一种用于FACS分离的小鼠卫星细胞的CUT&RUN分析的有效方案

摘要

这里介绍的是一种有效的方案，用于小鼠肢体肌肉卫星细胞的荧光激活细胞分选（FACS）分离，适用于研究肌肉纤维中的转录调控，方法是在靶标下切割并使用核酸酶（CUT&RUN）释放。

摘要

小细胞群的全基因组分析是研究的主要制约因素，特别是在干细胞领域。这项工作描述了一种有效的协议，用于从肢体肌肉（一种结构蛋白含量高的组织）中分离卫星细胞的荧光激活细胞分选（FACS）。通过在补充有分散酶和 I 型胶原酶的培养基中切碎来机械地破坏成年小鼠的解剖肢体肌肉。消化后，匀浆通过细胞过滤器过滤，细胞悬浮在FACS缓冲液中。用可固定的活力染色测定活力，并通过FACS分离免疫染色的卫星细胞。用 Triton X-100 裂解细胞，释放的细胞核与刀豆球蛋白 A 磁珠结合。将细胞核/微珠复合物与针对目标转录因子或组蛋白修饰的抗体一起孵育。洗涤后，将细胞核/微珠复合物与蛋白 A-微球菌核酸酶一起孵育，并用 CaCl₂ 开始染色质裂解。提取DNA后，建立文库并进行测序，通过生物信息学分析获得全基因组转录因子结合和共价组蛋白修饰图谱。获得的各种组蛋白标记的峰表明，结合事件对卫星细胞具有特异性。此外，已知基序分析显示转录因子 通过其 同源反应元件与染色质结合。因此，该方案适用于研究成年小鼠肢体肌肉卫星细胞中的基因调控。

引言

骨骼横纹肌平均占人体总重量的 40%¹。肌肉纤维在受伤时表现出显着的再生能力，这可以通过新形成的肌细胞的融合和取代受损肌纤维的新肌纤维的产生来描述²。1961年，亚历山大·毛罗（Alexander Mauro）报道了一组单核细胞，他称之为卫星细胞³。这些干细胞表达转录因子配对盒 7 （PAX7），位于基底层和肌纤维肌节之间⁴。据报道，它们表达分化簇 34（CD34;一种造血、内皮祖细胞和间充质干细胞标志物）、整合素 α7（ITGA7;一种平滑、心脏和骨骼肌标志物）以及 C-X-C 趋化因子受体 4 型（CXCR4;一种淋巴细胞、造血和卫星细胞标志物）⁵。在基础条件下，卫星细胞位于特定的微环境中，使它们保持静止状态⁶。肌肉损伤后，它们被激活、增殖并发生肌生成⁷。然而，它们只占肌肉细胞总数的一小部分，它们的全基因组分析特别具有挑战性，尤其是在生理环境下（占总细胞的<1%）。

已经描述了从卫星细胞中分离染色质的各种方法，包括染色质免疫沉淀，然后进行大规模平行测序 （ChIP-seq） 或靶标切割和标记 （CUT&Tag） 实验。然而，这两种技术存在一些....

方案

小鼠被饲养在经认可的动物舍中，符合国家动物护理指南（欧盟委员会指令86/609/CEE;法国第87-848号法令）关于使用实验动物进行研究。根据 APAFIS 编号 #22281 下的 2010/63/EU 指令，将预期的操作提交给伦理委员会（Com'Eth，斯特拉斯堡，法国）和法国研究部 （MESR） 进行伦理评估和授权。

1.通过荧光激活细胞分选（FACS）制备用于分离卫星细胞的细胞悬液（图1）

1. 肌肉组织的分离
   1. 使用清洁剂对肌肉解剖工具（包括镊子、手术刀和剪刀）进行去污（表 1），并用蒸馏水彻底冲洗。
   2. 准备两个 2 mL 管（表 1），每个管含有 1 mL 肌肉分离缓冲液，并将它们放在冰上以收集收获的肌肉。
   3. 通过CO₂ 窒息后宫颈脱位处死两只10周龄的C57 / Bl6J雄性小鼠。在每只小鼠上喷洒70%乙醇。用镊子从后肢剥离皮肤。解剖股骨，胫骨和腓骨周围的所有肢体肌肉（每只小鼠约1mg肌肉）。
      注意：卫星细胞数量在 15 周龄后减少。
   4. 将收获的肢体肌肉放入含有1mL肌肉分离缓冲液的2mL管中，该管在步骤1.1.2中制备。按照相同的步骤从第二只鼠标收集肌肉....

