方法文章

基于超快速扩增子的非小细胞非鳞状肺癌下一代测序

DOI：

10.3791/65190

⸱

2023年9月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, 2Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 3Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 4FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, 5Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, 6Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）治疗管理中需检测的分子生物标志物日益增多，推动了快速且可靠的分子检测方法的发展。本文介绍了一种采用超快速下一代测序（NGS）技术对NS-NSCLC患者进行基因组变异评估的工作流程。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，针对非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者靶向治疗所需检测的分子改变数量显著增加。对于晚期或转移性NS-NSCLC患者，检测分子异常是实现最佳诊疗的必要步骤，有助于实施靶向治疗并改善总体生存率。然而，这些肿瘤会发展出可能通过新型疗法干预的耐药机制。某些分子改变还可能影响治疗反应。根据国际指南建议，NS-NSCLC的分子特征分析必须在短时间内完成， turnaround time（TAT）应少于10个工作日。此外，用于基因组分析的组织活检来源多样，且随着微创方法和检测方案的发展，样本尺寸持续减小。因此，病理学家面临在维持高效快速诊断策略的同时，开展有效分子检测技术的挑战。本文介绍了在NS-NSCLC患者诊断日常实践中所采用的超快速扩增子-based下一代测序（NGS）工作流程。我们证实，该系统能够在符合要求的TAT内，识别胸科肿瘤学精准医疗中当前所使用的分子靶点。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近十年来，靶向治疗和免疫治疗的发展显著提高了非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）的总生存期（OS）1,2。因此，近年来在治疗NS-NSCLC时需要分析的必需基因和分子靶点数量也有所增加3,4。

目前国际指南推荐进行检测 EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET，以及 MET 晚期非鳞状非小细胞肺癌诊断时5此外，由于近期一些新药在临床试验中取得了非常有前景的结果，很快将对更多基因进行额外的基因组变异筛查，特别是 KRAS 和 HER2，以及 BRAC1/BRAC2，PI3KA, NRG1, 和 NUT6,7,8,9此外，不同相关基因的状态，例如 STK11, KEAP1，以及 TP53 可能对更准确地预测某些靶向治疗和/或免疫检查点抑制剂（ICIs）的治疗反应或耐药性具有重要意义10,11,12.

重要的是，必须在无明显延迟的情况下报告分子改变，以确保临床决策的严谨性。若缺乏对肿瘤的分子特征分析，可能导致启动非靶向治疗，例如单独或联合免疫治疗的化疗，从而形成次优的治疗策略，因为在具有可操作性分子改变（如EGFR突变或基因融合）的患者中，化疗的疗效有限13。

此外，目前在新辅助和/或辅助治疗背景下靶向治疗/免疫治疗的进展，可能导致需要系统性地至少对早期非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）检测EGFR和ALK的改变，因为免疫检查点抑制剂（ICIs）仅应用于EGFR和ALK野生型的肿瘤14。现在也必须对早期NS-NSCLC患者检测EGFR突变的存在，因为奥希替尼（第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂）可用于EGFR突变型NS-NSCLC的辅助治疗15。

在非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者中，评估不同生物标志物以预测对各种靶向治疗和/或免疫治疗反应的策略正在迅速发展，这使得这些生物标志物的逐一识别变得愈发困难3,16。在此背景下，下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）现已成为对NS-NSCLC中基因变异进行高通量并行分析的最佳方法5,17。

然而，NGS 工作流程可能难以掌握，并可能导致更长的周转时间18,19因此，许多中心仍然采用序贯方法（免疫组织化学（IHC）、荧光 原位 杂交（FISH）和/或靶向测序）。然而，该策略在样本量较小时存在局限性，尤其是由于非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）中需要检测的可操作性突变数量不断增加20因此，能够快速评估基因改变的超快速且简便的检测方法，在优化临床决策中变得愈发重要。此外，针对特定靶向治疗的处方，使用经批准和认证的分子检测系统正逐渐成为强制性要求。

本文介绍一种用于非小细胞肺癌（NS-NSCLC）分子检测的超快速、全自动扩增子测序DNA/RNA高通量测序（NGS）检测方法，该方法由法国尼斯大学医院临床与实验病理学实验室（LPCE）应用，并已通过法国认可委员会（COFRAC）依据ISO 15189标准认证（https://www.cofrac.fr/）。COFRAC认证表明，该实验室在分子分析领域开展的自动化NGS测序检测项目，符合ISO 15189标准以及COFRAC在测试/校准活动中的应用规则。通过国际公认的ISO 15189标准认证，证明该实验室在特定检测范围内具备技术能力，并建立了适当的管理体系以确保检测工作的规范运行。本文还讨论了该检测流程从组织活检样本制备到报告出具全过程中的优势与局限性。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有操作均已获得当地伦理委员会（法国尼斯大学医疗中心人类研究伦理委员会，肿瘤库编号 BB-0033-00025）的批准。所有患者均已签署知情同意书，同意使用其样本及生成的数据。所有样本均来自 2022 年 9 月 20 日至 2022 年 1 月 31 日期间在法国尼斯 LPCE 诊断为非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）的患者，采集作为医疗护理的一部分。

