从人瘢痕疙瘩组织中分离、培养和鉴定原代真皮成纤维细胞

摘要

本研究描述了一种优化的从瘢痕疙瘩组织中建立原代成纤维细胞的实验方案，可有效且稳定地提供纯净且具有活性的成纤维细胞。

摘要

成纤维细胞是瘢痕疙瘩组织中的主要细胞类型，在其形成与发展过程中发挥着关键作用 瘢痕疙瘩。分离和培养源自瘢痕疙瘩组织的原代成纤维细胞，是进一步研究瘢痕疙瘩生物学功能与分子机制以及开发新型治疗策略的基础。传统的原代成纤维细胞获取方法存在诸多局限性，如细胞状态不佳、混杂其他类型细胞以及易受污染等。本文介绍一种经过优化且易于重复的实验方案，可有效减少获取成纤维细胞过程中可能出现的问题。在本方案中，分离后5天即可观察到成纤维细胞，培养10天后细胞融合度可达近80%。随后对细胞进行传代，并利用PDGFRα和vimentin抗体进行免疫荧光检测，以及CD90抗体进行流式细胞术鉴定。综上所述，该方案可简便地获得瘢痕疙瘩组织来源的成纤维细胞，为瘢痕疙瘩研究在实验室中提供充足且稳定的细胞来源。

引言

瘢痕疙瘩是一种纤维增生性疾病，表现为斑块持续生长，常侵入周围正常皮肤，且无自限性，给患者带来不同程度的瘙痒、疼痛以及外观和心理负担¹。成纤维细胞是瘢痕疙瘩中的主要细胞，在该疾病的发生和发展中起关键作用，其特征为过度增殖、细胞外基质过度产生以及胶原排列紊乱^2,3。然而，其潜在的发病机制尚不明确，目前仍缺乏有效的治疗方法，因此迫切需要进一步开展相关研究^4,5。

由于目前尚无理想的瘢痕疙瘩研究动物模型 体内^6,7，构建一个 体外 通过获取瘢痕疙瘩组织中的原代成纤维细胞建立模型，可为瘢痕疙瘩研究提供可行性和可靠性^2,6原代细胞是从活体组织直接分离的细胞，通常认为与细胞系相比，这些细胞更能接近多个个体的生理状态和遗传背景^8,9

方案

本研究经南方医科大学皮肤病医院伦理审查委员会批准（批准号：2020081）。在采集个体组织样本前，已获得患者的知情同意。

1. 准备

注意：以下操作应在生物安全柜内的无菌环境中进行。

1. 通过向高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液（PSA），配制完全培养基。
2. 通过向 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 1% PSA，配制含 PSA 的 PBS 溶液；通过向 1× PBS 中加入 1% FBS，配制含 FBS 的 PBS 溶液。
3. 通过高压灭菌法准备若干灭菌的剪刀、镊子和手术刀。

2. 获取移除的组织

1. 通过手术获取瘢痕疙瘩患者的组织。将新鲜的瘢痕疙瘩组织收集到无菌包装袋或无菌离心管中，并尽快转移至实验室的生物安全柜中。
   ​注意：在本方案中，所获取的瘢痕疙瘩组织大小约为 ~20 x 20 x 10 mm³，具体尺寸可能因手术情况而异。

3. 分离

....

结果

该实验方案的时间线总结于图1A中。图中还展示了分离过程的一些代表性图像（图2）；表皮层和脂肪层被小心去除后，将真皮层剪切成3-4 mm²的小片段，并接种至培养皿中。

如图3A所示，在组织块处理后第5天，显微镜下可观察到多个组织块出现成纤维细胞的迁出。如图3B所示，成纤维细胞增殖迅速，10天后达到较高的融合度。这些成纤维细胞呈细长的梭形细胞体，在达到较高融合度时排列成束状。按照本方案操作，成纤维细胞可在2–3周内传代并扩增至所需数量。

为验证成纤维细胞的身份和纯度，采用免疫荧光染色法检测成纤维细胞特异性标志物 PDGFRα¹⁰ 和波形蛋白（vimentin）。如预期所示，图 4A 和

讨论

从瘢痕疙瘩组织中获取原代成纤维细胞是进一步研究的关键基础。迄今为止，获取原代成纤维细胞的方法主要有两种：酶消化法和组织块培养法^11,12,13,14。然而，这两种传统方法均存在局限性，例如易受污染、混入其他类型细胞、培养周期较长以及成功率较低^15,16。本研究介绍了一种优化的方法，并提供了明确的操作步骤，以解决现有难题，提高瘢痕疙瘩成纤维细胞分离与培养的成功率。

微生物污染的可能性是获取原代成纤维细胞过程中的主要问题之一。所有器械和溶液都必须经过灭菌处理，并在整个实验方案的各个步骤中严格执行无菌操作技术。本方案中包含保持无菌操作的提示，以降低污染风险。第一个关键步骤是组织分离过程；将组织浸泡在添加了1% PSA的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 无菌离心管	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL 无菌离心管	JETBIOFIL	8076
4% 多聚甲醛	Beyotime Biotechnology	P0099	细胞固定
50 mL 无菌离心管	JETBIOFIL	8081	放置瘢痕疙瘩组织
Alexa Fluor-555 山羊抗兔 IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	免疫荧光染色实验的二抗
抗人 CD90 抗体	BioLegend	B301002	鉴定成纤维细胞纯度
抗体稀释液	Beyotime Biotechnology	P0262
生物安全柜	Thermo Scientific	1300 系列 A2	细胞分离与培养
牛血清白蛋白	aladdin	B265993	免疫荧光染色实验的封闭
二氧化碳培养箱	ESCO	CCL-170B-8	用于细胞培养
细胞冻存管	Corning	43513	低温保存细胞
离心机	Thermo Fisher	ST 16R	弃去上清液
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	细胞核染色
DMSO	MP Biomedicals	196055	用于细胞保存
杜氏改良伊格尔培养基	Gibco	C11995500BT	培养基溶液
胎牛血清	BI	04-001-1A
流式细胞仪	BD	BD FACSCelesta	观察细胞特性
冻存盒	Thermo Scientific	5100-0050
倒置显微镜	Nikon	ECLIPSE Ts2
激光共聚焦显微镜	Nikon	AIR-HD25	观察免疫荧光染色结果
PDGFR-α 抗体	CST	3174T	免疫荧光染色实验的一抗
青霉素-链霉素-氨苄溶液	Solarbio	P1410	加入培养基溶液中以防止污染
培养皿	JETBIOFIL	7556	培养成纤维细胞
磷酸盐缓冲液	Gibco	C10010500BT	培养基溶液
兔（DAIE）单克隆 IgG XR（R）同型对照（PE）	Cell Signaling Technology	5742S	作为流式细胞术的对照
圆形盖玻片	Biosharp	801007	细胞培养
Triton X-100	Solarbio	T8200	在细胞膜上打孔
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200072	用于细胞传代
波形蛋白抗体	Abcam	ab8978	免疫荧光染色实验的一抗