Angelman综合征小鼠模型的行为学表征

摘要

本论文介绍了一组高度可重复的行为学实验，用于验证Angelman综合征小鼠模型。

摘要

本文描述了一组可用于表征已建立的Angelman综合征（AS）小鼠模型中AS样表型的行为学检测方法。我们采用转棒学习范式、详细的步态分析以及筑巢实验来检测和表征动物的运动功能障碍。通过旷场实验和高架十字迷宫实验评估动物的情绪行为，并通过尾悬实验评估其情绪状态。当对AS小鼠进行旷场实验时，结果应谨慎解读，因为运动功能障碍会影响小鼠在迷宫中的行为，并改变其活动评分。

已有多项独立研究在具有不同基因敲除变异的Uba3a小鼠品系中验证了上述行为学检测的可重复性和有效性，确立了该检测组合作为Angelman综合征（AS）研究中的优秀验证工具。具有相关结构效度和表面效度的模型将为进一步阐明该疾病的病理生理机制以及开发病因治疗方案提供支持。

引言

Angelman综合征（AS）是一种罕见的神经发育疾病。AS最常见的遗传原因是母源染色体15q11-q13区域的大片段缺失，约74%的患者存在此类缺失¹。该区域的缺失导致UBE3A基因丢失，该基因是AS的主要致病基因，编码一种E3泛素连接酶。在神经元中，UBE3A基因的父源等位基因通过一种称为基因组印记的过程被沉默。因此，由于该基因的父源印记，仅母源等位基因在中枢神经系统（CNS）中表达²。因此，母源染色体上UBE3A基因的缺失会导致AS症状的发生。在人类中，AS通常在出生后约6个月开始显现，表现为贯穿整个发育阶段的发育迟缓，并导致患者出现严重的功能障碍症状^3,4。该疾病的核心症状包括精细和粗大运动技能缺陷，如共济失调性步态不稳、严重言语障碍以及智力障碍。约80%的AS患者还伴有睡眠障碍和癫痫。迄今为止，唯一可用的治疗方法是使用对症药物，以减少癫痫发作并改善睡眠质量¹。因此，建立具有可重复行为表型的可靠动物模型，并结合精细的表型分析，对于阐明该疾病的病理生理机制以及发现有效的药物和治疗方法至关重要。

影响中枢神经系统的复杂人类疾病需要具有可比基因组、生理特征和行为模式的模式生物。小鼠因其繁殖周期短、体型小以及易于进行DNA改造而成为常用的模式生物。1984年，Paul Willner提出了三种基本的疾病模型验证标准：构效效度（construct validity）、表观效度（face validity）和预测效度（predictive validity），用于评估模型的价值⁵。简而言之，构效效度反映的是导致疾病发生的生物学机制，表观效度重现疾病的症状表现，而预测效度则描述模型对治疗药物的反应情况。

为了遵循上述原则，我们选择最常见的遗传病因——母源15q11.2-13q位点的大片段缺失（包含UBE3A基因），以构建天使综合征（AS）模型小鼠。我们采用CRISPR/Cas9技术，在C57BL/6N背景的小鼠中删除了跨越整个UBE3A基因的76,225 bp区域，该区域涵盖基因的编码和非编码元件⁶。随后通过繁育获得UBE3A^+/−杂合子小鼠。为进行表型验证，我们利用UBE3A^+/−雌鼠与野生型雄鼠交配，获得UBE3A^+/-子代（品系命名为C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph，后指定为UBE3A^mGenedel/+）及其对照窝仔。我们检测了它们的精细与粗大运动能力、情绪性及情感状态，以模拟AS的核心症状。在之前的一篇文章中，我们也评估了动物的认知功能，因为AS患者通常伴有智力障碍⁶。然而，我们并未在UBE3A^mGenedel/+小鼠中发现认知功能损害，这可能与检测时动物年龄较轻有关⁷。后续对约18周龄的成年动物进行检测时发现，其在位置偏好范式中的逆转学习任务中表现出行为灵活性缺陷。但由于该分析所用设备较为复杂，需单独设立方法学模块，故本文未予包含。

