分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

摘要

本方案描述了一种从Sprague Dawley大鼠中分离和鉴定脂肪组织来源的间充质干细胞（MSCs）的方法。

摘要

近年来，成体间充质细胞彻底改变了分子与细胞生物学领域。除了具有强大的自我更新、迁移和增殖能力外，它们还能分化为多种特化的细胞类型。脂肪组织是间充质细胞最易获取且侵入性最小的来源之一。已有报道表明，与其他来源相比，脂肪组织不仅能获得更高的细胞产量，还具有更优越的免疫调节特性。近期，已有多种从不同组织来源和动物物种中获取成体间充质细胞的方法被发表。在评估部分研究者所采用的标准后，我们建立了一种适用于多种用途且易于重复的标准方法。通过收集肾周和附睾周围脂肪组织的基质血管组分（SVF），我们成功建立了形态和功能均理想的原代细胞培养体系。细胞在接种后24小时即可见贴附于塑料培养表面，呈现成纤维细胞样形态，具有突起并倾向于形成集落。采用流式细胞术（FC）和免疫荧光（IF）技术检测了细胞膜标志物CD105、CD9、CD63、CD31和CD34的表达情况。此外，还通过诱导因子混合物（4 µM 胰岛素、0.5 mM 3-甲基-异丁基-黄嘌呤和1 µM 地塞米松）评估了脂肪源性干细胞（ASCs）向脂肪细胞谱系分化的潜能。诱导48小时后，细胞逐渐失去成纤维细胞样形态；至第12天，油红染色证实脂滴形成。综上所述，本研究提出了一种可获得形态良好且功能完整的ASC培养物的操作流程，适用于再生医学领域的应用。

引言

间充质干细胞（MSCs）因其强大的自我更新、增殖、迁移以及向不同细胞谱系分化的能力，对再生医学产生了深远影响^1,2。目前，大量研究正聚焦于其在多种疾病治疗与诊断中的潜在应用。

间充质细胞的来源多种多样，包括骨髓、骨骼肌、羊水、毛囊、胎盘和脂肪组织等。这些细胞可从不同物种中获得，包括人类、小鼠、大鼠、狗和马³。多年来，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）一直是再生医学中干细胞的主要来源，也是胚胎干细胞应用的一种替代选择⁴。然而，脂肪组织来源的间充质干细胞（ASCs），即脂肪源性干细胞，因其易于采集和分离，以及每克脂肪组织可获得较高的细胞产量，已成为一种具有显著优势的重要替代来源^5,6。据报道，ASCs的收获率通常高于BMSCs⁷。最初认为ASCs的修复/再生能力源于其向其他细胞谱系分化的潜能⁸。然而，近年来的研究进一步强调了ASCs释放的旁分泌因子在其修复潜力中的主导作用^9,10。

脂肪组织（AT）除了作为能量储备外，还与内分泌系统、神经系统和心血管系统相互作用。它还参与出生后的生长发育、组织稳态的维持、组织修复及再生过程。脂肪组织由脂肪细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、前脂肪细胞以及ASCs构成。其中，ASCs由于具有较低的免疫原性，在再生医学中发挥着重要作用^11,12。ASCs可通过酶消化结合机械处理法或脂肪组织外植块法获得。ASCs的原代培养易于维持、生长和扩增。对ASCs进行表型表征至关重要，可通过免疫荧光和流式细胞术等方法检测特定膜表面标志物的表达，以确认细胞身份¹³。国际脂肪治疗与科学联合会（IFATS）和国际细胞治疗学会（ISCT）规定，ASCs应表达CD73、CD90和CD105，而不表达CD11b、CD14、CD19、CD45和HLA-DR¹⁴。因此，这些阳性与阴性标志物被公认为ASCs表征的可靠依据。

本项目旨在描述一种从大鼠脂肪组织（AT）中分离和鉴定成体间充质细胞的方法，因为与胚胎干细胞不同，这种细胞来源不存在伦理问题。由于获取方便且相较于骨髓来源的干细胞更具微创性，该方法成为一种可行的选择。

