利用癌细胞系生成线粒体杂交细胞

摘要

本方案描述了一种从悬浮生长的癌细胞中生成胞质杂交细胞的技术，可用于研究线粒体在肿瘤发生过程中的作用。

摘要

近年来，致力于阐明线粒体与癌症之间关联的研究数量显著增加。然而，要全面理解线粒体改变与肿瘤发生之间的联系，并鉴定与肿瘤相关的线粒体表型，仍需付出更多努力。例如，为了评估线粒体在肿瘤发生和转移过程中的作用，必须了解肿瘤细胞的线粒体在不同细胞核环境中的影响。为此，一种可行的方法是将线粒体转移到不同的细胞核背景下，从而获得所谓的胞质杂交细胞（cybrid细胞）。在传统的胞质杂交技术中，将缺乏线粒体DNA（mtDNA）的细胞系（ρ⁰细胞，即细胞核供体细胞）重新植入来自去核细胞或血小板的线粒体。然而，去核过程需要细胞对培养皿具有良好的黏附能力，而这一特性在许多侵袭性细胞中部分或完全丧失。此外，传统方法的另一个难点在于，难以完全清除线粒体受体细胞系中的内源性mtDNA，从而获得纯净的细胞核与线粒体DNA背景，避免所生成的胞质杂交细胞中存在两种不同的mtDNA分子。在本研究中，我们提出了一种基于将分离的线粒体导入经罗丹明6G预处理的悬浮生长癌细胞的线粒体交换方案。该方法能够克服传统技术的局限性，因而可作为研究线粒体在癌症进展和转移中作用的重要工具。

引言

重编程能量代谢是癌症的一个标志性特征¹，该现象最早由 Otto Warburg 在 20 世纪 30 年代首次观察到²。在有氧条件下，正常细胞将葡萄糖转化为丙酮酸，后者进一步生成乙酰辅酶A，为线粒体功能提供燃料并促进细胞呼吸。然而，Warburg 发现，即使在常氧条件下，大多数癌细胞仍会将糖酵解过程产生的丙酮酸转化为乳酸，从而改变其能量获取方式。这种代谢调整被称为"Warburg 效应"，它使某些癌细胞能够满足其快速生长和分裂的能量需求，尽管其 ATP 生成效率低于有氧代谢过程^3,4,5。近几十年来，大量研究支持了代谢重编程在癌症进展中的重要作用。因此，肿瘤能量代谢被视为抗癌治疗的一个重要靶点¹。作为能量代谢和必需前体物质供应的核心枢纽，线粒体在这些细胞适应性变化中发挥着关键作用，而迄今为止，我们对这些机制的理解仍较为有限。

根据上述观点，线粒体DNA（mtDNA）突变被认为是导致这种代谢重编程的可能原因之一，这些突变可能导致电子传递链（ETC）功能受损⁶，从而解释为何某些癌细胞会增强其糖酵解代谢以维持生存。事实上，已有研究报道，在癌细胞中mtDNA会积累突变，且至少在50%的肿瘤中存在此类突变⁷。例如，Yuan等人最近的一项研究发现，在肾癌、结直肠癌和甲状腺癌中存在高度突变且截短的mtDNA分子⁸ 。此外，大量研究已证实，某些mtDNA突变与更具侵袭性的肿瘤表型以及癌细胞转移潜能的增强相关^{9,10,11,12,13,14,15,16}。

尽管线粒体基因组在癌症进展中具有明显的重要性，但由于目前可用的实验模型和技术存在局限性，研究这些突变及其对疾病发展的贡献一直面临挑战¹⁷。因此，迫切需要开发新技术以深入了解线粒体DNA在癌症发生和进展中的真实影响。在本研究中，我们介绍了一种基于悬浮生长癌细胞的转线粒体胞质杂交细胞（cybrid）的构建方案，该方法通过将分离的线粒体导入经罗丹明6G预处理的细胞中实现细胞质重编程，克服了传统胞质杂交技术的主要难题^18,19。该方法允许使用任何核供体细胞，而无需依赖相应的ρ⁰细胞系，同时可实现从传统技术难以去核的细胞（例如非贴壁细胞系）中转移线粒体。