1. 使用自动化纯化仪器（API）制备FFPE DNA和RNA样本（处理时间：5小时15分钟）

  1. 在仪器上运行方案规划。
    1. 打开仪器电源，使用用户名和密码登录（材料表）。通过点击创建纯化运行方案 运行，然后 添加方案，并通过为运行计划命名。
    2. 然后，选择合适的纯化试剂盒及方案，用于从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中依次纯化DNA和RNA。纯化后进行定量检测。
    3. 从下拉列表中选择所需的洗脱体积（50 µL），然后单击 下一步选择将要提取的样本数量。
    4. 然后选择每个样本，单击 编辑，输入 样本编号，然后单击 保存.
  2. 使用GPI制备FFPE DNA和RNA样本
    1. 准备石蜡包埋组织样本（使用切片机切取4片厚度为10 µm的切片），或直接在石蜡包埋块上进行大体解剖。将每份石蜡包埋组织样本分别放入已标记的石蜡包埋样本处理管中材料表).
    2. 2000 x g 离心 g 1 分钟，以使组织沉淀至管底。
    3. 向每个FFPE样本处理管中加入由核酸纯化试剂盒制备的蛋白酶消化主混合液，在60 °C孵育至少60分钟（材料表). 将样品在 90 °C 下孵育 60 分钟。
    4. 孵育后，将样品在室温（RT）下冷却5分钟。
    5. 对于每个FFPE样本处理管，提起内管，向左旋转锁定，然后以2000 x g离心样本 g 10 分钟。
    6. 向右旋转打开内管，将其与外管分离并丢弃。将外管中的样品置于冰上保存，直至上样至API。
    7. 配制DNase消化主混合液，并将其加入预装的FFPE DNA和RNA纯化板2中。然后，将制备好的样品加入FFPE DNA和RNA纯化板1中材料表).
  3. 在API上启动纯化运行。
    1. 在 API 界面上，点击 运行，选择 运行方案，然后点击 下一步.
    2. 根据屏幕提示，将纯化运行所需的耗材和试剂加载到API中材料表).
    3. 当所有试剂加载完毕后，单击 下一步关闭API门并点击 开始.
    4. 运行结束后，单击 卸载 在触摸屏上操作后，立即取出含有纯化后样本DNA和RNA的48孔核酸存档板。
    5. 导出定量结果。密封培养板并将纯化后的样品于-80 °C保存。将96孔板转移至测序仪进行分析。
  4. 创建样本并创建运行。
    1. 打开软件并登录，然后在菜单栏中选择 样品 并单击 创建样本.
    2. 输入样本名称、性别和肿瘤细胞百分比，并根据需要填写必填项和选填项。
    3. 保存详细信息（性别和肿瘤细胞百分比对于分析拷贝数变异 [CNVs] 至关重要）。
    4. 选择 运行 和 核酸 到 结果 在菜单栏中。
    5. 输入运行名称 设置 步骤。点击 下一步.
    6. 选择检测方法在 检测方法 步骤。点击 下一步.
    7. 选择样本中的 样本 运行检测的步骤。
    8. 然后，在 精选实验方法 窗格中，单击 分配. 点击 下一步.
    9. 检查样品输入板上的样品位置。点击 下一步.
    10. 查看运行计划摘要，然后 保存 & 打印 或 保存.

