基于Box-Behnken设计结合熵法的高原青稞酒铁板廚加工优化

Summary

本协议描述了一种基于Box-Behnken设计响应面结合熵法优化高原大麦酒铁棒翠加工工艺的有效方法。

Abstract

有毒民族药物的加工对其安全临床应用具有重要意义。因此，应解决传统加工的局限性，并应使用现代研究方法对民族药物的加工方法进行标准化。本研究对常用藏药铁板翠（TBC）的加工工艺进行了优化，即 乌头摆布希的干根，用高原大麦酒加工而成。以二酯-二萜类生物碱（DDA）（乌头碱、3-脱氧乌头碱、3-乙酰乌头碱）和单酯-二萜类生物碱（MDA）（苯甲酰乌头碱）含量为评价指标，采用熵法确定各评价指标的权重系数。

采用单因素试验和Box-Behnken设计，研究了高原青稞酒与TBC配比、TBC切片厚度和加工时间的影响。根据熵法确定的各指标的客观权重进行综合评分。TBC与高原青稞酒的最佳加工条件为:高原青稞酒用量是TBC的5倍，浸泡时间为24 h，TBC厚度为1.5 cm。结果表明，验证试验与预测值的相对标准偏差小于2.55%，高原青稞酒TBC加工优化工艺简单、可行、稳定，可为工业化生产提供参考。

Introduction

铁板翠（TBC）是乌头摆布希的干根，是一种著名的藏药，最初记录在经典藏医书籍"四药密宗"^1,2中。根据《中华人民共和国卫生部药品标准（藏医）》，TBC具有祛寒、止痛、祛风、镇静休克等功效，常用于治疗临床类风湿性关节炎3、^4、5。

TBC主要含有生物碱，包括剧毒的二酯-二萜类生物碱（DDAs）和中毒性单酯-二萜类生物碱（MDAs）^6,7,8。这些化学成分是具有药用作用的活性成分，但有毒。最著名的活性和有毒成分之一乌头碱在超过1mg⁹时会引起中毒。因此，TBC使用不当或过量可能导致中毒甚至死亡，TBC的毒性减弱和疗效储备对其安全临床应用至关重要^10,11。

处理是排毒TBC的有效方法。据古代藏医书籍记载，用高原大麦酒加工是减轻毒性、保持TBC功效的有效方法。TBC浸泡在高原大麦酒中，储存一晚，干燥，并添加到药物^中12。然而，具体的加工工艺和潜在影响因素很少报道，传统的加工工艺往往依赖经验，缺乏标准化的方法。因此，需要现代科学技术方法来优化和标准化加工过程。

Box-Behnken设计方法用于通过二次多项式拟合研究不同因素之间的相互作用及其对综合评分的影响。这种设计允许直观地观察最佳条件，并已广泛应用于药学领域¹³。例如，基于熵法的Box-Behnken设计方法成功优化了姜黄¹⁴醋炒加工工艺。本研究采用Box-Behnken响应面实验设计结合熵法优化了高原大麦酒TBC加工工艺。优化的加工技术有望确保质量控制和安全的临床使用。

Protocol

本研究采用Box-Behnken设计结合熵法优化了高原青稞酒TBC加工工艺。以DDA和MDA含量为评价指标，采用熵法确定各评价指标的权重系数。

1. 实验准备

1. 准备高原大麦酒¹⁵.
   1. 取500.00克黑高原大麦米，加入五倍量的水。煮米饭直到剩余的水被吸收（~2小时）。倒出，待温度降至37°C，加入酒曲4克（见 材料表），拌匀，封罐，用棉絮包裹容器，炖7天。
   2. 在第 7 天加入 300 mL 水并再次密封。在第 8 天，开始取出葡萄酒，然后用 300 毫升水代替。密封发酵1天，取酒，再次加入300毫升水。重复此过程三次并混合酒。
   3. 煮沸，然后把火调小，继续煮，直到剩余的水被吸收。
2. 制备加工品时，将TBC准确称取容器，加入高原大麦酒，浸泡1天。然后，在恒温电烘箱中干燥。
   注意:干燥温度应低于40°C，以避免生物碱组成发生变化。
3. 准备测试样品溶液。
   1. 在锥形瓶中准确称取TBC处理产物粉末（2 g），加入40%氨溶液，并用异丙醇 - 乙酸乙酯（1:1）混合溶剂（50 mL）（功率:200 W;频率:40 kHz;温度:40°C）进行超声辅助提取30分钟。
      注意:要制备40%氨溶液，请将40 mL氨转移到100 mL容量瓶中，然后用纯水稀释。
   2. 通过加入异丙醇-乙酸乙酯混合物（1:1 v / v）将提取的溶液调整到原始重量。
   3. 将提取的溶液（25 mL）准确地转移到圆底烧瓶中，以减压回收溶剂直至干燥。
   4. 最后，转移0.05%盐酸-甲醇溶液，将步骤1.3.3的残留物溶解在5 mL容量瓶中，并用0.05%甲醇盐酸盐溶液稀释。在注入高效液相色谱（HPLC）系统之前，通过0.22μm微孔膜过滤器过滤溶液。
      注意:通过将0.05mL盐酸加入100mL容量瓶中来制备0.05%甲醇盐酸盐酸，然后用甲醇稀释。
4. 通过准确称取5.18mg苯甲酰乌头碱，13.13mg乌头碱，10.05mg3-脱氧乌头碱和10.09mg3-乙酰乌头碱制备标准溶液，然后将固体单独放入5mL容量瓶中。用0.05%甲醇盐酸盐溶液稀释。

