本方案描述了一种从Sprague Dawley大鼠中分离和鉴定脂肪组织来源的间充质干细胞（MSCs）的方法。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，成体间充质细胞彻底改变了分子与细胞生物学领域。除了具有强大的自我更新、迁移和增殖能力外，它们还能分化为多种特化的细胞类型。脂肪组织是间充质细胞最易获取且侵入性最小的来源之一。已有报道表明，与其他来源相比，脂肪组织不仅能获得更高的细胞产量，还具有更优越的免疫调节特性。近期，已有多种从不同组织来源和动物物种中获取成体间充质细胞的方法被发表。在评估部分研究者所采用的标准后，我们建立了一种适用于多种用途且易于重复的标准方法。通过收集肾周和附睾周围脂肪组织的基质血管组分（SVF），我们成功建立了形态和功能均理想的原代细胞培养体系。细胞在接种后24小时即可见贴附于塑料培养表面，呈现成纤维细胞样形态，具有突起并倾向于形成集落。采用流式细胞术（FC）和免疫荧光（IF）技术检测了细胞膜标志物CD105、CD9、CD63、CD31和CD34的表达情况。此外，还通过诱导因子混合物（4 µM 胰岛素、0.5 mM 3-甲基-异丁基-黄嘌呤和1 µM 地塞米松）评估了脂肪源性干细胞（ASCs）向脂肪细胞谱系分化的潜能。诱导48小时后，细胞逐渐失去成纤维细胞样形态；至第12天，油红染色证实脂滴形成。综上所述，本研究提出了一种可获得形态良好且功能完整的ASC培养物的操作流程，适用于再生医学领域的应用。
引言
间充质干细胞（MSCs）因其强大的自我更新、增殖、迁移以及向不同细胞谱系分化的能力，对再生医学产生了深远影响1,2。目前，大量研究正聚焦于其在多种疾病治疗与诊断中的潜在应用。
间充质细胞的来源多种多样，包括骨髓、骨骼肌、羊水、毛囊、胎盘和脂肪组织等。这些细胞可从不同物种中获得，包括人类、小鼠、大鼠、狗和马3。多年来，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）一直是再生医学中干细胞的主要来源，也是胚胎干细胞应用的一种替代选择4。然而，脂肪组织来源的间充质干细胞（ASCs），即脂肪源性干细胞，因其易于采集和分离，以及每克脂肪组织可获得较高的细胞产量，已成为一种具有显著优势的重要替代来源5,6。据报道，ASCs的收获率通常高于BMSCs7。最初认为ASCs的修复/再生能力源于其向其他细胞谱系分化的潜能8。然而，近年来的研究进一步强调了ASCs释放的旁分泌因子在其修复潜力中的主导作用9,
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方案
所有实验操作均遵循墨西哥动物护理指南，该指南基于国际实验动物护理评估与认证协会的建议（墨西哥官方标准 NOM-062-200-1999，墨西哥）。本方案已提交并获得卫生研究伦理委员会的审查、批准和注册 墨西哥社会保险研究所（R-2021-785-092）
1. 通过手术切除法去除大鼠的脂肪组织
- 准备两个锥形管，每管加入20 mL无菌1×磷酸盐缓冲液-抗生素-抗真菌溶液（1×PBS，庆大霉素[20 µg/mL]，两性霉素[0.5 µg/mL]），置于冰上保存。
- 选择两只成年雄性Sprague Dawley大鼠 （挪威褐鼠） 健康状况良好。确保大鼠年龄在3至4个月之间，体重为350-450 g。
- 以20 mg/kg的盐酸赛拉嗪进行镇静，5分钟后，腹腔注射120 mg/kg的盐酸氯胺酮进行麻醉。 用眼膏润滑双眼 以防止干燥。然后， 通过脚趾反射消失确认麻醉深度。
- 剃除腹部和腹股沟区域的毛发，并用碘溶液消毒。 使用手术巾以维持无菌环境。然后，从胸骨至睾丸区域做一正中纵向切口。
- 用无菌镊子去除附着在附睾和肾脏周围的脂肪组织，并置于1x PBS-AA溶液中。将样品置于冰上保存。
- 缝合切口 若需要则关闭....
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结果
脂肪组织取自3至4月龄、体重为401 ± 41 g（几何平均值 ± 标准差）的成年Sprague Dawley大鼠。在15次实验提取分析中，附睾脂肪和肾周脂肪组织的平均质量为3.8 g。培养24小时后，细胞群体仍贴附于塑料表面，并呈现异质性形态。首次传代在培养8 ± 2天后进行，在总共八次实验中，细胞收获量为1.4 ± 0.6 × 106 个。通过明场直接观察（图1）和苏木精-伊红染色（图2）可在光学显微镜下进行形态学表征。细胞可见广泛的细胞质，具有细长的突起和丰富的细胞内微丝，这是间充质基质细胞的典型特征。
在不同次级传代（1、3、7 和 9 代）中，通过间接免疫荧光法特异性地可视化检测到 ASCs 表达的表面标志物（图 3）。在所有检测的次级传代中，ASCs 对 CD9 表面标志物的阳性率均为 100%。该百分比是基于在五个随机选取的显微照片中计数的总细胞数中阳性细胞所占的比例。.......
