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体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

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DOI：

10.3791/65218

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2023年4月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Electrical Engineering, KAIST, 2Department of Biology, Chungnam National University, 3KAIST Institute for Health Science and Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种实验方案 体内 利用三维荧光显微镜对幼年斑马鱼进行全脑成像。实验步骤包括样品制备、图像采集和可视化。

摘要

作为一种脊椎动物模型，斑马鱼幼鱼被广泛应用于神经科学研究，可提供以细胞分辨率监测全脑活动的独特机会。本文提供了一种优化的实验方案，用于利用三维荧光显微镜对斑马鱼幼鱼进行全脑成像，内容包括样品制备与固定、样品包埋、图像采集以及成像后的可视化。该方案能够 体内 使用共聚焦显微镜和定制荧光显微镜对幼年斑马鱼大脑在细胞分辨率水平上进行持续超过1小时的结构与神经元活动成像。本文还讨论了该方案中的关键步骤，包括样品的固定与定位、防止琼脂糖凝胶中产生气泡和灰尘污染，以及避免因琼脂糖凝胶未完全凝固或鱼体麻痹不充分而导致的图像运动伪影。该方案已在多种实验条件下得到验证和确认。本方法可轻松适用于幼年斑马鱼其他器官的成像。

引言

斑马鱼 (Danio rerio) 因其幼体阶段具有光学透明性、发育迅速、维护成本低以及拥有多种遗传学工具等优势，已被广泛采纳为神经科学领域的重要脊椎动物模型1,2,3,4。特别是，幼鱼的光学透明性结合可遗传编码的生物事件荧光报告系统5,6,7,8,9，为在全脑范围内成像神经元活动与结构提供了独特的机会10,11,12,13,14。然而，即使使用支持细胞分辨率的显微镜，所获得的图像也不一定能够保留单细胞水平的信息；图像质量可能因样品固定所用琼脂糖凝胶引入的光学像差而下降，鱼体可能以倾斜角度固定，导致感兴趣区域未能完全处于显微镜视野范围内，且在记录过程中鱼体可能发生移动，从而在图像中产生运动伪影，或妨碍从图像中准确提取信号。

因此，需要一种高效且可重复的实验方案，以获取噪声最小、运动伪影最少的高质量图像数据。然而，目前公开可用的斑马鱼幼鱼全脑活体成像方案in vivo15,16,17,18,19 仅对操作流程进行了简要描述，许多关键细节——例如琼脂糖凝固过程、精确的固定技术以及使用镊子进行样本定位等——仍依赖于实验人员自行决定。此外，琼脂糖浓度和固定方法的不一致10,11,14,15,16,17,18,19 可能导致成像过程中鱼类发生移动，从而引发技术挑战。

本文提供了一种利用三维荧光显微镜对幼年斑马鱼进行全脑成像的详细实验方案。 图1 为幼年斑马鱼大脑的结构与功能成像提供了实验方案的图示化概述：包括样品制备与固定、样品包埋、图像采集以及成像后的可视化。 在体 使用商用共聚焦显微镜和定制设计的荧光显微镜进行演示。该方案可根据实验需求和设计，由研究人员针对特定感觉刺激或行为情境下的脑成像进行调整。

方案

所有斑马鱼实验均经韩国科学技术院（KAIST）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（编号：KA2021-125）。用于繁殖的成年斑马鱼共12条，其背景为casper [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)]，并具有钙指示剂GCaMP7a的全神经元表达 [Tg(huc:GAL4);Tg(UAS:GCaMP7a)]。该群体包括8条雌鱼和4条雄鱼，年龄范围为3至12个月。成像实验在受精后3至4天（d.p.f.）的斑马鱼幼鱼上进行，此阶段尚无法确定其性别。