2. 色谱条件

1. 设置色谱条件，如 表1 所示，用于HPLC。所用仪器的详细信息在 材料表中提供。

3. 系统适应性测试

1. 线性度范围
   注意:首先，我们使用HPLC测定样品中苯甲酰乌头碱，乌头碱，3-脱氧乌头碱和3-乙酰乌头碱的峰面积，然后随机确定一种已知浓度的标准溶液的峰面积。接下来，我们比较两个峰面积（样品溶液和标准溶液）之间的差异，以估计不同样品中苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱和3-乙酰乌头碱的浓度，然后将标准溶液调整为线性范围，以将样品的浓度包括在曲线中。标准曲线浓度如 表2所示。
   1. 制备含有1.036 mg/mL、0.518 mg/mL、0.2072 mg/mL、0.1036 mg/mL和0.0518 mg/mL的苯甲酰乌头碱对照品溶液。
   2. 制备含有1.313 mg/mL、0.5252 mg/mL、0.2626 mg/mL、0.1313 mg/mL和0.05252 mg/mL的乌头碱对照溶液。
   3. 制备含有1.005 mg/mL、0.5025 mg/mL、0.201 mg/mL、0.1005 mg/mL和0.402 mg/mL的3-脱氧乌头碱对照品溶液。
   4. 制备含有0.2018 mg/mL、0.1009 mg/mL、0.04036 mg/mL、0.02018 mg/mL和0.01009 mg/mL的3-乙酰乌头碱对照品溶液。
   5. 通过绘制峰面积与进样浓度的关系图来研究每种化合物的线性。
2. 要进行精密度测试，将每种参比溶液的10 μL每天6次注入HPLC系统中，并采用步骤2.1中所述的相同HPLC条件运行样品 记录每种组分的峰面积。
3. 通过步骤1.3 注入 10μL制备的样品溶液进行日内稳定性测试，并在0小时，2小时，4小时，8小时，14小时，12小时和24小时¹⁶后确定峰面积。
4. 根据步骤1.3，通过取同一批次TBC的六个样品来制备测试样品溶液，进行重现性测试。将每个样品的 10 μL 注入 HPLC 系统，并按照步骤 2.1 中的说明运行样品。
5. 执行恢复测试以评估方法的准确性。在供试品溶液中加入各指示组分（苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱、3-乙酰乌头碱）的标准溶液100%，分别计算回收率。例如，如TBC样品中苯甲酰乌头碱的含量为0.1524mg/mL，精密称取苯甲酰乌头碱标准品0.1524mg并加入TBC样品中，然后按步骤1.3制备供试样品溶液。使用步骤2.1中描述的相同HPLC条件运行这些样品。使用公式（1）计算回收率:
   （1）
   这里，A是供试品溶液中待测组分（苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱或3-乙酰乌头碱）的量，B是标准品（苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱或3-乙酰乌头碱）的添加量，C是含有标准溶液和供试溶液的溶液的测定值（见表3).有关执行上述步骤的色谱条件，请参阅步骤2.1。回收率反映了样品分析过程中目标组分（苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱或3-乙酰乌头碱）的损失程度;回收率越高，目标组件的损耗越低。

4. 高原大麦酒加工TBC单因素试验

注意:高原大麦酒与TBC的比例，TBC的切片厚度和浸泡时间将影响TBC中更多有毒成分（乌头碱，3-脱氧乌头碱和3-乙酰乌头碱）在TBC中的溶解 用高地大麦酒¹⁷。采用单因素试验和Box-Behnken设计考察高原青稞酒与TBC比值、TBC切片厚度和浸泡时间的影响。