2. 测序仪上的自动化NGS（处理时间：30分钟）

  1. 加载样本板。
    注意：最佳核酸浓度为 0.5 ng/µL。已验证的核酸浓度范围为 0.33–1 ng/µL。对于 DNA 和 RNA，实验室已验证 1 ng/µL 的浓度。
    1. 测序仪需要总共 20 µL 的体积。确保有足够的体积用于上样。
    2. 将阳性对照（DNA 和 RNA）以及 NTC（DNA 和 RNA）添加至纯化仪的第一阶段，无需进行提取。每次运行均需使用 DNA 和 RNA 对照以验证运行过程及所用批次。在 API 运行结束时，将 DNA 和 RNA 对照加入板中。
  2. 加载测序仪并启动运行。
    1. 从冰箱或冷冻柜中取出所有试剂，并在室温下解冻至少 30 分钟（材料表），最长不超过 12 小时。
    2. 在实验室中，根据供应商在现场培训期间提供的建议，始终保持测序仪处于开启状态。登录系统。
    3. 将纯化仪中的样本板（包含样本）密封后，用一张粘性 PCR 板箔膜封板（材料表），然后加载到测序仪中。
    4. 将所有耗材安装到仪器载台。测序仪会提供逐步指示，提示将每个所需耗材安装至高亮显示的位置（材料表）。
    5. 检查 Strip 2-HD 的第 3 号管中是否有沉淀物。如有需要，轻弹管子或轻轻涡旋混合条带以溶解沉淀。
    6. Strip 1 和 Strip 3 含有磁珠。此步骤非常关键：必须确保磁珠充分重悬，管子上部不得残留磁珠。
    7. 将条带倒置并翻转 3–4 次以使磁珠混匀。一手握住条带一端，使条带密封面向上，然后迅速向下甩动条带，利用快速的离心手臂动作完成，并以手腕的快速轻弹结束动作。
    8. 在 300 × g 条件下离心 15 秒。如有需要可重复一次。使用适配器和条带架对条带进行离心，以尽量减少因磁珠残留在条带上部而随机出现的失败情况。
    9. 关闭系统并点击 下一步。安装测序试剂舱门（材料表），关闭舱门。测序仪将自动开始运行。
  3. 清洁
    1. 运行结束后进行清洁时，当运行完成，点击 下一步。
    2. 舱门将依次打开。按照屏幕上的指示清空废液并移除所有耗材。点击 下一步。
    3. 完成清洁后关闭载台，点击 下一步。系统将开始 2 分钟的紫外清洁。测序仪即可准备启动下一次运行。

3. 使用集成软件分析结果（每位患者的分析时间 [DNA 和 RNA 样本]：15 分钟）

注意：该技术已获得法国认可委员会（COFRAC）ISO 15189 认证（https://www.cofrac.fr/）

  1. 数据与结果
    1. 在 结果 菜单中选择一个运行结果或样本结果。在 结果/运行结果 界面中，将列出所有运行记录。
    2. 通过列标题中的筛选功能搜索结果列表。
    3. 点击 结果 ，然后点击 样本结果。接着，在样本名称列中点击目标样本的名称，以查看该唯一样本的测序结果。
    4. 点击屏幕左上角的 列 ，或从表格中取消选中某些列以隐藏。
  2. 查看质控结果及扩增子覆盖度。
    1. 在 结果 界面中点击 质控 标签页。
    2. 对于DNA样本，需确保中位数绝对成对差异（MAPD）在0至0.5之间，以验证拷贝数变异（CNV）分析的有效性。比对上的读段数必须超过150万。
    3. 对于RNA样本，检查比对上的读段数是否在15万至40万之间。低于此范围可能导致假阴性，高于此范围则可能导致假阳性。
    4. 点击某个样本名称以打开 关键发现 标签页。
    5. 向下滚动至扩增子 覆盖度图。
    6. 审阅覆盖度图。由于供应商未提供最低覆盖度阈值，需自行定义。为确定合适的范围和阈值，可混合一个对照样本和一个野生型（WT）样本，然后观察一个或多个选定突变位点的扩增子覆盖度最小值。
  3. 查看变异结果。
    1. 如需以表格格式导出数据，请点击屏幕右上角的 导出 按钮。
    2. 要查看单核苷酸变异/插入缺失变异（SNV/INDEL）结果，请点击 变异 标签页，然后点击 SNV/InDel。点击 编辑筛选条件，并选择 无筛选。
      注：根据法国国家癌症研究所（INCA）专家组的建议，灵敏度阈值已设定为5%（https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes）。
    3. 查看 融合 结果及 RNA外显子变异：点击 变异 标签页，然后点击 融合。
    4. 在右上角点击 可视化 和 RNA外显子变异，然后审阅 RNA外显子变异 图谱。
    5. 使用该试剂盒可检测 EGFR、MET 和 AR 基因的外显子跳跃现象。点击 可视化 可更便于分析。
    6. 查看RNA外显子片段融合不平衡：点击 变异 标签页，然后点击 融合。
    7. 在右上角点击 可视化 和 RNA外显子片段融合不平衡，然后审阅 RNA外显子片段融合不平衡 图谱。融合不平衡是指已知伙伴基因与未被检测面板覆盖的伙伴基因之间的融合。
    8. 查看CNV结果：在 变异 标签页中点击 CNV 以显示数据。
      注：在分析CNV结果时，必须谨慎对待样本准备过程中提供的性别信息及肿瘤细胞百分比。由于 AR 基因仅存在于 X 染色体上，若未注明性别，男性样本可能出现信号丢失，从而导致男性患者出现假阳性结果。
  4. 审阅插件结果。
    1. 审阅 覆盖度分析 插件结果：在右上角点击并选择下载文件。
    2. 覆盖度分析 插件会生成一份 覆盖度分析报告。
    3. 审阅分子 覆盖度分析 插件结果：在右上角点击并选择下载文件。该分析用于验证所有扩增子是否均被覆盖，并确认软件提供的拷贝数变异（CNV）结果。
  5. 查看检测指标与运行报告
    1. 在 运行概要 中点击 运行报告 标签页。
    2. 要查看 运行报告，请在下拉菜单中选择 选择样本 选项。
    3. 检测指标与运行报告：在屏幕顶部可找到测序指标，随后在 运行样本 表格中列出各样本的具体指标。
      注：客户支持归档（CSA）文件中的信息有助于排查结果问题，但无法直接进行分析。CSA文件汇总了整个运行的数据，并在运行失败时突出显示可能的问题原因。
    4. 下载运行报告：点击 报告 标签页。
    5. 点击 下载报告 以PDF格式下载运行报告摘要。
  6. 生成变异报告。
    1. 在 设置 步骤中启用 生成报告 功能，以便在运行数据分析期间自动为每个样本生成变异报告。
    2. 生成某个样本的变异报告后，系统将在两个位置提供该报告：首先，在 结果/样本结果 界面中提供一个链接，点击该链接即可下载PDF文件。
    3. 其次，进入 报告 标签页中的 变异报告 面板，点击 下载报告 按钮。可对变异报告进行电子签名或手动签名。
      注：已进行电子签名的报告在 样本结果 界面中其样本名称后会显示（签发）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