1. 斑马鱼样品制备

  1. 在含有卵水的培养皿中（见材料表），收集所需转基因品系成鱼（如 Tg(huc:GAL4);Tg(UAS:GCaMP7a)20,21,22）交配后获得的胚胎。将胚胎置于28 °C的培养箱中孵育，培养至3–4 d.p.f.（受精后天数）的幼鱼23,24,25。
    1. 若斑马鱼品系背景非白化品系，为抑制色素形成，需在受精后24小时（h.p.f.）将胚胎转移至含有200 µM 1-苯基-2-硫脲（PTU；见材料表）的卵水中培养的培养皿中25,26。每隔24小时，将鱼转移至新的含有200 µM PTU的新鲜卵水培养皿中。
      注：斑马鱼在标准条件下饲养，温度为28 °C，光照周期为14小时光照:10小时黑暗。已知PTU处理会影响幼鱼的行为及甲状腺功能27,28。因此，使用PTU时需谨慎，并在实验中仔细控制可能的混杂因素。
  2. 为筛选表达目标荧光蛋白（例如全神经元表达的GCaMP7a）的样本，需在落射荧光显微镜下对样本进行观察，并选择荧光表达强烈的个体。
  3. 将选定的3–4 d.p.f.斑马鱼样本置于盛有卵水的培养皿中（图2A）。
    注：为记录自发性神经元活动，建议使用80–100 h.p.f.的样本，因为在80 h.p.f.之前自发活动水平较低，而即使在casper背景品系中，100 h.p.f.之后色素发育也可能降低图像质量。
  4. 通过将1 mL浓度为2.5 mg/mL的储备液（见材料表）加入10 mL卵水中，配制0.25 mg/mL的泮库溴铵溶液14,19,29,30,31。将泮库溴铵溶液分装至1.5 mL微量离心管中。
  5. 使用转移移液器将预筛选的样本转移至培养皿中。
    注：尽量减少随样本转移的卵水体积。
  6. 向培养皿中加入0.1 mL泮库溴铵溶液以实现麻痹。
    ​注：泮库溴铵可能对幼鱼神经活动具有潜在的抑制作用32。必须谨慎考虑泮库溴铵的浓度及暴露时间。

2. 2% (wt/vol) 琼脂糖凝胶的制备

  1. 打开加热金属块，将目标温度设为 37 °C。等待仪器升温并稳定至设定温度。
  2. 将 0.2 g 低熔点琼脂糖粉末（见材料表）溶解于 10 mL 胚胎培养液中。
  3. 将琼脂糖溶液放入微波炉加热，并通过振荡和涡旋混匀，直至琼脂糖完全溶解。
  4. 将琼脂糖凝胶分装至 1.5 mL 微量离心管中，并将离心管置于加热金属块上（图 2B）。
    ​注意：检查琼脂糖凝胶中的气泡是否已消失。

3. 样品安装与定位

  1. 在体视显微镜下检查样本，确认幼鱼运动已停止，并通过观察心跳来目视评估样本的健康状况（图2C）。若心跳过慢，则弃用该样本。
    注意：如果待成像鱼类的心跳过慢（例如，低于每分钟60次），可能无法进行长期成像。为评估鱼类的健康状态，可通过与同一培养皿中其他鱼类的心率进行比较，以目视方式检查心率。这有助于确保待成像的鱼类健康且状态稳定，适合进行成像操作。
  2. 使用移液管将一条斑马鱼幼鱼转移至1.5 mL微量离心管中的琼脂糖凝胶内（图2D）。
    注意：转移样本后，请务必丢弃移液管。
  3. 将琼脂糖凝胶倒入培养皿中，形成1–2 mm厚的涂层。使用移液管将微量离心管中的样本转移至培养皿中，使幼鱼位于培养皿中央。
    注意：若琼脂糖凝胶中存在灰尘或气泡，请使用移液管将其去除。
  4. 使用镊子将样本调整至所需方向，使头部和尾部保持平整（图2E）。
  5. 用镊子旋转样本，使两只眼睛处于同一水平面（图2F）。
    注意：对齐操作（位置和旋转）应在琼脂糖凝胶开始凝固前完成。
  6. 完成对齐后，等待琼脂糖凝胶完全凝固（图2G、H）。
    注意：琼脂糖凝胶的凝固时间通常为5–10分钟，具体时间取决于凝胶的体积和大小。
  7. 琼脂糖凝胶完全凝固后，向培养皿中加入卵水，并将含有包埋样本的培养皿放置于显微镜载物台上（图2I）。