1. 通过设置五组测试进行高原大麦酒添加测试（A），每组测试含有30克TBC，其中高原大麦酒的量是配方中TBC量的两倍，三倍，四倍，五倍和六倍。浸泡时间为12小时，切片^{1.0厘米厚18}。
   注意:相同条件测试的每组应分三个平行组进行处理。
2. 通过设置五组测试来执行浸泡时间测试（B），每组测试含有30克TBC。浸泡时间为12 h、24 h、36 h和48 h。高原大麦酒的量是TBC的五倍，切片厚^1.0厘米19。
   注意:相同条件的每组实验应分三个平行组处理。
3. 通过设置五组测试来执行切片厚度测试（C），每组测试含有30克TBC。切片厚度分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5厘米，浸泡时间为24 h，高原大麦酒的量是TBC²⁰的五倍。
   注意:相同条件的每组实验应分三个平行组处理。
4. 准确称取各试验组的加工产品，按步骤1.3制备供试样品溶液。通过HPLC确定每个样品的峰面积，并使用标准曲线估计MDA和DDA的量。在标准曲线中，y是峰面积，x是含量。MDAs的含量是苯甲酰乌头碱，DDAs的含量是乌头碱、3-脱氧乌头碱和3-乙酰乌头碱的总和。
5. 以DDAs的总含量和MDAs的含量作为评价指标，通过熵法 确定 各评价指标的权重系数和综合评分（第5节）。
   注意:TBC有毒，因此在加工过程中应采取保护措施。

5.熵法计算综合评分

注意:我们以单因素测试中切片厚度测试的实验数据为例，详细说明计算过程。我们使用补充表S1中每个样品中组分的峰面积和表2中的标准曲线来计算MDA和DDA的含量（参见补充表S2）。 在线性方程中，y是峰面积，x是含量。本研究以中毒性MDA（苯甲酰乌头碱）为阳性指标，以高毒性DDAs（乌头碱、3-脱氧乌头碱、3-乙酰乌头碱）总含量为阴性指标。MDAs的含量是苯甲酰乌头碱，DDAs的含量是乌头碱、3-脱氧乌头碱和3-乙酰乌头碱的总和。每个样本有两个评估指标:i = 1,2,...,n，j = 1,2,...米²¹.

1. 使用公式（2）来标准化MDA的内容²².
   （二）
   因此
   注意:Xij 是第 i 个样本的第 j 个指标的值。Xij* 是 Xij 的标准化值。例如，i = 3 且 j = 1，X₃₁ 表示第三个样本中第一个指标的值，是第三个样本中第一个指标的标准化值。
2. 使用公式（3）来标准化DDA的总内容²³.
   （三）
   
   注意:这里，i = 3，j = 2，表示第三个样本的第二个指标。 是第三个样本中第二个指标的标准化值。 见 补充表S3。
3. 使用等式 （4） 和 （5） 定义每个指标²³ 的熵值 （Hj）。
   1. 使用等式 （4） 计算第 i 个评估指标 P_ij 下第 j 次试验的概率。
      （四）
      对于数字 3，
      
      
      注意:第三个样本的第一个指标和第二个指标的概率值分别为 0.2374 和 0.2812。 见 补充表S3。
   2. 计算信息熵 H_j。
      （五）
      
      
      注意: H₁ 是切片厚度测试中第一个指标 （MDA） 的熵， H₂ 是第二个指标 （DDA） 的熵。
4. 使用公式 （6） 计算指标权重 （Wj）²³。
   （六）
   = 33.3%
   = 66.7%
   注: W_j是每个指标的权重系数。在切片厚度测试中，正指标（MDAs）和负指标（DDAs）的权重系数分别为33.3%和66.7%。
5. 使用公式（7）计算指标²³的综合评分。
   （七）
   对于数字 3，
   
   注:S_i 是每个样本的综合评分。我们需要获得最高分作为Box-Behnken设计的核心点。S ₁、S ₂、S ₃、S₄ 和 S₅ 显示在补充表 S3 中。

6. 箱式贝恩肯设计

1. 通过单因素检验，使用综合评分最高的条件（见表4、表5、表6、图2）作为响应面的中心点。以高原青稞酒用量（A）、浸泡时间（B）、TBC（C）切片厚度为影响因素，综合评分为响应值²⁴.
   注:根据表4、表5、表6中的单因素数据，通过第5节的等式（2）、（3）、（4）、（5）、（6）、（7）计算出最高综合得分，得到最佳分数。高原青稞酒用量是TBC的5倍，浸泡时间为36 h，切片厚度为1.0 cm。