本文所介绍的行为学测试因其具有较高的预测价值和足够的结构效度，已成为遗传学研究中常用的表型分析工具^8,9,10。我们采用这些测试方法，以可重复且不受年龄影响的方式再现天使综合征（AS）人类疾病的核心症状，从而验证该小鼠模型的有效性。动物的情绪性通过高架十字迷宫实验和旷场实验进行评估。这两个实验均基于趋近-回避冲突原理，即动物在探索新环境以寻找食物、庇护所或交配机会的同时，会回避具有致焦虑作用的区域¹¹。此外，旷场实验还可用于检测小鼠的运动活动能力⁸。悬尾实验广泛应用于抑郁症研究中，用于筛选新型抗抑郁药物或评估基因敲除小鼠模型中类似抑郁的表型¹²。该实验通过测量动物在无法逃脱的情境中随时间推移所表现出的绝望行为来进行评估。运动学习能力和详细的步态特征分别通过转棒实验和DigiGait系统进行测定。动物在加速转棒上的耐受时间可反映其平衡能力和运动协调能力，而对小鼠步态模式的详细分析则是评估与多种神经退行性运动障碍相关的神经肌肉功能损伤的敏感指标^13,14,15。纸团撕咬实验是检测啮齿类动物冲动行为的标准方法之一，由于该实验利用了啮齿类动物天然的筑巢行为，因此也可反映动物的福利状况^16,17。

实验组的规模是在满足3R原则要求和高效利用品系繁殖能力之间权衡的结果。然而，为了获得足够的统计学效能，每组至少包含10个个体，这是基于能够建立足够数量的繁殖配对而确定的。遗憾的是，繁殖能力并不总能产生足够数量的动物。

方案

本研究中使用的所有动物和实验均经过伦理审查，并依照欧盟指令2010/63/EU的规定进行。研究经捷克中央动物福利委员会批准。小鼠饲养在独立通风的笼具中，环境温度保持在22 ± 2 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。小鼠可自由摄取鼠粮和饮水ad libitum。每笼饲养3至6只小鼠。在实验前仅进行称重，不进行其他操作。有关本实验方案中使用的所有材料和设备的详细信息，请参见材料表。

1. 检测前和检测过程中的总体注意事项

注意：为了清晰和易于理解，先在各项具体实验描述之前提供一般性说明。此原则适用于每个实验，明显的例外是筑巢材料撕碎实验，该实验在饲养室中进行，无需使用任何实验设备。

1. 在测试前至少将动物安置于研究机构中14天，以尽量减少因运输和环境变化所导致的应激反应。
2. 在测试前记录动物体重，因为体重是行为学研究中常见的混杂因素。
3. 每次将动物从饲养房间转移至实验房间后（即除在饲养房间进行的巢材撕碎实验外，下述所有实验均需转移），应让动物在实验室内适应至少1小时，以尽量减少运输带来的应激。
4. 使用无毒水性标记笔在动物尾巴上进行标记，以便在实验过程中快速识别个体。
5. 每次试验结束后，清除动物在实验装置内排泄的所有尿液和粪便。
6. 在每只动物测试前后，均应用75%酒精擦拭所有实验装置。此步骤可去除测试过程中留下的嗅觉痕迹，有助于维持稳定的实验条件。
7. 将动物从其居住笼转移至实验装置时应尽可能小心，最好使用不透明的小容器，并在无其他操作需求时让动物自由进入装置。
8. 每次测试完成后，将动物放入临时隔离笼中，以防止其对居住笼中尚未测试的动物产生影响。
9. 雄性和雌性动物应在连续的不同日期进行测试。测试过程中应交替不同基因型的测试顺序，以平衡实验组之间不可预测的环境因素。
10. 在所有动物完成测试后，将其放回原居住笼，并送回饲养房间。
11. 若需对动物进行重复测试，每次测试之间应至少间隔1天。