来源于该组织的间充质细胞因其免疫调节能力和较低的免疫排斥反应，在再生医学中具有重要作用。因此，本研究是未来探索其分泌组及其在包括糖尿病等代谢性疾病在内的多种疾病中作为再生治疗应用的基础性工作。

方案

所有实验操作均遵循墨西哥动物护理指南，该指南基于国际实验动物护理评估与认证协会的建议（墨西哥官方标准 NOM-062-200-1999，墨西哥）。本方案已提交并获得卫生研究伦理委员会的审查、批准和注册 墨西哥社会保险研究所（R-2021-785-092）

1. 通过手术切除法去除大鼠的脂肪组织

1. 准备两个锥形管，每管加入20 mL无菌1×磷酸盐缓冲液-抗生素-抗真菌溶液（1×PBS，庆大霉素[20 µg/mL]，两性霉素[0.5 µg/mL]），置于冰上保存。
2. 选择两只成年雄性Sprague Dawley大鼠 （挪威褐鼠） 健康状况良好。确保大鼠年龄在3至4个月之间，体重为350-450 g。
3. 以20 mg/kg的盐酸赛拉嗪进行镇静，5分钟后，腹腔注射120 mg/kg的盐酸氯胺酮进行麻醉。 用眼膏润滑双眼 以防止干燥。然后， 通过脚趾反射消失确认麻醉深度。 
4. 剃除腹部和腹股沟区域的毛发，并用碘溶液消毒。 使用手术巾以维持无菌环境。然后，从胸骨至睾丸区域做一正中纵向切口。
5. 用无菌镊子去除附着在附睾和肾脏周围的脂肪组织，并置于1x PBS-AA溶液中。将样品置于冰上保存。
6. 缝合切口 若需要则关闭 的 机构指南 以40 mg/kg的戊巴比妥钠经心内注射处死动物。确认死亡后，处理尸体 随后 机构程序
   注意：死亡 引发 影响免疫表型、分化能力的信号机制 间充质细胞的旁分泌效应。因此， 在实施安乐死前进行组织采集。 

2. 从脂肪组织中分离间充质细胞

1. 在生物安全柜内使用无菌镊子去除脂肪组织，并将其置于直径100 mm培养皿中的无菌滤纸上，以吸收多余的PBS。
2. 将脂肪组织转移至另一个培养皿中，使用10 mL移液器加入10 mL 1× PBS-AA溶液，洗涤3次，每次5分钟。
3. 使用剪刀和解剖刀将组织机械性地切碎成约1 cm²大小的片段。
4. 在20 mL未添加补充物的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中配制IV型胶原酶（0.075%），经0.22 µm注射器滤器过滤后，置于37 °C环境中保温备用。
5. 将步骤2.4中配制的胶原酶溶液（20 mL）加入含有组织碎片和磁力搅拌子的烧杯中，密封容器后于37 °C下缓慢持续振荡孵育。
   注意：酶消化过程约需90分钟（保持缓慢搅拌以维持细胞膜完整性）。
6. 将消化后的匀浆液通过置于100 mm培养皿上的不锈钢40目（孔径0.38 mm）滤网过滤，收集细胞悬液至无菌50 mL锥形离心管中。
7. 加入20 mL预热的含补充物DMEM培养基（含10%胎牛血清[FBS]、2 mM谷氨酰胺、2 mM丙酮酸钠、100×非必需氨基酸溶液和100×抗生素-抗真菌溶液[AA]），轻轻悬浮基质血管组分（SVE）。
8. 将细胞悬液在290 × g条件下离心10分钟，用25 mL移液器弃去上清液，再用40 mL未添加补充物的DMEM培养基轻柔洗涤细胞一次。
9. 重复此步骤一次。每次操作之间更换新的无菌锥形离心管，以尽量减少细胞碎片和脂肪残留的转移。
10. 用5 mL移液器将细胞沉淀重悬于5 mL含补充物的DMEM培养基中，转移至T-25 cm²培养瓶，于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
11. 次日，用5 mL预热的1× PBS-AA溶液洗涤3次，再用未添加补充物的DMEM洗涤2次，以去除细胞碎片和非贴壁细胞。用5 mL移液器加入5 mL新鲜预热的含补充物DMEM培养基，并每3–4天更换一次培养基。

