本论文介绍了一组高度可重复的行为学实验,用于验证Angelman综合征小鼠模型。
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本论文介绍了一组高度可重复的行为学实验,用于验证Angelman综合征小鼠模型。
本文描述了一组可用于表征已建立的Angelman综合征(AS)小鼠模型中AS样表型的行为学检测方法。我们采用转棒学习范式、详细的步态分析以及筑巢实验来检测和表征动物的运动功能障碍。通过旷场实验和高架十字迷宫实验评估动物的情绪行为,并通过尾悬实验评估其情绪状态。当对AS小鼠进行旷场实验时,结果应谨慎解读,因为运动功能障碍会影响小鼠在迷宫中的行为,并改变其活动评分。
已有多项独立研究在具有不同基因敲除变异的Uba3a小鼠品系中验证了上述行为学检测的可重复性和有效性,确立了该检测组合作为Angelman综合征(AS)研究中的优秀验证工具。具有相关结构效度和表面效度的模型将为进一步阐明该疾病的病理生理机制以及开发病因治疗方案提供支持。
Angelman综合征(AS)是一种罕见的神经发育疾病。AS最常见的遗传原因是母源染色体15q11-q13区域的大片段缺失,约74%的患者存在此类缺失1。该区域的缺失导致UBE3A基因丢失,该基因是AS的主要致病基因,编码一种E3泛素连接酶。在神经元中,UBE3A基因的父源等位基因通过一种称为基因组印记的过程被沉默。因此,由于该基因的父源印记,仅母源等位基因在中枢神经系统(CNS)中表达2。因此,母源染色体上UBE3A基因的缺失会导致AS症状的发生。在人类中,AS通常在出生后约6个月开始显现,表现为贯穿整个发育阶段的发育迟缓,并导致患者出现严重的功能障碍症状3,4。该疾病的核心症状包括精细和粗大运动技能缺陷,如共济失调性步态不稳、严重言语障碍以及智力障碍。约80%的AS患者还伴有睡眠障碍和癫痫。迄今为止,唯一可用的治疗方法是使用对症药物,以减少癫痫发作并改善睡眠质量1。因此,建立具有可重复行为表型的可靠动物模型,并结合精细的表型分析,对于阐明该疾病的病理生理机制以及发现有效的药物和治疗方法至关重要。
影响中枢神经系统的复杂人类疾病需要具有可比基因组、生理特征和行为模式的模式生物。小鼠因其繁殖周期短、体型小以及易于进行DNA改造而成为常用的模式生物。1984年,Paul Willner提出了三种基本的疾病模型验证标准:构效效度(construct validity)、表观效度(face validity)和预测效度(predictive validity),用于评估模型的价值5。简而言之,构效效度反映的是导致疾病发生的生物学机制,表观效度重现疾病的症状表现,而预测效度则描述模型对治疗药物的反应情况。
为了遵循上述原则,我们选择最常见的遗传病因——母源15q11.2-13q位点的大片段缺失(包含UBE3A基因),以构建天使综合征(AS)模型小鼠。我们采用CRISPR/Cas9技术,在C57BL/6N背景的小鼠中删除了跨越整个UBE3A基因的76,225 bp区域,该区域涵盖基因的编码和非编码元件6。随后通过繁育获得UBE3A+/−杂合子小鼠。为进行表型验证,我们利用UBE3A+/−雌鼠与野生型雄鼠交配,获得UBE3A+/-子代(品系命名为C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph,后指定为UBE3AmGenedel/+)及其对照窝仔。我们检测了它们的精细与粗大运动能力、情绪性及情感状态,以模拟AS的核心症状。在之前的一篇文章中,我们也评估了动物的认知功能,因为AS患者通常伴有智力障碍6。然而,我们并未在UBE3AmGenedel/+小鼠中发现认知功能损害,这可能与检测时动物年龄较轻有关7。后续对约18周龄的成年动物进行检测时发现,其在位置偏好范式中的逆转学习任务中表现出行为灵活性缺陷。但由于该分析所用设备较为复杂,需单独设立方法学模块,故本文未予包含。
本文所介绍的行为学测试因其具有较高的预测价值和足够的结构效度,已成为遗传学研究中常用的表型分析工具8,9,10。我们采用这些测试方法,以可重复且不受年龄影响的方式再现天使综合征(AS)人类疾病的核心症状,从而验证该小鼠模型的有效性。动物的情绪性通过高架十字迷宫实验和旷场实验进行评估。这两个实验均基于趋近-回避冲突原理,即动物在探索新环境以寻找食物、庇护所或交配机会的同时,会回避具有致焦虑作用的区域11。此外,旷场实验还可用于检测小鼠的运动活动能力8。悬尾实验广泛应用于抑郁症研究中,用于筛选新型抗抑郁药物或评估基因敲除小鼠模型中类似抑郁的表型12。该实验通过测量动物在无法逃脱的情境中随时间推移所表现出的绝望行为来进行评估。运动学习能力和详细的步态特征分别通过转棒实验和DigiGait系统进行测定。动物在加速转棒上的耐受时间可反映其平衡能力和运动协调能力,而对小鼠步态模式的详细分析则是评估与多种神经退行性运动障碍相关的神经肌肉功能损伤的敏感指标13,14,15。纸团撕咬实验是检测啮齿类动物冲动行为的标准方法之一,由于该实验利用了啮齿类动物天然的筑巢行为,因此也可反映动物的福利状况16,17。
实验组的规模是在满足3R原则要求和高效利用品系繁殖能力之间权衡的结果。然而,为了获得足够的统计学效能,每组至少包含10个个体,这是基于能够建立足够数量的繁殖配对而确定的。遗憾的是,繁殖能力并不总能产生足够数量的动物。
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本研究中使用的所有动物和实验均经过伦理审查,并依照欧盟指令2010/63/EU的规定进行。研究经捷克中央动物福利委员会批准。小鼠饲养在独立通风的笼具中,环境温度保持在22 ± 2 °C,光照周期为12小时光照/12小时黑暗。小鼠可自由摄取鼠粮和饮水ad libitum。每笼饲养3至6只小鼠。在实验前仅进行称重,不进行其他操作。有关本实验方案中使用的所有材料和设备的详细信息,请参见材料表。