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讨论
自发现间充质干细胞（MSCs）以来的近四十年中，多个研究团队已描述了从不同组织和物种中获取MSCs的方法。使用大鼠作为动物模型的优势之一在于其易于饲养、发育迅速，并且易于从脂肪组织中获取MSCs。已有研究报道了多种获取脂肪间充质干细胞（ASCs）的组织来源，包括内脏脂肪、肾周脂肪、附睾脂肪和皮下脂肪12,13,14,15,16。
关于本研究所采用的提取方法，作者建议大鼠体重应控制在350–450 g之间，该体重范围可在出生后前4个月内达到。当动物体重在450–600 g、年龄不超过8个月时，每只大鼠的脂肪组织量（5.5 ± 2.1；均值 ± 标准差）更高；然而，脂肪间充质干细胞（ASCs）的数量并未相应增加（数据未显示）。这些观察结果与González
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢墨西哥社会保障研究所（IMSS）、墨西哥费德里科·戈麦斯儿童医院（HIMFG）以及IMSS研究协调部门动物实验中心工作人员对本项目提供的支持。感谢国家科学与技术委员会提供的AOC（815290）奖学金，以及安东尼奥·杜阿尔特·雷耶斯在音视频资料方面提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 两性霉素B | HyClone | SV30078.01 | |
| 分析天平 | Sartorius | AX224 | |
| 抗CD9抗体（C-4） | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| 抗CD34抗体（C-18） | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| 抗C63抗体 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| 抗内皮糖蛋白/CD105（P3D1）Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| 抗CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）Cy3抗体 | Novus | NB 120-6939 | |
| 驴抗山羊IgG（H+L）DyLight 550抗体 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| 抗小鼠IgG FITC标记的山羊F(ab´)抗体 | RD Systems. | No. F103B | |
| 瓶顶滤器（无菌） | CORNING | 10718003 | |
| 细胞与组织培养瓶 | BIOFIL | 170718-312B | |
| 细胞计数仪：带细胞计数板载玻片的Bright-Line血细胞计数板 | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| 细胞培养板：6孔板带盖 | CORNING | 25810 | |
| 离心管（锥形） | HeTTICH | ROTANA460R | |
| 离心管（Eppendorf管） | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| IV型胶原蛋白 | Worthington | LS004186 | |
| 冻存管 | SPL Life Science | 43112 | |
| 培养管 | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | 免费版本 | |
| CytoFlex LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM培养基 | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7染料 | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| 伊红黄 | Hycel | 300 | |
| 96%乙醇 | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon管（15 mL） | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon管（50 mL） | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 胎牛血清 | CORNING | 35-010-CV | |
| 明胶 | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| 庆大霉素 | GIBCO | 15750045 | |
| 甘油（高纯度） | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| 苏木精 | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 培养箱 | Thermo Sc. | 50116047 | |
| 氯胺酮宠物（盐酸氯胺酮） | Aranda | SV057430 | |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM软件 Zen 2009 V5.5 | 免费版本 | ||
| II级生物安全柜 | NuAire | 12082100801 | |
| 荧光倒置显微镜 | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| 倒置显微镜 | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| 非必需氨基酸（100倍浓缩） | GIBCO | 11140050 | |
| 微量离心管（2 mL） | Sarstedt | 72695400 | |
| 微量离心管（1.5 mL） | Sarstedt | 72706400 | |
| 移液器（0.2–2 μL） | Finnpipette | E97743 | |
| 移液器（2–20 μL） | Finnpipette | F54167 | |
| 移液器（20–200 μL） | Finnpipette | G32419 | |
| 移液器（100–1000 μL） | Finnpipette | FJ39895 | |
| 液氮罐 | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| 多聚甲醛 | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| 细胞培养用培养皿 | CORNING Inc | 480167 | |
| 移液器吸头 | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| 戊巴比妥钠（Pisabental） | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| 氯化钾 | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| 磷酸氢二钾 | J.T Baker | 2139900 | |
| S1移液器辅助器 | Thermo Sc | 9531 | |
| 血清移液管（5 mL） | PYREX | L010005 | |
| 血清移液管（10 mL） | PYREX | L010010 | |
| 碳酸氢钠 | J.T Baker | 144-55-8 | |
| 氯化钠 | J.T.Baker | 15368426 | |
| 无水磷酸氢二钠 | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| 丙酮酸钠 | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| 注射器滤器（无菌） | CORNING | 431222 | |
| 分光光度计 | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| 培养板振荡器 | LAB-LINE | 1250 | |
| 移液管 | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| 台盼蓝染色液 | GIBCO | 1198566 | |
| 猪胰蛋白酶 | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| 通用封闭试剂（10倍浓缩） | BioGenex | HK085-GP | |
| 赛拉嗪2%（盐酸赛拉嗪） | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
参考文献
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J.
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