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方法文章

从人瘢痕疙瘩组织中分离、培养和鉴定原代真皮成纤维细胞

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DOI：

10.3791/65153

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2023年7月28日

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1Dermatology Hospital, Southern Medical University

本文内容

摘要

本研究描述了一种优化的从瘢痕疙瘩组织中建立原代成纤维细胞的实验方案，可有效且稳定地提供纯净且具有活性的成纤维细胞。

摘要

成纤维细胞是瘢痕疙瘩组织中的主要细胞类型，在其形成与发展过程中发挥着关键作用 瘢痕疙瘩。分离和培养源自瘢痕疙瘩组织的原代成纤维细胞，是进一步研究瘢痕疙瘩生物学功能与分子机制以及开发新型治疗策略的基础。传统的原代成纤维细胞获取方法存在诸多局限性，如细胞状态不佳、混杂其他类型细胞以及易受污染等。本文介绍一种经过优化且易于重复的实验方案，可有效减少获取成纤维细胞过程中可能出现的问题。在本方案中，分离后5天即可观察到成纤维细胞，培养10天后细胞融合度可达近80%。随后对细胞进行传代，并利用PDGFRα和vimentin抗体进行免疫荧光检测，以及CD90抗体进行流式细胞术鉴定。综上所述，该方案可简便地获得瘢痕疙瘩组织来源的成纤维细胞，为瘢痕疙瘩研究在实验室中提供充足且稳定的细胞来源。

引言

瘢痕疙瘩是一种纤维增生性疾病，表现为斑块持续生长，常侵入周围正常皮肤，且无自限性，给患者带来不同程度的瘙痒、疼痛以及外观和心理负担1。成纤维细胞是瘢痕疙瘩中的主要细胞，在该疾病的发生和发展中起关键作用，其特征为过度增殖、细胞外基质过度产生以及胶原排列紊乱2,3。然而，其潜在的发病机制尚不明确，目前仍缺乏有效的治疗方法，因此迫切需要进一步开展相关研究4,5。

由于目前尚无理想的瘢痕疙瘩研究动物模型 体内6,7，构建一个 体外 通过获取瘢痕疙瘩组织中的原代成纤维细胞建立模型，可为瘢痕疙瘩研究提供可行性和可靠性2,6原代细胞是从活体组织直接分离的细胞，通常认为与细胞系相比，这些细胞更能接近多个个体的生理状态和遗传背景8,9培养原代细胞为研究细胞的生长、代谢及其他细胞表型提供了有力手段。

目前，获取原代成纤维细胞的方法主要有两种：酶消化法和组织块培养法。然而，在获取原代成纤维细胞的过程中已发现若干障碍，例如存在多种细菌或真菌污染的风险, 与其他不易去除的细胞类型混合, 培养周期长，以及细胞特性相较于原始细胞发生的后续变化等9因此，建立一种可行且高效的方法来获取原代成纤维细胞，是进一步研究与应用的基础。本研究描述了一种优化的从瘢痕疙瘩组织中提取原代成纤维细胞的方案，可有效且稳定地获得纯度高、活性好的成纤维细胞。

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方案

本研究经南方医科大学皮肤病医院伦理审查委员会批准（批准号：2020081）。在采集个体组织样本前，已获得患者的知情同意。

1. 准备

注意：以下操作应在生物安全柜内的无菌环境中进行。

  1. 通过向高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液（PSA），配制完全培养基。
  2. 通过向 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 1% PSA，配制含 PSA 的 PBS 溶液；通过向 1× PBS 中加入 1% FBS，配制含 FBS 的 PBS 溶液。
  3. 通过高压灭菌法准备若干灭菌的剪刀、镊子和手术刀。

2. 获取移除的组织

  1. 通过手术获取瘢痕疙瘩患者的组织。将新鲜的瘢痕疙瘩组织收集到无菌包装袋或无菌离心管中，并尽快转移至实验室的生物安全柜中。
    ​注意：在本方案中，所获取的瘢痕疙瘩组织大小约为 ~20 x 20 x 10 mm3，具体尺寸可能因手术情况而异。

3. 分离

  1. 用无菌镊子取出瘢痕疙瘩组织，放入含有10-25 mL添加1% PSA的PBS的50 mL无菌离心管中，浸泡10分钟。然后准备一块6孔板，每孔加入4 mL含1% PSA的PBS。用无菌镊子取出组织，用含1% PSA的PBS洗涤两次。使用无菌镊子将组织依次从一个孔转移到下一个孔。
  2. 使用手术剪刀或手术刀去除脂肪和表皮层，保留真皮层不受损伤。用剪刀将真皮层修剪并分割成3-5 mm2大小的组织块，用无菌镊子将这些组织块转移至下一孔中，并再次用含1% PSA的PBS溶液洗涤。