1. 检测前和检测过程中的总体注意事项
注意:为了清晰和易于理解,先在各项具体实验描述之前提供一般性说明。此原则适用于每个实验,明显的例外是筑巢材料撕碎实验,该实验在饲养室中进行,无需使用任何实验设备。
2. 行为学测试
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高架十字迷宫和旷场实验
高架十字迷宫(EPM)和旷场(OF)实验利用了啮齿类动物探索新环境的自然倾向18,19。这种探索行为受趋近-回避冲突的调控,即动物在探索新环境的欲望与回避潜在危险之间进行权衡。动物会探索未知区域以寻找庇护所、社交接触或觅食资源,但新环境也可能存在捕食者或竞争者等风险因素。旷场实验和高架十字迷宫均包含安全区和风险区:旷场实验中分别为周边区域和中央区域,高架十字迷宫中分别为闭臂和开臂。啮齿类动物天生更偏好黑暗、封闭的空间,而非开阔、高悬且光线明亮的区域。因此,对风险区/致焦虑区域探索减少——表现为进入次数减少、停留时间缩短或首次进入潜伏期延长——是动物焦虑样行为的特征表现8,11。静止时间、平均速度和总移动距离则提供了有关动物自发活动水平的额外信息。在 UBE3AmGenedel/+ 突变体中,无论是旷场实验还是高架十字迷...
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在不同小鼠品系中建立的AS模型通常通过检测动物的情绪状态、运动功能和认知能力来验证,以便与人类症状进行比较31,32。AS模型中最一致的发现是运动功能障碍,其次为突变体情绪状态无明显改变以及筑巢能力受损31,32,33。相比之下,认知障碍则较轻微或不存在7,31,33。认知表型的差异似乎取决于受试动物的年龄,Huang等人7的研究已表明了这一点。因此,本文选择了一系列测试方法,主要基于其可重复性以及与年龄和物种无关的特性,因为在小鼠和大鼠AS模型中均观察到了可比较的结果...
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作者声明无利益冲突。
本研究得到了捷克科学院RVO 68378050、捷克共和国教育部(MEYS CR)提供的LM2018126捷克表型基因组学中心、OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789(捷克表型基因组学中心升级:通过教育部和欧洲结构与投资基金推进转化研究)、OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861(CCP基础设施升级II,由教育部和欧洲结构与投资基金资助)以及OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395(通过教育部和欧洲区域发展基金提升转基因模型的质量与产能)的支持。此外,本研究还获得了捷克共和国非政府组织"基因治疗协会(ASGENT)"(https://asgent.org/)以及捷克共和国教育、青年和体育部提供的LM2023036捷克表型基因组学中心的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 独立通风笼具 | Techniplast | ||
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA | 设备为招标提供,未提供目录 编号,亦无法在公司网站上查到 | 用于小鼠步态的详细分析,提供硬件和软件。 |
| FDA Nestlet 方形垫料 | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | 材料通过直接邮件请求从 Velaz 供应商处购买。Velaz 未提供任何目录编号 | 用于筑巢实验的棉质垫料。垫料规格:每片 2–3 g,直径约为 5 × 5 × 0.5 cm。 |
| 小鼠饲料 | Altramion | ||
| 转棒仪 | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany | 设备为招标提供,未提供目录 编号,亦无法在公司网站上查到 | 适用于 5 只小鼠的转棒仪,提供硬件和软件。滚筒尺寸:直径 30 mm,每条通道宽度 50 mm,跌落高度 147 mm。 |
| 尾悬吊实验装置 | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE | 货号:BIO-TST5 | 全自动设备,用于评估 3 只尾部悬挂小鼠的不动时间,提供硬件和软件 |
| 透气医用胶带 | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | 用于将动物尾部固定在挂钩上的胶带。 |
| Viewer - 视频追踪系统 | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany | 设备及软件为招标提供,未提供目录 编号,亦无法在公司网站上查到 | 配套定制硬件的软件系统:迷宫、红外底板、红外敏感摄像头。定制开放场(OF)尺寸:42 × 42 cm 区域,49 cm 高的侧壁,中心区域面积:39 cm2。定制高架十字迷宫(EPM)离地高度 50 cm,开放臂长 79 cm,宽 9 cm;封闭臂长 77 cm,宽 7.6 cm。 |
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