方案

注意：所有培养基和缓冲液的成分均在表1中详细列出。在构建胞质杂交细胞（cybrid）之前，必须对供体和受体细胞的线粒体DNA和核DNA进行基因分型，以确认两种细胞系在两种基因组中均存在遗传差异。本研究中使用了一种 commercially available L929 细胞系及其衍生细胞系 L929dt，后者为本实验室自发产生的细胞系（更多信息参见¹³）。这两种细胞系在其mt-Nd2基因序列中存在两处差异，可用于在胞质杂交过程完成后验证线粒体DNA的纯度¹³。在本实验中，核基因组背景的纯度通过抗生素敏感性加以验证，因为与 L929dt 细胞不同，L929 细胞对遗传霉素（geneticin）具有抗性。

1. 使用罗丹明6G处理去除线粒体（受体细胞）

注意：成功的细胞质杂交体（cybrid）生成的第一步是彻底且不可逆地消除受体细胞中的线粒体功能。为此，必须预先针对每种细胞系确定使用罗丹明6G（rhodamine 6G）的合适浓度和处理时间。该适宜浓度应略低于药物诱导细胞死亡的阈值（即在处理过程中不导致细胞死亡的最高浓度）。在确定最佳条件后，执行以下步骤。

1. 使用完全培养基将10⁶个细胞接种于6孔板中（详见表1），并根据细胞系的不同，每天用最适浓度的罗丹明6G处理3-10 天。传统处理浓度为2至5 µg/mL，持续3-10天^20,21。本研究中，对L929来源的细胞选用2.5 µg/mL罗丹明6G处理7天^13,22。
2. 为维持细胞存活，需在细胞培养基中添加50 µg/mL尿苷和100 µg/mL丙酮酸盐，并每24小时更换一次培养基。
3. 处理结束后、融合前，将经罗丹明6G处理的细胞培养基更换为不含罗丹明6G的完全培养基，并在37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养3-4小时。
   注意：罗丹明6G的毒性作用是不可逆的，线粒体功能丧失的细胞不应恢复活性²⁰。因此，处理后的细胞若未获得功能性线粒体，即使在添加尿苷的培养基中也应死亡，故无需进行核筛选。然而，建议设置一组经罗丹明6G处理但未接受线粒体的细胞作为融合对照。

2. 扩增与线粒体分离（供体细胞）

1. 在罗丹明6G处理期间扩增线粒体供体细胞，以获得约25 × 10⁶个细胞。
2. 第7天，将处于指数生长期的细胞收集至50 mL离心管中，在室温（RT）下以520 × g离心5分钟进行收集。用冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，每次在室温下以520 × g离心5分钟沉淀细胞。从此时起，所有线粒体提取步骤均需在4 °C下进行，使用预冷试剂，并将含有细胞或线粒体的离心管置于冰上操作。
3. 第三次离心后，使用连接真空泵的玻璃移液管吸弃上清液，并将压紧的细胞重悬于体积为细胞沉淀体积7倍的低渗缓冲液中。然后将细胞悬液转移至匀浆管中，冰上孵育2分钟使细胞膨胀。
4. 使用电动研杵（转速600 rpm）在匀浆器中进行8至10次研磨，以破坏细胞膜。
   注意：不同细胞类型的细胞膜破裂步骤可能有所差异，因此需针对每种细胞类型进行优化。
5. 向细胞悬液中加入等体积的高渗缓冲液（相当于细胞沉淀体积的7倍），以形成等渗环境。
6. 将匀浆液转移至15 mL离心管中，在固定角转子中于4 °C下以1,000 × g离心5分钟。随后，仅吸取上清液的3/4，远离沉淀部分留出足够边缘，以避免核或完整细胞的污染，并将上清液转移至另一离心管中。重复该过程两次。注意应保留上清液，弃去沉淀。
7. 保留线粒体组分（上清液），将其转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以最大速度（18,000 × g）离心2分钟。
8. 弃去上清液，用缓冲液A洗涤富含线粒体的沉淀，将两个离心管中的内容合并为一个，并按照步骤2.7所述条件进行离心。重复该过程，直至所有材料集中于同一离心管中。
9. 再用300 µL缓冲液A进行一次额外洗涤，并使用Bradford法测定线粒体蛋白浓度²³。对于每次胞融合实验，需确定用于转移操作的最佳线粒体量（在本实验中，每10⁶个细胞使用10–40 µg线粒体蛋白为宜）。
10. 同时，将经罗丹明6G预处理的细胞用于融合：收集至15 mL离心管中，在室温下以520 × g离心5分钟。注意由于罗丹明6G处理，细胞沉淀呈现亮粉色。
11. 为确保受体细胞中线粒体功能已完全消除，且供体细胞的细胞器纯化操作正确，取少量经罗丹明6G处理的细胞和分离的线粒体，使用完全培养基接种于6孔板中，培养一个月，观察各孔中是否无任何存活细胞（图2）。
12. 同时，通过核蛋白免疫检测（如lamin beta、组蛋白H3等）或对核基因（如SDH、18S rRNA等）进行定量聚合酶链式反应（qPCR）扩增，评估线粒体组分中是否存在核污染。
    注意：为避免污染，建议所有操作均在层流罩内无菌条件下进行。