2. 行为学测试

1. 高架十字迷宫（EPM）
   注意：C57BL/6NCrl 和 UBE3A 的雄性和雌性^mGenedel/+ 本研究在9至12周龄的小鼠品系中进行测试。测试时，雄性小鼠体重范围为22至36 g，雌性小鼠为18至28 g。
   1. 将十字形迷宫放置在摄像头正下方的测试平台上。使用墙上的电位器，借助照度计将迷宫中心的光照强度调节至70 lux，调节时将照度计传感器置于迷宫中心位置。
   2. 双击打开软件 观众 软件图标，并通过点击左上角的图标加载高架十字迷宫测试的配置文件 配置 加载EPM插件从 文件 菜单。使用计算机键盘在相应字段中填写动物信息——动物编号、基因型、性别以及实验信息（日期、光强）—— 实验 检查区域的位置、开放臂和封闭臂是否配置正确。通过视觉控制和计算机鼠标，确保虚拟轮廓区域与视频预览中的高架十字迷宫（EPM）实际区域相对应。
   3. 高架十字迷宫（EPM）是一种用于评估动物总体焦虑水平的行为学测试，其原理基于趋近-回避冲突。啮齿类动物天生倾向于回避明亮且无遮蔽的区域（开放臂），而偏好更安全的区域（封闭臂）。由于该全自动测试基于视频追踪系统，可由软件自动计算动物在各区域停留的时间以及进入次数。
   4. 测试期间，用视频记录动物的行为 通过 一种工业用红外光敏感相机。在记录过程中，允许软件实时检测动物的位置。随后，让软件自动分析动物的运动轨迹，以计算所有描述动物在迷宫中行为的参数。通过动物在致焦虑的开放臂中停留的时间以及进入开放臂的次数百分比，来评估动物焦虑样行为的程度。
      注意：定制迷宫由可透红外光的材料制成，并放置在发光二极管（LED）红外光源平台上。
   5. 将鼠标光标置于左上角的箭头图标上 采集 将动物从饲养笼中用手取出，轻柔地放置于高架十字迷宫（EPM）的中心区域。通过鼠标左键点击启动实验程序，随后立即离开实验房间。
   6. 记录协议在自由探索迷宫5分钟后结束，单击以保存 recorded 数据 好的 在协议终止后出现的窗口中，为文件命名，然后单击 保存将结果导出为每个测试动物的.csv文件，以便通过点击左侧垂直面板上的图标进行离线分析 数据分析 表。
   7. 用手将动物从迷宫中取出，并放入临时饲养笼中。以相同方式继续对所有动物进行测试。 单击以将所有测试动物的结果复制到记事本文件中，供离线分析使用 复制结果 图标在 高架十字迷宫 插件的结果标签页。
      注意：软件和硬件可能有所不同，必须遵循相关手册。此外，实验装置（如照明或计算机放置位置）可能因动物设施的构造而异。
2. 旷场实验（OF 实验）
   注意：开放旷场实验通过动物在新环境中的探索行为来评估其整体运动情况。此外，该实验也常用于在无保护、光照充足的环境中筛查动物的一般焦虑水平。本实验为完全自动化测试，采用视频追踪系统，该系统亦曾用于前一项实验。
   1. 将四个旷场实验箱放置在摄像头正下方的测试平台上。使用墙上的电位器，借助照度计将每个旷场实验箱中心的光照强度调节至200 lux，调节时将照度计传感器置于每个箱体的中心位置。
   2. 双击打开软件 观众 软件图标，并通过点击左上角的图标加载OF测试的配置 配置 表格。使用计算机键盘在相应字段中填写动物信息——动物编号、基因型、性别以及实验信息（日期、光强）—— 实验 检查区域位置（中心区和周边区）是否与旷场实验箱匹配，必要时进行调整。通过视觉控制和鼠标操作，确保虚拟标出的中心区和周边区与视频预览中的旷场实验对应区域相吻合。
   3. 测试期间，用视频记录动物的行为 通过 一台工业级红外光敏感相机。在录制过程中，允许软件实时检测动物的位置，并自动分析动物的运动轨迹，以计算出描述动物在开放旷场实验箱中行为的所有参数。行走距离、平均速度和静止时间用于评估动物在新环境中的活动能力，而进入中心区域的次数及在中心区域停留的时间则用于描述动物的类焦虑行为。
      注意：定制迷宫由可透红外光的材料制成，并放置在LED红外光源平台上。
   4. 将鼠标光标置于左上角的箭头图标上 采集 取出四个动物，用手将其从饲养笼中移出，并轻轻放入每个开放场测试箱的角落。通过点击计算机鼠标左键启动实验程序，然后立即离开实验房间。