3. ASC 原代培养物的维持与扩增

1. 当细胞达到 90%–100% 汇合度（8 ± 2 天）时，用 5 mL 未添加补充物的 DMEM 洗涤两次。加入 1 mL 预热的 0.025% 胰蛋白酶-2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 下孵育 5–7 分钟。
2. 当细胞单层脱落时，加入 4 mL 添加补充物的 DMEM，并轻轻吹打使细胞悬浮液分散均匀。
3. 将细胞悬浮液转移至 15 mL 锥形离心管中，加入 5 mL 预热的添加补充物的 DMEM，轻轻混匀以使细胞重悬均匀。
4. 在 290 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL 添加补充物的 DMEM 轻轻重悬细胞沉淀。经台盼蓝染色后，使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）进行细胞计数。
5. 最后，以 1:4 的传代比例，在 T-75 培养瓶中以 2.5 × 10³ 个细胞/cm² 的密度接种细胞。此步骤可确保克隆形成及高增殖率。

4. ASC 原代培养物的形态学表征

1. 在倒置显微镜下观察ASCs的形态。
   注意：在进行组织学制片和ASC鉴定之前，需用1%明胶溶液处理盖玻片，并用紫外线照射15分钟。
   1. 将盖玻片从70%乙醇溶液中取出，室温下晾干5分钟。
   2. 将盖玻片浸入无菌的1%明胶溶液中，沥干后于室温（RT）下干燥。
   3. 将每片盖玻片放入6孔板的各个孔中，并用紫外线照射15分钟。
   4. 在孔中央接种含有25 × 10³个细胞的液滴，静置1分钟后加入1 mL含补充物的DMEM培养基。在37 °C、5% CO₂条件下孵育96小时。
   5. 移除培养基，使用移液管以1× PBS-AA溶液洗涤三次。
   6. 向每个孔中加入1 mL 3.5%中性甲醛溶液，在室温下孵育1小时。小心移除甲醛溶液，再向每个孔中加入1 mL冷的70%乙醇。
   7. 用封口膜密封培养板，防止干燥，待后续使用。
      注意：ASCs的细胞形态也可通过不同传代阶段的苏木精-伊红染色进行评估。
   8. 从各孔中移除70%乙醇，用蒸馏水水化细胞5分钟。同时，过滤染色液。
   9. 移除水后，在轻柔振荡条件下用Harris苏木精染色液染色15分钟。
   10. 移除染色液，用1× PBS洗涤两次。
   11. 在轻柔振荡条件下用伊红染色液染色1分钟，随后移除染色液并用1× PBS洗涤两次。
   12. 小心地从各孔中取出盖玻片，将其置于一滴PBS-甘油封片剂（体积比1:1）上进行封片。
   13. 在盖玻片周围涂一圈指甲油，然后在光学显微镜下观察组织学切片。

5. 通过免疫荧光检测ASCs的表达标志物

1. 配制含1× PBS-0.05% Tween 20的洗涤缓冲液。在室温下轻轻振荡洗涤，每孔加入2 mL缓冲液，共洗涤3次（每次孵育3分钟）。
2. 每孔加入1 mL封闭试剂（1:10稀释），在轻微振荡条件下孵育20分钟。
3. 向每孔加入200 µL以下一抗（1:50稀释）：CD9（单克隆小鼠来源）、CD34（多克隆兔来源）和抗CD63（多克隆山羊来源），于4 °C过夜孵育。
4. 再次洗涤3次，每孔加入200 µL以下二抗（1:50稀释）：FITC标记的山羊抗小鼠IgG、DyeLight 550标记的驴抗山羊IgG，以及Cy3标记的山羊抗兔IgG。
5. 用1× PBS-0.05% Tween 20洗涤3次，每孔加入100 µL DRAQ-7（将17 µL DRAQ-7溶于1 mL双蒸水中，稀释比例为17 µL/mL），避光孵育20分钟以复染细胞核。
6. 再洗涤3次，按照步骤4.1.12–4.1.13进行封片。样品避光冷冻保存，直至使用。
7. 使用适合该设备的设置和推荐软件，通过倒置荧光共聚焦显微镜观察样品。