4. 培养

  1. 使用无菌镊子将真皮组织块放入培养皿中；确保组织块数量在10至30块之间，每块之间的距离>5 mm。将培养皿倒置，置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育30–60分钟，直至组织块略微干燥并粘附于培养皿底部。随后加入含10% FBS和1% PSA的DMEM完全培养基，并小心将培养皿放回37 °C、含5% CO2的培养箱中。
    注意：成纤维细胞是一类在形态和功能上均具有异质性的细胞群体。鉴于其复杂性，组织分离与培养操作需格外谨慎；应均匀选取瘢痕疙瘩真皮组织块，并在放入培养皿前充分混匀。
  2. 3天后，更换一半上清液为完全培养基。此后每2–3天更换一次培养基。每天在40倍显微镜下观察成纤维细胞生长情况。
    注意：所有操作均应轻柔进行。组织分离后前2天内避免移动培养皿，以便组织块有足够时间牢固粘附于培养皿表面。
  3. 当围绕组织块生长的成纤维细胞融合度达到约90%时，移除组织块及培养基。用无菌1×PBS洗涤细胞，每孔加入2 mL无菌1×胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养皿置于37 °C、湿润的5% CO2培养箱中孵育约3–5分钟。轻轻敲击培养皿，于显微镜下观察；当大部分细胞从培养皿表面脱落时，立即加入2 mL完全培养基终止消化反应。
  4. 将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，在室温下以300 × g离心3分钟。小心弃去上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀。将成纤维细胞接种至9 cm细胞培养皿中，置于37 °C、湿润的5% CO2培养箱中继续培养。

5. 维持与保存

  1. 大约3-4天后，当成纤维细胞生长至80%融合度时，重复步骤4.2-4.4，并以1:3的比例传代成纤维细胞。使用传代后的成纤维细胞进行后续实验。
    ​注意：成纤维细胞培养传代次数不应超过10代，因为细胞可能开始表现出与原始细胞不同的特性。
  2. 将P1-P3代的传代细胞用液氮冻存，以备后续使用。
    1. 重复步骤4.2-4.3。将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，在300 × g 条件下离心3分钟。小心弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL细胞冻存液（含90% FBS和10% DMSO）中，然后将悬液转移至细胞冻存管中。
    2. 将冻存管放入冻存盒中，随后将冻存盒置于−80 °C冰箱中。24小时后，将细胞转移至液氮中进行长期保存。

6. 通过免疫荧光染色鉴定成纤维细胞

  1. 将圆形盖玻片放入24孔板中，以1 × 104 个细胞/孔的浓度接种传代的成纤维细胞。当成纤维细胞融合度达到60%时，吸除培养基。加入1 mL 4%多聚甲醛，在室温下固定成纤维细胞20分钟，随后用PBS洗涤3次，每次1分钟。
    注：使用血细胞计数板在显微镜下或使用自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。
  2. 吸除PBS，加入0.5% Triton X-100孵育20分钟以通透细胞膜，然后用PBS洗涤3次，每次1分钟。加入含0.5%牛血清白蛋白的PBS，浸泡30分钟。随后吸除溶液，加入以抗体稀释液按1:1,000比例稀释的PDGFR-α/vimentin一抗。4 °C条件下孵育过夜。
  3. 次日，吸除一抗，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟，然后加入以抗体稀释液按1:200比例稀释的Alexa Fluor-555标记的山羊抗兔IgG二抗，浸泡孵育1小时。
  4. 吸除二抗，用PBS洗涤细胞3次。用镊子取出圆形盖玻片，置于载玻片上，每张盖玻片上加50 µL浓度为5 µg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，染色细胞核。将样品置于湿润避光盒中，于激光共聚焦荧光显微镜下观察。
    ​注：设置不加一抗但加二抗的阴性对照组，以排除非特异性染色。