   5. 当自由探索迷宫的实验方案在10分钟后结束时，通过点击保存数据 好的 在协议终止后出现的窗口中，为文件命名，然后单击 保存将结果导出为每个测试动物的.csv文件，以便离线分析，方法是单击左侧垂直面板上的图标 数据分析 表。
   6. 用手将动物从迷宫中取出，并放入临时饲养笼中。以相同方式继续对所有动物进行测试。分析导出的数据。
      注意：软件和硬件可能有所不同，必须遵循相关手册。此外，实验装置（如照明、迷宫数量或计算机放置位置）可能因动物设施的构造而异。
3. 悬尾试验（TST）
   注意：使用自动化悬尾装置同时对三只小鼠进行测试。
   1. 将房间光照强度维持在100-120 lux。
   2. 将TST系统与计算机连接 通过 USB线缆。将USB接收器插入计算机，然后通过双击启动软件 BIO-TST 软件图标。在 设置 标签下方 全球，调节 采集时长 到 360 s. 在 实验 标签，选择 新增主题列表，并按照打开的标签页中的说明创建一个新的实验文件和新的受试者列表。
   3. 点击开始运行 开始运行 | 继续 在 采集 用单面胶带（如透皮医用胶带）缠绕动物以准备测试 3/4 从尾基部开始的动物尾部
   4. 将悬吊钩穿过胶带，把动物悬挂在钩上。悬挂后立即点击按钮，开始单独采集每只动物的数据。 开始 在每只动物的可视化位置下方放置图标，并在测试期间持续观察动物。
   5. 完成第一组动物的数据采集后，点击 启动下一次运行将动物从挂钩上取下，剪刀沿尾部小心剪断粘附在尾部的胶带以将其移除，然后将动物放入临时饲养笼中。
   6. 用75%酒精和纸巾清洁仪器，并按照上述方法对剩余动物进行操作。在 分析 标签，选择采集数据的最后4分钟进行分析，然后选择所有有效的运行数据 分析周期，点击 分析选定的受试者，选择所需的数据格式，然后单击 导出选定数据 导出收集的数据以进行进一步分析。
      注意：测试持续6分钟。前2分钟内，动物会剧烈挣扎，但在随后的4分钟内，随着绝望反应占主导，此期间的静止时间将用于分析。软件和硬件可能有所不同，需遵循相应的操作手册。此外，设备本身也可能存在差异（例如，测试位置的数量）。
4. 步态分析
   1. 打开跑步机并手动设置 传送带速度设为 20 cm/s 在设备面板上点击 + 或 - 位于速度指示器旁的符号。顺时针旋转旋钮以打开设备光源。启动 DigiGait 成像仪 通过双击软件图标启动软件并进行设置 快门速度 到 100 用于 白化小鼠 或 130 用于黑色/深色小鼠 在该领域中 快门速度.
   2. 用手将第一只动物从饲养笼中取出，轻轻放置于跑步机传送带上。关闭动物舱室的门，并目视检查以确保动物尾巴未被夹在门与框架之间。
   3. 让小鼠在记录前先探索跑带。通过将跑带设置为缓慢行走速度约3秒，然后停止，持续观察动物，以确认其能够完成测试。
   4. 通过按压启动皮带 开始 按下设备面板上的按钮，记录约10秒。确保可观察到至少10-15步清晰且流畅的运动。通过按下按钮停止传送带 停止 按下设备面板上的按钮，然后用手将小鼠放回临时安置笼中。
   5. 通过点击筛选录制内容，以获取具有流畅步骤的图像序列 播放 并使用视觉对照复查记录结果 编辑 模式。通过手动将10-15个流畅动作的起始帧和结束帧编号输入相应字段来选择从第#帧 第一帧 为了 填写动物信息——动物编号、出生日期、性别、体重、跑带速度和跑带角度，并在需要时于相应字段中添加备注。通过点击保存文件以供进一步分析 保存.
   6. 用水清洁传送带，并以相同方式继续处理其余动物。 相机 继续记录下一只动物的行走。当所有动物的记录完成后，进行数据分析。
      注意：无法以设定速度在跑带上传送的动物将被排除在测试之外。根据我们的经验，老年动物（超过50周龄）在跑台上行走时会遇到更多困难，其发生频率因基因型而异，介于2%至50%之间。动物排泄物收集于跑台前方或后方的托盘中。每次实验结束后清空托盘，并用温肥皂水清洗。跑带用湿布擦拭。
   7. 基于对动物足印视频记录的全自动分析进行步态分析。调整数据以 DigiGait 分析 软件
