们展示了在特定细胞类型中实时监测ZIKV感染的便利性，以及评估抗病毒化合物对感染抑制作用的方法。作为抗病毒示例，我们使用了已有充分研究的肽类物质迷宫肽A1（labyrinthopeptin A1，Laby A1）；本文中将其简称为“化合物”，因其具体性质不在本方法学文章的讨论范围内，相关内容可参见其他文献^20,21。需要注意的是，本文结果部分未讨论该方法的可重复性，因为我们旨在聚焦于使用该技术所获得的单个阻抗谱。然而，该方法的可重复性已在先前研究中有所描述¹⁹。

在第一组实验中，我们展示了在进行CEI感染检测时优化细胞密度的重要性（图2）。当接种的细胞过多时，细胞单层将完全融合，无法在CEI电极表面进一步铺展。这会导致CC与VC之间的差异减小，从而降低分辨率，缩小抗病毒活性的检测窗口。这一点在图2E中得到了充分说明。对于某些较大的细胞类型（如U87细胞），若接种密度过高，在操作培养板时甚至可能导致细胞单层完全脱落，如本实验所示（图2F）。显微镜下也可观察到这一现象。

图2 还表明，该检测方法在进行细胞易感性研究时非常有用。图2A、B 清楚地显示，感染动力学高度依赖于细胞类型。图2C 表明，U87细胞仅在高感染复数（MOI）条件下才对寨卡病毒（ZIKV）感染易感。

在第二组实验中，通过使用不同MOI的多种ZIKV毒株以及一种已有明确描述的抗病毒化合物，突显了CEI感染检测方法的多功能性（图3）。这些实验采用A549细胞进行，该细胞系是黄病毒研究中常用的模型^22,23。该细胞系也已被用于其他研究，证实其适用于CEI检测²⁴。首先，比较了非洲谱系代表性ZIKV毒株MR766与亚洲谱系PRVABC59的感染动力学。图3A显示，两种毒株的CEI模式相似，但PRVABC59诱导细胞病变效应（CPE）的速度略慢。这一点也反映在CIT₅₀值中（图3B）。这一重要参数由Fang等人首次提出¹⁶，用于综合考虑CEI检测的动力学特征，定义为与细胞对照相比，阻抗降低50%所需的时间。

接下来，细胞在存在或不存在不同化合物浓度的条件下，分别感染三种不同MOI的ZIKV MR766或PRVABC59毒株，并监测其阻抗变化曲线。从图3C-H中可以观察到，某些化合物浓度能够抑制或延缓ZIKV感染引起的阻抗下降。这一现象在计算AUC值时也得到体现。CEI检测结果还直观表明，抗病毒活性依赖于MOI以及效力评估的时间点。AUC_n的计算可用于确定IC₅₀值，如图3I所示。最后，图3H显示CIT₅₀值也可用于确定和比较化合物的效力。无活性的化合物或化合物浓度所表现出的CEI曲线、AUC值和CIT₅₀值与VC组相当。

图1：检测方法工作流程示意图。 此图展示了CEI检测的时间线以及不同的操作和孵育步骤。缩写：CEI = 基于细胞的电学阻抗；ZIKV = 寨卡病毒；D = 天数。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：不同密度下寨卡病毒感染细胞的归一化细胞电学阻抗（CEI）曲线。 （A,D）A549、（B,E）HEL 299 或（C,F）U87 细胞以每孔 15,000–20,000 个（“最佳”密度，A–C）或 75,000 个（“次佳”密度，D–F）接种于 96 孔 CEI 板中。阻抗监测 24 小时后，用十倍系列稀释的 ZIKV MR766 感染细胞，并继续连续监测阻抗 5 天。展示的是代表性实验的 CEI 曲线（两个技术重复的均值 ± 范围）。缩写：CEI = 基于细胞的电学阻抗；MOI = 感染复数；ZIKV = 寨卡病毒；Norm = 归一化。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：感染两种寨卡病毒（ZIKV）毒株并经抗病毒化合物抑制后 A549 细胞的归一化 CEI 曲线。 （A）贴壁生长的 A549 细胞分别以不同感染复数（MOI）感染寨卡病毒 MR766 或寨卡病毒 PRVABC59，连续监测阻抗变化。结果显示为一次代表性实验中三个技术重复的均值 ± 标准差（SD）。（B）基于（A）中的 CEI 曲线计算 CIT₅₀ 值并进行比较。结果显示为三次技术重复的均值 ± 标准差（SD）。（C-H）贴壁生长的 A549 细胞经不同浓度化合物处理后，分别以特定 MOI 感染寨卡病毒 MR766（C-E）或寨卡病毒 PRVABC59（F-H），并连续监测阻抗变化。结果显示为一次代表性实验中两个技术重复的均值 ± 范围。（I）为比较化合物对不同 ZIKV 毒株及稀释度的抑制效果，计算 AUC_n，并通过从所有条件中减去细胞对照（CC）的 AUC_n 并除以病毒对照（VC）的 AUC_n 来确定抑制百分比。（J）根据（C-H）所示实验计算 CIT₅₀ 值，以比较不同 ZIKV 毒株和 MOI 的差异。结果显示为两个技术重复的均值 ± 范围。缩写：CEI = 基于细胞的电学阻抗；MOI = 感染复数；ZIKV = 寨卡病毒；Norm = 归一化；CIT₅₀ = 阻抗相对于未处理对照下降 50% 所需的时间；AUC = 曲线下面积；CC = 细胞对照；VC = 病毒对照。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了CEI检测法在寨卡病毒（ZIKV）抗病毒研究中的应用。该检测方法具有实时监测的优势，因此可用于评估ZIKV感染的动力学过程以及选择性化合物对病毒的抑制作用。通过该方法获得的数据能够对病毒诱导的细胞病变效应（CPE）以及潜在抗病毒化合物的效力进行客观且直观的观察。