6. 通过流式细胞术检测 ASCs 的表达标志物

1. 将经胰酶消化或冻存复苏的细胞（传代3或4代）调整为单细胞悬液，浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL的1×PBS-5% FBS溶液。取100 µL含10万个细胞的悬液分装至1.5 mL离心管中。留一份未标记的样品作为自发荧光对照。
2. 根据生产商说明书，向其余样品中加入适量的Anti-CD105 AF-594和Anti-CD31 AF-680抗体。4 °C避光孵育20分钟。
3. 加入1 mL 1×PBS-5% FBS洗涤未结合的染料，250 × g离心5分钟，弃上清，沉淀用300 µL 1%甲醛溶液重悬。
4. 在流式细胞仪上进行样本检测。细胞设门策略基于FSC-A vs. SSC-A设门，再通过SSC-H vs. SSC-A圈选单细胞，随后进行FSC-A vs. FSC-H分析。
5. CD105 AF-594使用Y610-mCherry-A检测器，CD31 AF-680使用R660-APC-A检测器。

7. ASCs 向脂肪生成谱系的分化

1. 在6孔板中，接种1 x 10⁴ 细胞（P-4）/厘米² 并在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂，直至细胞融合度达到60%-80%（约72-96小时）。诱导分化时，直接向培养基中添加：4 µM 胰岛素、1 µM 地塞米松21-乙酸酯（Dxa）和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（MIX）。每2-3天更换一次分化培养基。
2. 配制800 µM胰岛素储备液：将20 µL 1 N HCl加入2 mL无菌超纯水中，确保胰岛素完全溶解，储存于-20 °C。取已按1:100稀释的胰岛素储备液10 µL，每孔以2 mL终体积加入10 µL。
3. 配制1 mM Dxa的储备液：将Dxa溶于5 mL无菌超纯水中（注意：不会完全溶解），4 °C保存。每孔加入40 µL Dxa储备液的1:4稀释液。
4. 在2.5 mL 0.1 N NaOH中配制100 mM MIX储备液，涡旋混匀，再加入40 µL 1 N NaOH以确保完全溶解。于-70 °C保存。每孔加入10 µL MIX储备液。
5. 使用0.22 µm无菌注射器滤器过滤储备液，然后储存。
6. 第12天，用1×PBS洗涤细胞3次，加入500 µL 4%甲醛溶液，室温孵育1 h。用蒸馏水洗涤每孔2次，再用60%异丙醇处理5 min，然后晾干。
7. 加入用60%异丙醇稀释的0.5%油红O溶液（每孔500 µL），室温孵育20分钟。用1 mL蒸馏水洗涤三次，在倒置显微镜下观察。
   注意：有关所需的试剂、仪器和材料，请参见文末列表 材料表.

结果

脂肪组织取自3-4月龄、体重为401 ± 41 g（几何平均值 ± 标准差）的成年Sprague Dawley大鼠。在15次实验提取物的分析中，附睾和肾周脂肪组织的平均重量为3.8 g。培养24小时后，细胞群体仍贴附于塑料表面，并呈现异质性形态。首次传代在8 ± 2天进行，在总共八次实验中获得1.4 ± 0.6 × 10⁶个细胞。通过直接明场观察（图1）和苏木精-伊红染色（图2），可在光学显微镜下完成形态学表征。细胞可见广泛的细胞质，具有细长的突起和丰富的细胞内微丝，这是间充质基质细胞的典型特征。

在不同传代次数（1、3、7 和 9 代）中，通过间接免疫荧光法特异性地观察到 ASCs 表达的表面标志物（图 3）。在所有检测的传代细胞中，ASCs 对 CD9 表面标志物的阳性率为 100%。该百分比是基于随机选取的五张显微照片中计数的总细胞数中阳性细胞所占的比例。在第 1、3 和 9 ...

