小鼠背根神经节冷冻切片操作流程

摘要

本文介绍了如何稳定获取高质量的背根神经节冰冻切片的方法。

摘要

高质量的小鼠背根神经节（DRG）冷冻切片对于炎症性疼痛、神经病理性疼痛、瘙痒以及其他周围神经系统疾病研究中的免疫组织化学染色和RNAscope分析至关重要。然而，由于DRG组织样本体积微小，要始终如一地获得高质量、完整且平整地贴附于载玻片上的冷冻切片仍是一项挑战。迄今为止，尚无文献详细描述DRG冷冻切片的最佳操作方案。本方案提供了一种逐步解决DRG冷冻切片过程中常见困难的方法。本文详细说明了如何去除DRG组织样本周围的液体，将DRG切片以一致的方向置于载玻片上，并使切片在载玻片上保持平整而不翘起。尽管该方案是为DRG样本的冷冻切片而开发，但也可适用于其他多种小样本量组织的冷冻切片操作。

引言

背根神经节（DRG）包含初级感觉神经元、组织巨噬细胞以及围绕初级感觉神经元的卫星细胞^1,2,3,4。它是处理无害性和有害性信号的关键解剖结构，在疼痛、瘙痒以及多种周围神经疾病中发挥重要作用^{5,6,7,8,9,10,11,12,13}。尽管已有多种方法用于从小鼠脊髓中分离DRG组织^14,15,16，但DRG组织的冷冻切片仍具挑战性，因为DRG组织体积较小，且冷冻切片样本容易卷曲成卷状，难以将其完整转移至载玻片上。然而，准确的DRG组织冷冻切片对于免疫组织化学研究以及DRG感觉神经元结构的观察至关重要^{17,18,19,20,21,22,23}。此外，单细胞RNA测序结果已揭示人类²⁴和小鼠²⁵中DRG感觉神经元具有显著的异质性，因此，准确的DRG组织冷冻切片对于研究不同DRG细胞在各种生理和病理条件下的功能作用至关重要。

尽管组织透明化技术已应用于背根神经节三维重建的研究²⁶ 作为DRG冰冻切片的一种替代技术，组织透明化技术耗时且费力。相比之下，DRG冰冻切片操作快速且相对简便，因此仍是DRG及其他中枢神经系统区域进行免疫组织化学和结构研究的关键技术。然而，由于组织样本体积微小（如DRG及某些脑区），如何将高质量、完整且平整的冰冻切片转移至载玻片上，仍是神经科学研究中的一项挑战。目前尚无文献报道针对小尺寸组织样本（如小鼠DRG）冰冻切片的最佳操作方案。

本方案提供了一种简单、逐步的冷冻切片技术，用于对小鼠背根神经节（DRG）进行切片，可稳定地在载玻片上获得大量高质量的DRG切片，以用于后续的DRG研究。尽管该技术专为DRG样本的冷冻切片设计，但也可望用于其他样本量较小的多种组织的冷冻切片。

方案

本研究的动物实验已获得加州大学旧金山分校（UCSF）动物照护与使用委员会的批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》进行。实验中使用成年、8至12周龄的C57BL/6雄性和雌性小鼠（本单位繁育）。

1. 背根神经节样本制备

1. 用2.5%阿佛丁（Avertin）麻醉小鼠（见材料表）。通过检测对疼痛刺激无反应来确认麻醉充分。如前所述，经心脏灌注1×磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注4%甲醛^14,15,16。
2. 如前所述，从小鼠脊髓中解剖背根神经节（DRG）组织^14,15,16。
3. 将解剖得到的DRG在4%甲醛中室温后固定3小时。
4. 将DRG置于含30%蔗糖的PBS溶液中，4 °C过夜。
5. 制备最佳切割温度（OCT）包埋基底
   1. 将OCT包埋剂（见材料表）加入铝块表面，覆盖其顶部，于-20 °C冷冻5–10分钟（图1A）。
   2. 使用冷冻切片机（见材料表）以30 µm厚度切去OCT顶部，直至其表面与基底OCT齐平（图1B）。
   3. 在从冷冻切片机取下铝块前，在基底OCT底部（六点钟位置）做一标记，以指示其方向（图1C）。
   4. 在后续步骤中，始终保持该标记位于六点钟位置，以维持相同方向，从而获得更多的DRG切片。
      注意：若方向丢失，导致DRG样本以不同角度被切割，则无法自上而下完整切完DRG样本，部分样本将残留在基底OCT上而被浪费，因为在尝试切取DRG时会遇到基底OCT的阻碍（图1C）。
6. 进行DRG的OCT包埋
   1. 在将DRG放置于OCT前，需将其干燥。
      1. 在将DRG置于铝块前，务必去除样本周围的30%蔗糖/PBS溶液。
      2. 将DRG样本置于干燥的培养皿上（图2A），用干燥镊子将其在培养皿内移动两到三次以干燥（图2B）。
      3. 在处理下一个DRG样本前，用无绒纸巾擦干镊子（图2C）。
   2. 将干燥的DRG置于基底OCT上。
      1. 用干燥镊子将干燥的DRG置于基底OCT的12点钟位置（图1D）。
      2. 确保DRG上缘与基底OCT上缘之间至少保留5 mm距离。
      3. 将DRG的背侧置于12点钟位置，腹侧置于六点钟位置（图1D）。
   3. 用OCT包埋DRG组织。
      1. 加入更多OCT，将整个DRG样本覆盖成圆形或椭圆形，确保DRG位于中央（图1E）。
      2. 确保覆盖OCT的上缘与基底OCT的上缘齐平（图1F），这有助于将切片转移至载玻片上（图3A）。
         注意：若覆盖OCT位于基底OCT中央，则基底OCT的上缘会阻碍载玻片收集切片（图3B）。
      3. 将覆盖OCT及DRG样本再次于-20 °C冷冻5分钟（图1G）。切勿修剪DRG样本周围的OCT。
      4. 以30 µm厚度切去覆盖OCT的顶部，直至DRG可见。