根据我们近期发表文献中详细描述的方法21，我们建立了一种最优的分子变异检测流程，作为非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者临床常规诊断中的反射性检测，采用基于超快速扩增子的下一代测序技术。该方法的分子检测流程见图1，检测 panel 所包含的基因列表见补充图1。

对259例非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者进行了分子分析。样本包括153例支气管活检、47例经胸壁活检、39例外科手术标本，以及来自13例胸腔积液和7例支气管内超声引导下穿刺（EBUS）的25例细胞块（表1）。在242例有效的或可进行的NGS DNA/RNA分析中检测到以下驱动基因突变：KRAS（25.4%）、EGFR（18.2%）、BRAF（6.3%）、ERBB2（1.7%）和MET（1.7%）。检测到的基因融合包括：ALK（4.3%）、ROS1（2...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

开发一种基于超快速扩增子的NGS方法，作为在任何分期的非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）诊断时进行分子改变评估的补充检测，是检测所有指南推荐及新兴生物标志物的最佳选择5,22,23。尽管序贯检测方法（如IHC、PCR、FISH）仅针对特定基因且可能导致组织样本耗尽，但该NGS工作流程可在核酸量较低的情况下（根据本研究，每项DNA和RNA测序最低需13 ng），对50个基因的突变、融合和扩增状态进行特异且敏感的全面评估。

此外，该方法可为非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者的管理提供快速且具有临床意义的结果。与定制化方法相比，该方法无需根据肿瘤分期预先筛选待分析病例，也无需等待医生提出检测申请，从而节省了宝贵的时间。已有研究表明，对晚期非小细胞肺癌直接进行高通量测序（NGS）检测可直接影响患者的总体生存率24,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Christophe Bontoux 参与Thermo Fisher Scientific的付费演讲活动并从中获益。Paul Hofman 参与Thermo Fisher Scientific的付费演讲活动，并获得利益和资助。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢赛默飞世尔科技公司为我们提供了使用其设备和材料的机会。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔硬壳透明板Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)4483354
PCR 板用粘性封膜Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)AB0626
AutoLys M 管 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A38738FFPE 样本处理管
Genexus 条形码 1-32 HDThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40261
Genexus GX5 芯片和 Genexus 耦合器Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40269
Genexus 移液器吸头Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40266
Genexus 纯化仪Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A48148自动化纯化仪器 (API)
Genexus 测序试剂盒Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40271
Genexus 模板制备条带 3-GX5 和 4Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40263
Genexus 集成测序仪Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA 纯化组合试剂盒Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) 面板（包含条带 1 和 2-HD）Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A46291

参考文献

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