      注意：步态分析不仅可评估运动协调性，还可基于动态步态信号的分析提供详细的运动学描述，该信号反映了动物连续跨步过程中足爪触地位置的时间变化历程。软件可自动测量以下参数：摆动时长、摆动期占步周期的百分比、制动时长、制动期占步周期的百分比、推进时长、推进期占步周期的百分比、支撑时长、支撑期占步周期的百分比、步周期时长、制动期占支撑期的百分比、推进期占支撑期的百分比、摆动与支撑时长比值、步长、步频、足爪角度、足爪角度变异性、支撑宽度、步角、步长变异性、步宽变异性、步角变异性、步长变异系数、支撑宽度变异系数、步角变异系数、摆动时长变异系数、峰值支撑时的最大足爪接触面积、峰值支撑时足爪接触面积的变异性、后肢共支撑时长、共支撑期占步周期的百分比、左右后肢支撑时长比值、步态对称性、制动阶段足爪与跑带接触面积变化的最大速率、推进阶段足爪与跑带接触面积变化的最大速率、tau-推进值、足爪重叠距离、足爪定位、共济失调系数、中线距离、轴线距离以及足爪拖拽。软件允许对步态轨迹中的少量噪声进行校正，该步骤应在统计分析前完成。不同软件与硬件系统可能存在差异，须遵循相应的操作手册。
5. 转棒实验
   注意：转棒实验用于评估啮齿类动物的运动功能——平衡能力和运动协调性。该实验要求小鼠在固定直径（5 cm）的旋转棒上行走，棒的转速在一定时间（5 min）内逐渐加速，直至动物无法继续停留在棒上。
   1. 通过按下按钮开启旋转棒设备 开/关 打开设备，然后通过双击启动软件 杆 软件图标。在新文件中初始化 文件 标签，并将其另存为合适的名称。在 设置 窗口中填写实验详情，例如日期、用户姓名以及任何必要的备注。设置 速度分布图 到 300 s, 初始速度 到 4 rpm，以及 终末速度 到 40 rpm.
   2. 为受试动物制定实验时间表 动物 区域，并将每只动物分配到杆上的相应位置。软件中不会明确标示这些位置，但它们与列表中的行相对应；例如，第一行对应杆上的第一个位置，第五行对应杆上的第五位置，依此类推。请记得在实验组之间对每根杆的位置进行平衡设计。
      注意：可同时测试五只动物。
   3. 关闭 设置 通过点击面板 关闭 并单击打开测量面板 测量开始杆的初始旋转 4 rpm 通过点击 开始/停止 将前五只动物放置到指定位置上。当所有动物都置于杆上后，点击开始测试程序。 开始个人资料，转杆将在5分钟内逐渐加速至40 rpm。如果动物在实验开始前从转杆上掉落，应将其放回转杆上。
      注意：动物通常在第一次尝试时无法在转棒上停留足够长的时间，因此无法一次性将所有小鼠同时放置于棒上。开始时以恒定速度旋转转棒，放置动物的过程中需保持耐心。该实验的目的并非测定动物在固定转速下于棒上的耐力，而是确定动物无法继续停留在转棒上的转速。转棒的转速与动物在棒上的停留潜伏期成正比，因此可用于反映动物的平衡能力。
   4. 将所有动物从转棒上跌落或5分钟后，将其转移至临时安置笼中。清除动物排泄物，并用酒精清洁转棒和托盘。
   5. 点击 动物 -> 以相同方式继续进行下一组动物的实验。在测试完所有动物后，关闭 测量 通过点击窗口 关闭 并单击 展示 以显示采集的数据。点击以 .csv 文件格式导出采集的数据，用于进一步分析 导出 CSV.
   6. 每只动物在杆上测试三次，每次试验间隔15分钟。取三次试验中跌落潜伏期的平均值用于后续统计分析。通过连续5天重复测试，评估动物的运动学习能力。
      注意：软件和硬件可能有所不同，必须遵循相关手册。此外，设备本身也可能存在差异，例如测试位点数量、整体结构和杆的尺寸。
6. 巢材撕碎-筑巢行为
   1. 将动物分开放入配备标准设备（垫料、饲料网和供水装置）的单个聚碳酸酯小鼠笼中，饲养1周。用镊子取约12 g棉花筑巢垫料，使用天平手动记录其重量，随机放置于笼内，但需位于供水装置的对侧。将装有动物的笼子放回饲养室。
   2. 每天在同一时间手动使用天平称量每个垫料的重量，持续4天。将重量记录在纸上或预先准备好的电子表格中。称重前确保每个垫料处于干燥状态；若潮湿，需先在加热垫上烘干，然后将所有垫料同时放回其对应的小鼠笼中，位置应为小鼠筑巢的位置。如果垫料被撕成多个部分，仅称量其中最大的一块。
   3. 在数据分析时，将每天巢材重量的减少量表示为相对于初始重量的百分比，以已使用材料的百分比形式呈现。
      注意：将雄性动物重新放回同一笼具可能导致动物间攻击性增加并造成不必要的伤害。因此，为避免影响动物福利，应将巢材撕碎测试安排在实验流程的后期进行。