3. 融合与胞质杂交体的生成

1. 进行融合时，小心地将10⁶ 经罗丹明6G处理的细胞加入分离得到的线粒体沉淀（含线粒体蛋白10–40 µg）中，于520 × g 离心5分钟，使细胞与线粒体充分混合。
2. 加入100 µL聚乙二醇（PEG，50%），轻轻重悬沉淀30秒，随后静置30秒，避免扰动。
3. 最后，将混合物转移至含新鲜完全细胞培养基的6孔板中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱内培养。数天后（通常为1周），应可见转线粒体杂交细胞开始生长（图2），形成可单独挑选或混合成池后进行分析的克隆。

4. 线粒体和细胞核背景的双重验证

注意：一旦新细胞系建立且细胞开始呈指数生长，必须验证其线粒体DNA和核DNA的纯度。因此，原始细胞系的基因组中应含有不同的突变或基因多态性，以便于识别。

1. 总DNA提取
   1. 采用商业化的基因组DNA提取试剂盒（参见材料表）或使用苯酚-氯仿-异戊醇抽提结合醇沉淀的标准方案，提取用于构建胞质杂交细胞的所有细胞系的基因组DNA²⁴。
2. 线粒体DNA（mtDNA）检测（图3）
   注意：可采用多种技术（如测序、限制性片段长度多态性（RFLP）分析或等位基因特异性qPCR）来分析mtDNA纯度。为通过RFLP确认mtDNA序列变异的存在，请遵循以下实验步骤。
   1. 通过PCR扩增包含目标核苷酸变化的mtDNA片段。
      1. 此处，L929dt细胞在mtDNA的mt-Nd2基因内第4206位点存在一个突变（m.4206C>T），而L929细胞中无此突变。为确认该替换在线粒体转导胞质杂交细胞中的存在，使用标准PCR方案及以下引物扩增一段397 bp的片段：1）5'-AAGCTATCGGG
         CCCATACCCCG-3'（位置3862-3884）和2）5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG-3'（位置4236-4258）。
   2. 使用能识别该序列变化并在线粒体DNA突变型与野生型之间产生不同切割模式的特异性内切酶，通过RFLP分析目标核苷酸替换的存在情况。
      注意：当存在L929dt的mtDNA变异（4206T）时，步骤4.2.1中获得的PCR产物包含两个SspI（参见材料表）的酶切位点，产生306 bp、52 bp和39 bp的三条DNA片段。当野生型（WT）C4206存在时，生成52 bp和39 bp条带的酶切位点被破坏，取而代之出现一条91 bp的新条带。因此，分析中包含SspI完全酶切的内部对照。酶切反应在37 °C下进行，具体操作遵循试剂生产商的说明。
   3. 通过电泳分离限制性酶切片段，并比较条带模式。
      1. 完成酶切后，使用10%聚丙烯酰胺-Tris-硼酸-EDTA（TBE）凝胶进行电泳分析（TBE 1x溶液的组成参见表1）。在室温下以80 V恒压电泳1小时。电泳结束后，在含溴化乙锭的1x TBE染色液中染色15分钟（染色液组成参见表1），随后观察DNA条带。
3. 核DNA基因分型
   注意：核DNA基因分型应使用此前用于RFLP分析的DNA提取样品进行。
   1. 使用一组商业化的特异性寡核苷酸混合物，扩增16个位点（D21S11、CSF1PO、vWA、D8S1179、TH01、D18S51、D5S818、D16S539、D3S1358、D2S1338、TPOX、FGA、D7S820、D13S317、D19S433和AMEL）（参见材料表）。
   2. 使用遗传分析仪进行电泳，以分离上述扩增产物。
      注意：扩增完成后，使用毛细管电泳系统对各基因座进行分析（参见材料表）。片段在一根50 cm长的毛细管中分离，毛细管内填充商业聚合物。阴极和阳极缓冲液亦为商业化产品，详见材料表。电泳条件为60 °C下19.5 kV恒压运行20分钟。
   3. 使用生物信息学工具确定每个扩增位点对应的等位基因（参见材料表）。
   4. 将步骤4.3.3获得的数据与核DNA基因分型数据库（表1）进行比对，以确认核DNA图谱是否与线粒体受体细胞系的图谱一致（图4）。