4. 图像采集

  1. 打开显微镜系统（例如激光器、共聚焦控制器、显微镜和计算机；参见材料表），并确认整个系统正常运行。
  2. 选择低倍率物镜，将样品置于视野中央。
  3. 选择合适放大倍数的水浸或浸水式物镜（例如16倍0.8数值孔径（NA）浸水物镜；参见材料表），并对视野进行精细调节。
  4. 使用图像采集软件设置成像参数（例如图像尺寸、激光功率、曝光时间、帧数）。
    注意：应根据具体需求设置成像参数以获得最佳效果（参见代表性结果部分中的图像采集设置）。若图像出现饱和现象，应降低激光功率。
  5. 通过移动载物台找到样品的脑部，并在软件的实时预览模式下手动上下调节焦平面，确定脑组织的厚度，设定成像体积的上下边界。
    注意：确保在整个侧向和轴向范围内，整个脑部均位于视野之中。
  6. 根据显微镜的轴向分辨率设定合适的z轴步进大小。
    注意：对幼年斑马鱼脑部进行三维成像时，最佳z轴步进大小取决于成像方式和显微镜的分辨率。例如，考虑到光片厚度及细胞体的平均直径，可采用5 µm的z轴步进大小10。
  7. 对已设定的视野进行图像采集。
    1. 对于三维结构成像，通过逐层改变焦平面并依次获取每个z平面的二维图像，从而获得整个脑部的三维（x,y,z）图像。
    2. 对于单个z平面的功能成像，在特定深度采集脑神经元活动的时间序列图像（x,y,t）。
    3. 对于三维功能成像，通过依次获取三维图像，记录整个脑部神经元活动的四维（x,y,z,t）图像。
      注意：设置帧数时需考虑计算机可用内存大小。由于泮库溴铵作用时间限制，建议总采集时间少于1小时。
  8. 完成图像采集后，保存结果并记录成像参数（例如像素大小、z轴步进大小、帧率、激光功率），用于后续图像分析。
  9. 以适当格式导出图像，用于数据可视化和图像分析。
    ​注意：推荐以标签图像文件（TIF）格式导出图像。TIF格式支持无损压缩，且兼容大多数图像处理软件和编程语言。此外，TIF格式支持嵌入元数据，如采集参数、图像分辨率及其他相关信息，有助于数据解读与实验可重复性。

5. 使用 napari 进行可视化的设置

注意：napari 是一个基于 Python 环境的开源多维图像查看器，支持基于图形处理器（GPU）的渲染33。napari-animation 插件可实现动画的程序化生成。建议使用 Fiji（一款开源图像处理程序）进行常规图像处理操作，例如滤波和几何变换（参见材料表）。用于 napari 可视化的源代码可在 GitHub 上获取（https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization）。

  1. 使用 pip 或 conda 安装 napari 和 napari-animation。安装完成后，创建一个新的 jupyter notebook 文件。
    注意：建议使用 jupyter notebook（一种 Python 的交互式工具），而非 Python 脚本运行。
  2. 导入 napari 和 napari-animation。

6. 使用 napari 可视化结构

  1. 为了可视化图像并创建斑马鱼脑的三维渲染视频，请加载三维图像（x, y, z）并打开 napari 窗口。连接 napari-animation 插件（图 3A）。
  2. 在图层控制中设置体素大小、颜色映射和对比度范围等参数。
  3. 在画布中调整视图设置（例如透视角度、视角方向）。
  4. 要捕获渲染后的图像，请点击动画向导中的 capture 按钮。
  5. 要生成渲染体积的视频，请修改视图设置并添加关键帧（图 3B）。
  6. 添加关键帧后，在动画向导中设置关键帧之间的帧数（步数），并保存渲染的动画。