7. 博斯-本肯设计软件操作步骤

1. 打开软件（参见 材料表）并选择 "新建设计 |Box-Behnken 设计 （参见步骤 5.1; 补充文件1）。
   1. 输入影响因素的数量，输入水平信息（三级三因素;见 表7）。Box-Behnken设计由本研究中的17个实验组成。最后，单击 继续 （请参阅步骤 5.2; 补充文件1）。
   2. 将第 5 节中的等式 （2）、（3）、（4）、（5）、（6） 和 （7） 的综合评分 （Y） 设置为响应。输入响应值的数量（图像仅显示一个响应值），然后单击完成（请参阅步骤5.3;补充文件1）。
   3. 根据设计结果处理高原大麦酒TBC，并根据针对响应面设计的17个场景完成实验。
   4. 按照步骤1.3制备样品溶液，并通过HPLC系统计算MDA和DDA的总含量。
   5. 在步骤5中通过等式（2）、（3）、（4）、（5）、（6）和（7）计算每组的综合评分，并输入得分结果（见步骤5.4;补充文件1）。
2. 单击 分析 以分析日期和模型信息（参见步骤5.4.1; 补充文件1）。
   1. 对软件获得的 3D 模型图中绘制的多项式方程和响应面分析进行统计验证。
   2. 单击顶部菜单中的 方差分析 并观察结果表。
3. 单击 "优化 "，查看预测的最佳工艺条件（参见步骤5.4.2; 补充文件1）。

8. 验证测试

1. 根据Box-Behnken响应面设计预测的结果，在步骤7.3中，确定TBC的最佳加工条件。这里，如下:TBC在五倍于高原大麦酒的量中浸泡24小时，TBC的厚度为1.5厘米。以最佳影响因素水平为加工条件，设置三组平行实验，验证加工工艺的稳定性。

Results

本研究对TBC的精密度、稳定性、重复性和样品回收率表明该方法是可行的。TBC中的4种指标组分在特定浓度范围内具有良好的线性关系。典型色谱图如图 1所示。精密度测试结果（表8）显示，苯甲酰乌头碱、乌头碱和3-脱氧乌头碱峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为2.56%、1.49%和2.03%，3-乙酰乌头碱的峰面积相对标准偏差（RSD）分别为0.21%，表明仪器精密度良好。进行24小时（n = 6）的稳定性研究表明，苯甲酰乌头碱，乌头碱，3-脱氧乌头碱和3-乙酰乌头碱的相对标准偏差值分别为2.76%，2.21%，2.98%和2.31%（表9），表明样品溶液稳定24小时。重复性测试结果（表10）显示，苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱和3-脱氧乌头碱峰面积的RSD分别为2.80%、2.92%、2.92%和2.07%，表明该方法的重复性良好。回收率实验结果表明，苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱和3-脱氧乌头碱的平均回收率分别为99.7%、100.84%、103.27%和100.92...

Discussion

作为一种具有毒性作用的常用藏药，加工的毒性减弱作用对TBC的临床应用极为重要²⁵。本研究优化了高原青稞酒TBC加工工艺。通过回顾TBC的主要活性成分并关联TBC的药理作用，我们发现TBC生物碱具有抗炎和镇痛作用，可用于治疗类风湿性关节炎。在这项研究中，使用中毒性MDA作为阳性指标。DDA的总含量被用作负面指标。采用熵法计算指标权重，优化处理工艺²⁶。

在实验过程中，应特别注意两点。首先，单个因子的每个条件需要三组平行的实验，以提高后续结果的准确性。其次，在综合得分的计算中，将每个指标的标准化值乘以加权因子而不是原始数据。此过程可确保计算结果的准确性。此外，方差分析中的 R² 值应尽可能接近 1;否则，因素水平非常接近，对结果影响不大;级别之间的差异应该适中。

虽然采用多指标综合评分结合响应面法保证了TBC处理过程的精确预测，但确实存在局限性。首先，当实验室使用HPLC测量药材中的指示成分时，由于实验规模小，可能...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乌头碱	成都普什生物科技有限公司	PS000905
3-乙酰乌头碱	成都普什生物科技有限公司	PS010552
3-脱氧乌头	成都普什生物科技有限公司	PS011258
苯甲酰康	成都普什生物科技有限公司	PS010300
循环水真空泵	巩义市裕华仪器有限公司	SHZ-DIII
Design-Expert	国东公司	8.0.6
电恒温干燥箱	上海跃进医疗器械有限公司	101-3-BS
电子分析天平	上海良平仪器有限公司	FA1004
高效液相色谱仪	岛津企业管理（中国）有限公司	岛津2030
高原大麦稻	省甘孜藏族自治州康定市	20221015
米利波尔过滤器	天津金腾实验设备有限公司	;13 0.22 尼龙66
旋转蒸发器	上海亚荣生化仪器厂	RE-2000A
造酒启动	器 天使酵母有限公司	BJ22-104
超纯水系统	默克美利波尔有限公司	Milli-Q
超声波清洗机	宁波信义超声波设备有限公司	SB-8200 DTS