讨论

自发现间充质干细胞（MSCs）以来的近四十年中，多个研究团队已描述了从不同组织和物种中获取MSCs的方法。使用大鼠作为动物模型的优势之一在于其易于饲养、发育迅速，并且易于从脂肪组织中获取MSCs。已有研究报道了多种获取脂肪间充质干细胞（ASCs）的组织来源，包括内脏脂肪、肾周脂肪、附睾脂肪和皮下脂肪^{12,13,14,15,16}。

关于本研究所采用的提取方法，作者建议大鼠体重应控制在350–450 g之间，该体重范围可在出生后前4个月内达到。当动物体重在450–600 g、年龄不超过8个月时，每只大鼠的脂肪组织量（5.5 ± 2.1；均值 ± 标准差）更高；然而，脂肪间充质干细胞（ASCs）的数量并未相应增加（数据未显示）。这些观察结果与González

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	HyClone	SV30078.01
分析天平	Sartorius	AX224
抗CD9抗体（C-4）	Santa Cruz	Sc-13118
抗CD34抗体（C-18）	Santa Cruz	Sc-7045
抗C63抗体	Santa Cruz	Sc-5275
抗内皮糖蛋白/CD105（P3D1）Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
抗CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
山羊抗兔IgG（H+L）Cy3抗体	Novus	NB 120-6939
驴抗山羊IgG（H+L）DyLight 550抗体	Invitrogen	SA5-10087
抗小鼠IgG FITC标记的山羊F(ab´)抗体	RD Systems.	No. F103B
瓶顶滤器（无菌）	CORNING	10718003
细胞与组织培养瓶	BIOFIL	170718-312B
细胞计数仪：带细胞计数板载玻片的Bright-Line血细胞计数板	SIGMA Aldrich	Z359629
细胞培养板：6孔板带盖	CORNING	25810
离心管（锥形）	HeTTICH	ROTANA460R
离心管（Eppendorf管）	Fischer Scientific	M0018242_44797
IV型胶原蛋白	Worthington	LS004186
冻存管	SPL Life Science	43112
培养管	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	免费版本
CytoFlex LX流式细胞仪	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM培养基	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7染料	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
伊红黄	Hycel	300
96%乙醇	Baker	64-17-5
Falcon管（15 mL）	Greiner Bio-One	188271
Falcon管（50 mL）	Greiner Bio-One	227261
胎牛血清	CORNING	35-010-CV
明胶	SIGMA Aldrich	128111163
庆大霉素	GIBCO	15750045
甘油（高纯度）	Herschi Trading	56-81-5
苏木精	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 培养箱	Thermo Sc.	50116047
氯胺酮宠物（盐酸氯胺酮）	Aranda	SV057430
L-谷氨酰胺	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM软件 Zen 2009 V5.5		免费版本
II级生物安全柜	NuAire	12082100801
荧光倒置显微镜	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
倒置显微镜	Olympus CK40	CK40-G100
非必需氨基酸（100倍浓缩）	GIBCO	11140050
微量离心管（2 mL）	Sarstedt	72695400
微量离心管（1.5 mL）	Sarstedt	72706400
移液器（0.2–2 μL）	Finnpipette	E97743
移液器（2–20 μL）	Finnpipette	F54167
移液器（20–200 μL）	Finnpipette	G32419
移液器（100–1000 μL）	Finnpipette	FJ39895
液氮罐	Taylor-Wharton	681-021-06
多聚甲醛	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
青霉素/链霉素	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
细胞培养用培养皿	CORNING Inc	480167
移液器吸头	Axygen Scientific	301-03-201
戊巴比妥钠（Pisabental）	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
氯化钾	J.T.Baker	7447-40-7
磷酸氢二钾	J.T Baker	2139900
S1移液器辅助器	Thermo Sc	9531
血清移液管（5 mL）	PYREX	L010005
血清移液管（10 mL）	PYREX	L010010
碳酸氢钠	J.T Baker	144-55-8
氯化钠	J.T.Baker	15368426
无水磷酸氢二钠	J.T Baker	7558-79-4
丙酮酸钠	GIBCO BRL	11840-048
注射器滤器（无菌）	CORNING	431222
分光光度计	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
培养板振荡器	LAB-LINE	1250
移液管	Samco/Thermo Sc	728NL
台盼蓝染色液	GIBCO	1198566
猪胰蛋白酶	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
通用封闭试剂（10倍浓缩）	BioGenex	HK085-GP
赛拉嗪2%（盐酸赛拉嗪）	Pet's Pharma	Q-7972-025