2. 背根神经节的冷冻切片

1. 将冷冻切片机的切片厚度调整为 12 µm，以将背根神经节（DRG）组织切片切至载玻片上（图 1H）。
2. 用一支预冷至 -20 °C 的小号画笔托住 OCT 包埋块底部。
   注意：切片时不应将整个组织完全切断，需保留 1–3 mm 不切断（图 1I）。
3. 使用室温镊子的末端轻轻触碰切片底部（六点钟位置），使其粘附于切片台表面（图 1J）。此操作可防止切片向内卷曲成卷，从而便于将切片完整转移至载玻片上。
   注意：当切片底部粘附于切片台表面，而切片顶部仍与覆盖的 OCT 包埋介质相连时，切片呈平坦状态（图 1K），此时更易于将其完整转移至载玻片上。
4. 取一张带电荷的玻璃载玻片（见材料表），缓慢将其覆盖在切片上。一旦切片开始粘附至载玻片，即轻轻向后拉动载玻片（图 1L）。
5. 重复上述步骤，将更多 DRG 切片转移至同一载玻片上，注意避免切片相互重叠（图 1M）。确保新的 DRG 切片不覆盖在另一 DRG 切片的 OCT 包埋区域上（图 4），否则该切片无法牢固附着于载玻片，在免疫化学染色过程中易被冲洗掉。

3. 玻璃载片上背根神经节切片的尼氏染色

1. 用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤切片10分钟，然后用PBS再洗涤两次。
2. 将1:300的尼氏染液（见材料表）滴加到载玻片上，在室温下孵育20分钟。
3. 用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤切片，随后用PBS洗涤两次，每次5分钟，最后在室温下继续用PBS洗涤2小时。
4. 滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光封片剂（见材料表），盖上盖玻片以覆盖切片。

结果

本研究从一只小鼠的L4背根神经节（DRG）收集了约16张连续且高质量的DRG切片。所获得的切片无任何变形。 图1 展示了冰冻切片的逐步操作流程。组织切片中多余液体的去除过程如图所示。 图2组织的OCT包埋过程在下文重点说明 图3. 图4 显示背根神经节切片在玻片上的正确放置位置。 图5 显示小鼠DRG切片生理结构的共聚焦荧光显微镜图像。尼氏染色显示不同大小的DRG感觉神经元，DAPI染色显示围绕神经元的周围细胞。该图像展示了采用本方案所获得DRG切片的质量。可使用不同抗体对DRG进行免疫组织化学研究，包括鉴定DRG中不同类型的神经元。

讨论

本方案提供了一种简便的分步操作流程，用于对小鼠背根神经节（DRG）进行恒冷切片，以可靠地在载玻片上获得高质量的DRG切片。本方案包含四个关键步骤。第一，在将DRG样本放置于OCT包埋基质底座上之前，必须确保DRG样本和镊子完全干燥。任何围绕DRG样本的液体都会在其周围形成冰壳，导致DRG切片从OCT上分离并向上卷曲。第二，如果铝块上没有标记，或OCT底座覆盖了铝块上的标记，则必须在OCT底座底部（六点钟位置）做一标记，并在整个操作过程中始终保持该标记位于六点钟位置。保持恒定的方向有助于获得更多的DRG切片，否则DRG无法从顶部到底部被完整切下，部分DRG样本将被遗漏而浪费。第三，OCT底座和OCT覆盖层的上边缘必须与铝块的上边缘齐平。这样可避免铝块上边缘阻碍载玻片接取DRG切片。第四，应避免将DRG切片置于邻近DRG切片的OCT区域内，否则第二个DRG切片无法直接粘附在载玻片上，从而在后续步骤中容易被冲洗掉。

背根神经节（DRG）冰冻切片技术在研究疼痛和瘙痒机制中具有重要意义^1,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	麻醉动物
Epredia Cryotome冷冻切片机用冷冻切片盒，25 mm直径，交叉网格	Fisherbrand	1910	握住OCT切片的底部
Ergo 镊子	Fisherbrand	S95310	使用镊子末端轻轻触碰底部（6 点钟位置）’时钟）使切片贴附于平台表面，以防止切片向后卷曲
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	1255015	收集背根神经节切片
标记笔	Fisherbrand	133794	标记基底OCT的方向
Scigen Tissue-Plus O.C.T. 包埋剂	Fisherbrand	23730571	用于冷冻组织样本的包埋介质，以确保最佳切片温度（O.C.T.）