结果

按照上述方案操作后，应获得一种同质性胞质杂交细胞系，其细胞核背景保持不变，但具有新的线粒体基因型，如图1和图2示意图所示。胞质杂交细胞中线粒体DNA和细胞核DNA的纯度可通过RFLP分析确认，如图3所示；也可通过细胞核DNA基因分型分析确认，如图4所示。

如果线粒体转移成功，则融合细胞系的RFLP分析结果必须显示出与受体细胞系不同的酶切条带模式，并且与线粒体供体细胞系完全相同。为此，必须谨慎选择限制性内切酶，确保两种细胞系经酶切后产生的条带模式存在差异。图3给出了一个示例，展示了野生型（WT）线粒体和突变型（MUT）线粒体经SspI酶切后所获得的限制性片段。对于新构建的线粒体置换细胞系，其限制性片段与相应线粒体供体细胞系一致，而与核供体细胞扩增子产生的片段不同。因此，该检测证实线粒体交换...

讨论

自从奥托·瓦尔堡（Otto Warburg）报道癌细胞会改变其代谢方式并增强"有氧糖酵解"^3,4，同时降低线粒体呼吸作用以来，人们对线粒体在癌症发生和进展中作用的兴趣呈指数级增长。近年来，线粒体DNA（mtDNA）突变和线粒体功能障碍已被假定为多种癌症类型的标志性特征²⁵。迄今为止，已有大量研究分析了特定肿瘤的mtDNA变异^{6,26,27,28,29,30,31,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3500XL 遗传分析仪	ThermoFisher Scientific	4406016
6 孔板	Corning	08-772-1B
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR 扩增试剂盒	ThermoFisher Scientific	4427368
3500 系列阳极缓冲液容器	Applied Biosystems	4393927
硼酸	PanReac	131015
Bradford 法蛋白定量试剂盒	Biorad	5000002
3500 系列阴极缓冲液容器	Applied Biosystems	4408256
细胞培养瓶	TPP	90076
DMEM 高糖培养基	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
溴化乙锭	Sigma-Aldrich	E8751
遗传霉素（Geneticin）	Gibco	10131027
聚四氟乙烯匀浆器研杵	Deltalab	196102
L929 细胞系	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 凝胶电泳系统	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR 引物	Sigma-Aldrich	定制产品
30% 丙烯酰胺溶液	PanReac	A3626
聚乙二醇	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini 试剂盒	Qiagen	51306
罗丹明-6G	Sigma-Aldrich	R4127
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
链霉素/青霉素	PAN biotech	P06-07100
蔗糖	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
尿苷	Sigma-Aldrich	U3750