7. 使用 napari 进行图像处理和神经元活动可视化

注意：为了将神经元活动的时间序列图像可视化为静态背景与活动的叠加图像，必须对原始图像应用分解算法。使用一种名为 BEAR24 的分解算法的 MATLAB 实现版本。BEAR 的 MATLAB 版本可在 GitHub 上获取（https://github.com/NICALab/BEAR）。

  1. 为分解静态背景与神经元活动，将 BEAR 方法应用于原始时间序列图像（x,y,t 或 x,y,z,t）。分解完成后，将背景和神经元活动的图像保存为 TIF 文件（图 3C）。
  2. 加载背景和神经元活动图像，并打开 napari 窗口。连接 napari-animation 插件。
  3. 对背景图像使用灰度 colormap，对神经元活动图像使用 hot colormap（图 3C）。
  4. 在图层控制中设置透明度和对比度范围等参数。
  5. 为生成神经元活动的视频，调整查看器设置，并添加关键帧以渲染动画。
  6. 添加关键帧后，在动画向导中设置关键帧之间的帧数（步数）。保存渲染后的动画。

结果

采用所述方案，对表达钙指示剂泛神经元 GCaMP7a（Tg(huc:GAL4);Tg(UAS:GCaMP7a)）20,21,22 并具有 casper（mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)）34 背景的幼鱼斑马鱼大脑在 3–4 天后（d.p.f.）进行了脑结构与神经元活动成像。

对于容积结构成像，使用配备16倍0.8数值孔径水浸物镜的商用点扫描共聚焦显微系统对样品进行成像。结构成像和功能成像均采用488 nm激发激光。成像帧率为0.25 Hz，图像分辨率为2048 × 2048，像素大小为0.34 µm，轴向步进为1.225 µm。图像采集耗时约1小时20分钟。所获取图像的容积视场覆盖了前脑、中脑和后脑的脑区（图4A）。在4天龄斑马鱼幼鱼全脑的共聚焦显微图像中，延髓、小脑板、视顶盖、缰核以及端脑背侧的神经元细胞体清晰可见（图4B）。共聚焦显微图像的三维重建采用napari软件27，按照前述方案进行（图4C和视频1）。

进行二维功能成像时，使用相同的共聚焦显微系统对样品进行成像，该系统配备16倍、0.8数值孔径的水浸物镜。成像帧率为2 Hz，图像分辨率为512 × 256，像素大小为1.5 µm。神经元胞体在背景以及叠加的神经元活动图像中均清晰可见（图5A、B）。

用于三维功能成像的定制三维显微成像系统18 被使用，其能够 体内 以1,040 µm × 400 µm × 235 µm的视场对整个斑马鱼幼鱼脑部的神经元活动进行成像，横向和轴向分辨率分别为1.7 µm和5.4 µm，成像速率达每秒4.2个体积。与结构成像数据的三维重建类似，使用napari对全脑钙成像数据进行三维可视化图5C 和 视频 2).

斑马鱼成像工作流程：样品制备、琼脂糖凝胶、图像采集、神经元活性分析。
图 1：实验流程概览。 斑马鱼样品制备与麻痹处理（步骤 1）。2%（wt/vol）琼脂糖凝胶制备（步骤 2）。样品安装与定位（步骤 3）。图像采集（步骤 4）。图像处理及结构与神经元活性可视化（步骤 5-7）。请点击此处查看本图的高清版本。