由于CEI是一种非常灵敏的方法，在进行该细胞实验时必须格外小心。关键是要进行精确的移液操作，以尽可能避免移液误差。此外，细胞数量和所用病毒原液等可能影响实验结果的其他因素，也必须在重复实验之间保持恒定。这些因素会显著影响细胞生长和感染的动力学过程，从而可能导致计算出的CIT₅₀值和/或其他参数出现差异。

在存在（潜在）抗病毒化合物的情况下进行CEI检测时，重要的是要确定这些化合物在无病毒存在时是否会影响细胞的阻抗。该技术极为敏感，甚至在低于化合物细胞毒性浓度的水平下也可能检测到阻抗变化¹⁹。

尽管本文仅展示了寨卡病毒（ZIKV）的数据，但该检测方法可轻松应用于其他致细胞病变的（黄）病毒，仅需极少的优化步骤，例如确定最佳的细胞指数（CEI）监测频率。CEI检测法已针对多种人类和动物病毒进行了适应性改进，例如基孔肯雅病毒、甲型流感病毒以及人和马的疱疹病毒^25,26,27,28。本文中，该方法也被用作病毒滴度定量或抗病毒化合物筛选的简便方法。这些研究采用了实时细胞分析技术，即一种替代性的CEI检测方法。

CEI 技术的应用仅限于贴壁细胞类型，因为该检测方法的原理依赖于贴壁细胞在嵌有电极的孔板表面扩散的特性。可使用纤连蛋白等孔板表面包被物以增强细胞贴附²⁹。该方法还存在其他一些缺点，首先是成本问题。除了需要投入 CEI 监测设备及其配套的硬件和软件外，耗材成本也相对较高。此外，由于实验方案要求对病毒感染进行持续数天的监测，每周仅能完成一块 96 孔板的检测。结合高昂的成本，这限制了该技术仅适用于低至中等通量的研究场景。

由于通量方面的限制，该技术不适用于抗病毒筛选环境。然而，在初始实验阶段，该技术具有很高的吸引力，例如在评估细胞易感性以研究特定疾病相关背景下寨卡病毒（ZIKV）感染时。该技术也可用于转染细胞系或基因敲除细胞系，以方便地观察感染动力学的变化，例如在存在或缺失特定病毒进入受体的情况下。这在探究宿主细胞因子在ZIKV感染中所起作用时具有重要意义。此外，在后续的临床前研究阶段，当已选定某一先导候选化合物时，CEI检测可用于对该化合物进行更深入的表征。CEI生物传感器还可通过固定特定的生物识别元件（如病毒特异性抗体）进行改造，用于病毒的检测¹⁸。综上所述，这凸显了CEI技术在病毒学研究环境中的广泛应用潜力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549细胞	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	CCL-185	这些细胞在添加了10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和0.075%碳酸氢钠的MEM Rega-3培养基中培养。
吖啶橙/碘化丙啶染色	Logos Biosystems	F23001	活/死染色
Cellstar 聚丙烯管，15 mL	Greiner bio-one	1,88,271
Cellstar 聚丙烯管，50 mL	Greiner bio-one	2,27,261
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco，赛默飞世尔科技	41965-039	U87 和 HEL 299 细胞的培养基
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco，赛默飞世尔科技	14190-094
ECIS 培养板 96W20idf	应用生物物理学	96W20idf PET	CEI 设备用检测板
电细胞-基底阻抗传感（ECIS）Z阵列工作站	应用生物物理学		CEI 装置，包括96孔工作站、外部控制模块以及配备控制、数据采集和显示软件的笔记本电脑。必要软件已在发货前安装完毕。注意：该装置目前已停止生产，由更先进的 ECIS Z-Theta 装置取代。
Falcon 聚苯乙烯管，5 mL	康宁	352054
胎牛血清（FBS）	Cytiva	SV30160.03	所有培养细胞所用的细胞培养基添加剂
HEL 299 细胞	ATCC	CCL-137	这些细胞在添加了10% FBS和0.01 M HEPES的DMEM培养基中培养。
HEPES缓冲液，1 M	Gibco，赛默飞世尔科技	15630-056	U87细胞培养基添加剂
Labyrinthopeptin A1	罗德里希·S教授惠赠üssmuth，德国工业大学ä德国柏林		本方案中用作示例的抗病毒化合物，溶于DMSO。
L-谷氨酰胺，200 mM	Gibco，赛默飞世尔科技	25030-024	A549细胞培养基添加剂
Luna 细胞计数板	Logos Biosystems	L12001
Luna-FL 双荧光细胞计数仪	Logos Biosystems	L20001	细胞活力计数器
最低必需培养基 Rega-3（MEM Rega-3）	Gibco，赛默飞世尔科技	19993013	A549细胞的培养基
碳酸氢钠，7.5%	Gibco，赛默飞世尔科技	25080-060	A549细胞培养基添加剂
T75 组织培养瓶	TPP	Y9076
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco，赛默飞世尔科技	25200-056	解离试剂
U87 细胞	ATCC	HTB-14	这些细胞在添加了10% FBS和0.01 M HEPES的DMEM培养基中培养。
Virkon Rely+On 片剂	朗盛	115-0020	消毒剂溶液
寨卡病毒（ZIKV）MR766	ATCC	VR-84	寨卡病毒原型毒株，于1968年自乌干达哨点恒河猴中分离获得
ZIKV PRVABC59	ATCC	VR-1843	2015年从波多黎各患者中分离的ZIKV毒株