7. 通过流式细胞术鉴定成纤维细胞

  1. 将细胞沉淀收集至1.5 mL无菌离心管中，加入含1% FBS的PBS 50 µL重悬。避光孵育抗CD90抗体30分钟，并在对照组中加入抗IgG同型对照抗体。随后加入含1% FBS的PBS 200 µL，于4 °C、300 × g离心10分钟。
  2. 弃去上清液，加入含1% FBS的PBS 200 µL。重悬细胞后经细胞筛（70 µm）过滤。向滤液中按1:100比例加入终浓度为5 µg/mL的DAPI储存液，然后进行流式细胞术检测。以正向散射光（FSC）为横坐标，侧向散射光（SSC）为纵坐标，圈选主要细胞群。选定该细胞群后，以藻红蛋白（phycoerythrin）为横坐标，细胞数量为纵坐标进行分析。

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结果

该实验方案的时间线总结于图1A中。图中还展示了分离过程的一些代表性图像（图2）；表皮层和脂肪层被小心去除后，将真皮层剪切成3-4 mm2的小片段，并接种至培养皿中。

如图3A所示，在组织块处理后第5天，显微镜下可观察到多个组织块出现成纤维细胞的迁出。如图3B所示，成纤维细胞增殖迅速，10天后达到较高的融合度。这些成纤维细胞呈细长的梭形细胞体，在达到较高融合度时排列成束状。按照本方案操作，成纤维细胞可在2–3周内传代并扩增至所需数量。

为验证成纤维细胞的身份和纯度，采用免疫荧光染色法检测成纤维细胞特异性标志物 PDGFRα10 和波形蛋白（vimentin）。如预期所示，图 4A 和

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讨论

从瘢痕疙瘩组织中获取原代成纤维细胞是进一步研究的关键基础。迄今为止，获取原代成纤维细胞的方法主要有两种：酶消化法和组织块培养法11,12,13,14。然而，这两种传统方法均存在局限性，例如易受污染、混入其他类型细胞、培养周期较长以及成功率较低15,16。本研究介绍了一种优化的方法，并提供了明确的操作步骤，以解决现有难题，提高瘢痕疙瘩成纤维细胞分离与培养的成功率。

微生物污染的可能性是获取原代成纤维细胞过程中的主要问题之一。所有器械和溶液都必须经过灭菌处理，并在整个实验方案的各个步骤中严格执行无菌操作技术。本方案中包含保持无菌操作的提示，以降低污染风险。第一个关键步骤是组织分离过程；将组织浸泡在添加了1% PSA的...

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披露

不存在任何利益冲突需要声明。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号 81903189 和 82073418）以及广州市科技计划项目（项目编号 202102020025）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 无菌离心管JETBIOFILCFT002015
15 mL 无菌离心管JETBIOFIL8076
4% 多聚甲醛Beyotime BiotechnologyP0099细胞固定
50 mL 无菌离心管JETBIOFIL8081放置瘢痕疙瘩组织
Alexa Fluor-555 山羊抗兔 IgG AbcamAlexa Fluor 555 免疫荧光染色实验的二抗
抗人 CD90 抗体BioLegendB301002鉴定成纤维细胞纯度
抗体稀释液Beyotime BiotechnologyP0262
生物安全柜 Thermo Scientific1300 系列 A2细胞分离与培养
牛血清白蛋白aladdinB265993免疫荧光染色实验的封闭
二氧化碳培养箱ESCOCCL-170B-8用于细胞培养
细胞冻存管Corning43513低温保存细胞
离心机Thermo FisherST 16R弃去上清液 
DAPIBeyotime BiotechnologyC1006细胞核染色
DMSOMP Biomedicals196055用于细胞保存
杜氏改良伊格尔培养基GibcoC11995500BT培养基溶液
胎牛血清BI04-001-1A
流式细胞仪BDBD FACSCelesta观察细胞特性
冻存盒Thermo Scientific 5100-0050
倒置显微镜NikonECLIPSE Ts2
激光共聚焦显微镜NikonAIR-HD25观察免疫荧光染色结果
PDGFR-α 抗体CST3174T免疫荧光染色实验的一抗
青霉素-链霉素-氨苄溶液SolarbioP1410加入培养基溶液中以防止污染
培养皿JETBIOFIL7556培养成纤维细胞
磷酸盐缓冲液GibcoC10010500BT培养基溶液
兔（DAIE）单克隆 IgG XR（R）同型对照（PE）Cell Signaling Technology5742S作为流式细胞术的对照
圆形盖玻片Biosharp801007细胞培养
Triton X-100SolarbioT8200在细胞膜上打孔
胰蛋白酶-EDTAGibco25200072用于细胞传代
波形蛋白抗体Abcamab8978免疫荧光染色实验的一抗

参考文献

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