基因编辑过程；PCR工作站；斑马鱼胚胎；显微镜检查；CRISPR实验设置。
图2：全脑成像样本制备的实验流程。（A）在盛有卵水的培养皿中表达泛神经元标记物GCaMP7a的筛选后斑马鱼样本。（B）样本固定与定位所需的设备和材料。（1）37 °C加热块；（2）2%（wt/vol）琼脂糖凝胶；（3）1.5 mL 微离心管；（4）卵水；（5）0.25 mg/mL 潘库溴铵溶液；（6）培养皿；（7）镊子；（8）移液器。（C）麻痹后样本的体视显微镜图像。黑色箭头指向样本的心脏。（D）使用移液器将样本转移至1.5 mL微离心管中。插图显示方框区域的放大视图。（E）使用镊子将样本（黑色箭头）置于培养皿中央。（F）使用镊子对样本进行对齐。（G）嵌入后未对齐样本的示例。（H）嵌入后正确对齐样本的示例。（I）将样本置于显微镜载物台上物镜下方以进行图像采集。比例尺：500 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

3D神经元成像动画设置；强调神经元活动的可视化与空间分析。
图3：斑马鱼幼鱼脑部图像的可视化。（A）表达全神经元特异性GCaMP7a的斑马鱼幼鱼（4天龄）脑部共聚焦显微镜图像的三维重建。图像重建使用了napari，这是一个基于Python环境的开源多维图像查看工具。napari窗口包括图层控制区（红框）、图层列表（黄框）、画布区（蓝框）和动画向导（绿框）。（B）通过添加多个视图设置的关键帧来生成动画。（C）斑马鱼幼鱼脑部神经元活动的二维延时共聚焦显微图像。该图像被分解为背景信号（左）、神经元活动信号（中），然后进行叠加显示（右）。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

使用三维重建及标记的前脑、中脑、后脑进行斑马鱼脑成像。
图 4：幼年斑马鱼脑的成像结构。（A）表达全神经元特异性 GCaMP7a 的幼年斑马鱼（4 日龄）脑部共聚焦显微镜图像的最大强度投影（MIP）。上方：侧向 MIP。下方：轴向 MIP。各边界分别标注前脑（红色）、中脑（黄色）和后脑（蓝色）。（B）从脑部三维图像中获取的共 10 个不同深度的轴向切片（z = 25 µm、50 µm、75 µm、100 µm、125 µm、150 µm、175 µm、200 µm、225 µm、250 µm，自上而下计数；z = 0 µm 表示脑部顶端表面）。每个白色框代表脑部特定区域（延髓、小脑板、视顶盖、缰核和背侧端脑）。（C）使用 napari 渲染的全脑图像。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

脑活动成像，荧光显微镜；视顶盖中神经信号的三维可视化。
图 5：幼年斑马鱼脑部神经元活动的成像。（A）表达全神经元特异性GCaMP7a的幼年斑马鱼（4天龄）脑部神经元活动的共聚焦显微镜图像。比例尺：100 µm。（B）图A中框选区域的放大视图，显示在多个时间点视顶盖中的神经元活动。比例尺：20 µm。（C）使用定制显微镜获取的幼年斑马鱼全脑神经元活动的三维重建图像（左：t = 133 s；右：t = 901 s）。神经元活动叠加在静态背景上。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

斑马鱼大脑随时间变化的成像序列；荧光显微镜；时间进程分析。
图6：有无样品漂移情况下的延时成像。 （A）在存在样品漂移的情况下，对表达泛神经元标记GCaMP7a的幼年斑马鱼大脑进行延时成像。在琼脂糖凝胶固化前（步骤3.6–3.7），向样品中添加了卵水。鱼体在横向和轴向上发生移动。（B）在无样品漂移的情况下，对幼年斑马鱼大脑进行延时成像。在琼脂糖凝胶固化后（步骤3.6–3.7），向样品中添加了卵水。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：表达全神经元 GCaMP7a 的幼年斑马鱼（4 天龄）全脑结构的三维重建。 请点击此处下载该视频。