结果

高架十字迷宫和旷场实验
高架十字迷宫（EPM）和旷场（OF）实验利用了啮齿类动物探索新环境的自然倾向^18,19。这种探索行为受趋近-回避冲突的调控，即动物在探索新环境的欲望与回避潜在危险之间进行权衡。动物会探索未知区域以寻找庇护所、社交接触或觅食资源，但新环境也可能存在捕食者或竞争者等风险因素。旷场实验和高架十字迷宫均包含安全区和风险区：旷场实验中分别为周边区域和中央区域，高架十字迷宫中分别为闭臂和开臂。啮齿类动物天生更偏好黑暗、封闭的空间，而非开阔、高悬且光线明亮的区域。因此，对风险区/致焦虑区域探索减少——表现为进入次数减少、停留时间缩短或首次进入潜伏期延长——是动物焦虑样行为的特征表现^8,11。静止时间、平均速度和总移动距离则提供了有关动物自发活动水平的额外信息。在 UBE3A^mGenedel/+ 突变体中，无论是旷场实验还是高架十字迷...

讨论

在不同小鼠品系中建立的AS模型通常通过检测动物的情绪状态、运动功能和认知能力来验证，以便与人类症状进行比较^31,32。AS模型中最一致的发现是运动功能障碍，其次为突变体情绪状态无明显改变以及筑巢能力受损^31,32,33。相比之下，认知障碍则较轻微或不存在^7,31,33。认知表型的差异似乎取决于受试动物的年龄，Huang等人⁷的研究已表明了这一点。因此，本文选择了一系列测试方法，主要基于其可重复性以及与年龄和物种无关的特性，因为在小鼠和大鼠AS模型中均观察到了可比较的结果^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
独立通风笼具	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	设备为招标提供，未提供目录 编号，亦无法在公司网站上查到	用于小鼠步态的详细分析，提供硬件和软件。
FDA Nestlet 方形垫料	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	材料通过直接邮件请求从 Velaz 供应商处购买。Velaz 未提供任何目录编号	用于筑巢实验的棉质垫料。垫料规格：每片 2–3 g，直径约为 5 × 5 × 0.5 cm。
小鼠饲料	Altramion
转棒仪	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	设备为招标提供，未提供目录 编号，亦无法在公司网站上查到	适用于 5 只小鼠的转棒仪，提供硬件和软件。滚筒尺寸：直径 30 mm，每条通道宽度 50 mm，跌落高度 147 mm。
尾悬吊实验装置	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	货号：BIO-TST5	全自动设备，用于评估 3 只尾部悬挂小鼠的不动时间，提供硬件和软件
透气医用胶带	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	用于将动物尾部固定在挂钩上的胶带。
Viewer - 视频追踪系统	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	设备及软件为招标提供，未提供目录 编号，亦无法在公司网站上查到	配套定制硬件的软件系统：迷宫、红外底板、红外敏感摄像头。定制开放场（OF）尺寸：42 × 42 cm 区域，49 cm 高的侧壁，中心区域面积：39 cm2。定制高架十字迷宫（EPM）离地高度 50 cm，开放臂长 79 cm，宽 9 cm；封闭臂长 77 cm，宽 7.6 cm。