Angelman综合征小鼠模型的行为学表征

摘要

本论文介绍了一组高度可重复的行为学实验，用于验证Angelman综合征小鼠模型。

摘要

本文描述了一组可用于表征已建立的Angelman综合征（AS）小鼠模型中AS样表型的行为学检测方法。我们采用转棒学习范式、详细的步态分析以及筑巢实验来检测和表征动物的运动功能障碍。通过旷场实验和高架十字迷宫实验评估动物的情绪行为，并通过尾悬实验评估其情绪状态。当对AS小鼠进行旷场实验时，结果应谨慎解读，因为运动功能障碍会影响小鼠在迷宫中的行为，并改变其活动评分。

已有多项独立研究在具有不同基因敲除变异的Uba3a小鼠品系中验证了上述行为学检测的可重复性和有效性，确立了该检测组合作为Angelman综合征（AS）研究中的优秀验证工具。具有相关结构效度和表面效度的模型将为进一步阐明该疾病的病理生理机制以及开发病因治疗方案提供支持。

引言

Angelman综合征（AS）是一种罕见的神经发育疾病。AS最常见的遗传原因是母源染色体15q11-q13区域的大片段缺失，约74%的患者存在此类缺失¹。该区域的缺失导致UBE3A基因丢失，该基因是AS的主要致病基因，编码一种E3泛素连接酶。在神经元中，UBE3A基因的父源等位基因通过一种称为基因组印记的过程被沉默。因此，由于该基因的父源印记，仅母源等位基因在中枢神经系统（CNS）中表达²。因此，母源染色体上UBE3A基因的缺失会导致AS症状的发生。在人类中，AS通常在出生后约6个月开始显现，表现为贯穿整个发育阶段的发育迟缓，并导致患者出现严重的功能障碍症状^3,4。该疾病的核心症状包括精细和粗大运动技能缺陷，如共济失调性步态不稳、严重言语障碍以及智力障碍。约80%的AS患者还伴有睡眠障碍和癫痫。迄今为止，唯一可用的治疗方法是使用对症药物，以减少癫痫发作并改善睡眠质量¹。因此，建立具有可重复行为表型的可靠动物模型，并结合精细的表型分析，对于阐明该疾病的病理生理机制以及发现有效的药物和治疗方法至关重要。

影响中枢神经系统的复杂人类疾病需要具有可比基因组、生理特征和行为模....

方案

本研究中使用的所有动物和实验均经过伦理审查，并依照欧盟指令2010/63/EU的规定进行。研究经捷克中央动物福利委员会批准。小鼠饲养在独立通风的笼具中，环境温度保持在22 ± 2 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。小鼠可自由摄取鼠粮和饮水ad libitum。每笼饲养3至6只小鼠。在实验前仅进行称重，不进行其他操作。有关本实验方案中使用的所有材料和设备的详细信息，请参见材料表。

1. 检测前和检测过程中的总体注意事项

注意：为了清晰和易于理解，先在各项具体实验描述之前提供一般性说明。此原则适用于每个实验，明显的例外是筑巢材料撕碎实验，该实验在饲养室中进行，无需使用任何实验设备。

1. 在测试前至少将动物安置于研究机构中14天，以尽量减少因运输和环境变化所导致的应激反应。
2. 在测试前记录动物体重，因为体重是行为学研究中常见的混杂因素。
3. 每次将动物从饲养房间转移至实验房间后（即除在饲养房间进行的巢材撕碎实验外，下述所有实验均需转移），应让动物在实验室内适应至少1小时，以尽量减少运输带来的应激。
4. 使用无毒水性标记笔在动物尾巴上进行标记，以便在实验过程中快速识别个体。
5. 每次试验结束后，清除动物在实验装置内排泄的所有尿液和粪便。
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结果

高架十字迷宫和旷场实验
高架十字迷宫（EPM）和旷场（OF）实验利用了啮齿类动物探索新环境的自然倾向^18,19。这种探索行为受趋近-回避冲突的调控，即动物在探索新环境的欲望与回避潜在危险之间进行权衡。动物会探索未知区域以寻找庇护所、社交接触或觅食资源，但新环境也可能存在捕食者或竞争者等风险因素。旷场实验和高架十字迷宫均包含安全区和风险区：旷场实验中分别为周边区域和中央区域，高架十字迷宫中分别为闭臂和开臂。啮齿类动物天生更偏好黑暗、封闭的空间，而非开阔、高悬且光线明亮的区域。因此，对风险区/致焦虑区域探索减少——表现为进入次数减少、停留时间缩短或首次进入潜伏期延长——是动物焦虑样行为的特征表现^8,11。静止时间、平均速度和总移动距离则提供了有关动物自发活动水平的额外信息。在 UBE3A^mGenedel/+ 突变体中，无论是旷场实验还是高架十字迷.......

讨论

在不同小鼠品系中建立的AS模型通常通过检测动物的情绪状态、运动功能和认知能力来验证，以便与人类症状进行比较^31,32。AS模型中最一致的发现是运动功能障碍，其次为突变体情绪状态无明显改变以及筑巢能力受损^31,32,33。相比之下，认知障碍则较轻微或不存在^7,31,33。认知表型的差异似乎取决于受试动物的年龄，Huang等人⁷的研究已表明了这一点。因此，本文选择了一系列测试方法，主要基于其可重复性以及与年龄和物种无关的特性，因为在小鼠和大鼠AS模型中均观察到了可比较的结果^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
独立通风笼具	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	设备为招标提供，未提供目录 编号，亦无法在公司网站上查到	用于小鼠步态的详细分析，提供硬件和软件。
FDA Nestlet 方形垫料	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	材料通过直接邮件请求从 Velaz 供应商处购买。Velaz 未提供任何目录编号	用于筑巢实验的棉质垫料。垫料规格：每片 2–3 g，直径约为 5 × 5 × 0.5 cm。
小鼠饲料	Altramion
转棒仪	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	设备为招标提供，未提供目录 编号，亦无法在公司网站上查到	适用于 5 只小鼠的转棒仪，提供硬件和软件。滚筒尺寸：直径 30 mm，每条通道宽度 50 mm，跌落高度 147 mm。
尾悬吊实验装置	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	货号：BIO-TST5	全自动设备，用于评估 3 只尾部悬挂小鼠的不动时间，提供硬件和软件
透气医用胶带	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	用于将动物尾部固定在挂钩上的胶带。
Viewer - 视频追踪系统	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	设备及软件为招标提供，未提供目录 编号，亦无法在公司网站上查到	配套定制硬件的软件系统：迷宫、红外底板、红外敏感摄像头。定制开放场（OF）尺寸：42 × 42 cm 区域，49 cm 高的侧壁，中心区域面积：39 cm2。定制高架十字迷宫（EPM）离地高度 50 cm，开放臂长 79 cm，宽 9 cm；封闭臂长 77 cm，宽 7.6 cm。