视频 2：表达全神经元 GCaMP7a 的幼年斑马鱼（4 日龄）大脑中全脑神经元活动的三维重建。 请点击此处下载该视频。

讨论

本方案可实现 体内 对幼年斑马鱼进行长时间（例如超过1小时）全脑成像，并对获取的结构和功能成像数据进行可视化。

最关键的步骤是样品的安装和定位。在包埋样品过程中，必须防止气泡产生并避免灰尘进入琼脂糖凝胶中。如果凝胶中含有气泡或灰尘，图像质量可能会严重下降。使用镊子定位样品时，应确保样品在水平和垂直方向上均保持水平。否则，目标区域可能无法完全位于显微镜的视野范围内。此外，该定位操作应在琼脂糖凝胶凝固前的短时间内完成，以避免对其表面造成损伤，因为此类损伤会降低成像质量。

另一个主要挑战是避免因琼脂糖凝胶未完全凝固（图6）以及斑马鱼未充分麻痹所导致的图像运动。当琼脂糖凝胶尚未完全凝固时即向样品中加入养鱼用水，鱼类会在横向和轴向上缓慢移动，表现为时间序列图像中的样品漂移（图6A）。如果麻痹剂剂量不足或药效持续时间结束，样品可能试图移动，这会在延时图像中表现为快速抽搐。

尽管上述步骤对于获取无运动伪影的高质量图像至关重要，但目前公开可用的实验方案15,16,17,18,19 仅对实验流程进行了简要概述，缺乏这些细节。例如，在未使用固定化方案的情况下所获取的图像11 存在显著的运动伪影，导致后续图像分析困难。通过整合关键步骤，如琼脂糖凝胶固化和样本麻痹处理，本实验方案显著提高了所获图像质量的一致性，同时最大限度减少了运动伪影。

总之，一种经过优化且可重复的实验方案为 体内 描述了对幼年斑马鱼脑部的成像方法。本方案的有效性与可重复性 体内 脑活动与结构的成像已在多种环境中得到验证14,18,29,30,31本工作流程主要针对幼年斑马鱼的全脑成像，但也可轻松应用于幼年斑马鱼其他器官的成像。35,36.

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

用于钙成像的斑马鱼品系由韩国斑马鱼疾病建模中心（ZCDM）提供。本研究由韩国国家研究基金会资助（2020R1C1C1009869，NRF2021R1A4A102159411，RS-2023-00209473）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管SciLabSL.Tub3513用于分装琼脂糖凝胶和泮库溴铵溶液
15 mL Falcon 管Falcon352096用于配制琼脂糖凝胶和泮库溴铵溶液
16× 0.8NA 水浸物镜NikonCFI75 LWD 16×W用于全脑成像的物镜
1-苯基-2-硫脲（PTU）Sigma-AldrichP7629-10G200 μM 的 1-苯基-2-硫脲（PTU）
50 mL Falcon 管Falcon352070用于配制胚胎培养用水
一次性移液管SciLabSL.Pip3032用于转移斑马鱼幼体
胚胎培养用水N/AN/A10 L 去离子水中加入 0.6 g 海盐
镊子Karl Hammacher GmbHHSO 010-10用于样品定位的镊子
低熔点琼脂糖Thermo ScientificR08012%（wt/vol）琼脂糖凝胶
NapariNapariN/A用于三维可视化显微图像
NIS-Elements CNikonN/A共聚焦显微镜成像软件
泮库溴铵Sigma-AldrichP1918-10MG0.25 mg/mL 的泮库溴铵溶液
培养皿，35 mmSPL Life Sciences11035用于样品包埋的培养皿
培养皿，55 mmSPL Life Sciences11050用于筛选后斑马鱼幼体的培养
点扫描共聚焦显微系统（C2 Plus）NikonN/A用于全脑成像的共聚焦显微镜
海盐 Sigma-AldrichS9883-500G用于配制胚胎培养用水的海盐

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