结果

通过结合Gunther等人（以下简称方案1）¹² 和Liu等人²³ （以下简称方案2）的方案从小鼠骨骼肌中分离卫星细胞。由于当使用方案1中提出的胶原酶和分散酶的浓度时，在消化后观察到未消化的肌纤维，因此增加酶的量以改善肌纤维解离，如步骤1.2.1和1.2.3所述。如方案2所示，将样品在水浴中轻轻搅拌以保持细胞活力。如方案1所述，我们通过细胞过滤器进行过滤，并与红细胞裂解缓冲液一起孵育（参见步骤1.2.7至1.2.10）。在方案 1 中，以 30%/70% 的 Percoll 密度梯度加载细胞，以在间期分离单核细胞，这可能导致目标细胞丢失。因此，正如第2号议定书所提议的那样，这一步骤被省略了。

FSC-A与SSC-A门控用于根据大小（FSC）和粒度（SSC）鉴定单核细胞（图3A）。通过忽略FSC-A轴上低于40 K的事件来排除碎片，并选择了38.8%±3.6%的细胞。FSC-A与前向散射高度（FSC-H）门控密度图用于双峰排除（<.......

讨论

本研究报告了一种标准化、可靠且易于执行的小鼠卫星细胞分离和培养方法，以及通过 CUT&RUN 方法评估转录调控。

该协议涉及几个关键步骤。首先是肌肉破坏和纤维消化，以确保收集到的大量细胞。尽管酶浓度增加，但获得的活细胞比使用方案 1 更多。卫星细胞表达各种膜蛋白的特定模式。为了提高分选的严格性，我们使用了先前描述的阴性（CD31、TER119、CD45 和 CD11b）和阳性（CD34、ITGA7 和 CXCR4）卫星细胞标志物的组合^30,31。使用这种策略，平均获得了1%的活体推定卫星单元。这一结果在预期的范围内，因为卫星细胞占小鼠成年期肌肉细胞群的 2%-7%³²。作为卫星细胞选择标志物的对照，分离出CD34+/ITGA7-/CXCR4-细胞。免疫荧光染色表明，虽然CD34+/ITGA7-/CXCR4-细胞不表达PAX7，但70%的CD34+/ITGA7+/CXCR4+分选细胞对该卫星细胞特异性标志物呈阳性，从而证.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微管	Eppendorf	2080422
2 mL 微管	Star Lab	S1620-2700
5 mL 试管	CORNING-FALCON	352063
50 mL 试管	Falcon	352098
抗 AR abcam	ab108341
抗 CD11b	eBioscience	25-0112-82
抗 CD31	eBioscience	12-0311-82
抗 CD34	eBioscience	48-0341-82
抗 CD45	eBioscience	12-0451-83
抗 CXCR4	eBioscience	17-9991-82
抗 DMD	abcam	ab15277
抗 H3K27ac	活性基序	39133
抗 H3K4me2	活性基序	39141
抗 ITGA7	MBL	k0046-4
抗 PAX7	DSHB	AB_528428
抗 TER119	BD 法明根 TM553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
细胞过滤器 100 和微量;m	康宁®	431752
细胞过滤器 40 和微量;m	康宁®	431750
细胞过滤器 70 & micro;m	康宁®	431751
心机 1	Eppendorf	521-0011	离心机 5415 R
离心机 2	Eppendorf	5805000010	心机 5804 R
室滑轨系统	ThermoFischer	171080	系统&坟墓;我 Nunc™实验室-Tek™腔室载玻
片清洗剂	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
胶原酶，I  型;	赛默飞世尔	17100017	10 mg/mL
分散酶	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
可固定活力染色剂	BD Biosciences	565388
流式细胞仪	BD FACSAria™融合流式细胞仪	23-14816-01
DAPI 的荧光接载 G	Invitrogen	00-4959-52
基因组浏览器	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
甘油	Sigma-Aldrich	G9012
水凝胶	Corning®	354277	Matrigel hESC 合格矩阵
处理软件	Image J®		V 1.8.0
实验室胶片	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM®M
Liberase LT	罗氏	5401020001
没食子酸丙酯	Sigma-Aldrich	2370
测序仪	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
摇水浴	Bioblock Scientific polytest 20	18724