小鼠背根神经节冷冻切片操作流程

摘要

本文介绍了如何稳定获取高质量的背根神经节冰冻切片的方法。

摘要

高质量的小鼠背根神经节（DRG）冷冻切片对于炎症性疼痛、神经病理性疼痛、瘙痒以及其他周围神经系统疾病研究中的免疫组织化学染色和RNAscope分析至关重要。然而，由于DRG组织样本体积微小，要始终如一地获得高质量、完整且平整地贴附于载玻片上的冷冻切片仍是一项挑战。迄今为止，尚无文献详细描述DRG冷冻切片的最佳操作方案。本方案提供了一种逐步解决DRG冷冻切片过程中常见困难的方法。本文详细说明了如何去除DRG组织样本周围的液体，将DRG切片以一致的方向置于载玻片上，并使切片在载玻片上保持平整而不翘起。尽管该方案是为DRG样本的冷冻切片而开发，但也可适用于其他多种小样本量组织的冷冻切片操作。

引言

背根神经节（DRG）包含初级感觉神经元、组织巨噬细胞以及围绕初级感觉神经元的卫星细胞^1,2,3,4。它是处理无害性和有害性信号的关键解剖结构，在疼痛、瘙痒以及多种周围神经疾病中发挥重要作用^{5,6,7,8,9,10,11,12,13}。尽管已有多种方法用于从小鼠脊髓中分离DRG组织^14,15,16，但....

方案

本研究的动物实验已获得加州大学旧金山分校（UCSF）动物照护与使用委员会的批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》进行。实验中使用成年、8至12周龄的C57BL/6雄性和雌性小鼠（本单位繁育）。

1. 背根神经节样本制备

1. 用2.5%阿佛丁（Avertin）麻醉小鼠（见材料表）。通过检测对疼痛刺激无反应来确认麻醉充分。如前所述，经心脏灌注1×磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注4%甲醛^14,15,16。
2. 如前所述，从小鼠脊髓中解剖背根神经节（DRG）组织^14,15,16。
3. 将解剖得到的DRG在4%甲醛中室温后固定3小时。
4. 将DRG置于含30%蔗糖的PBS溶液中，4 °C过夜。
5. 制备最佳切割温度（OCT）包埋基底
   1. 将OCT包埋剂（见材料表）加入铝块表面，覆盖其顶部....

结果

本研究从一只小鼠的L4背根神经节（DRG）收集了约16张连续且高质量的DRG切片。所获得的切片无任何变形。 图1 展示了冰冻切片的逐步操作流程。组织切片中多余液体的去除过程如图所示。 图2组织的OCT包埋过程在下文重点说明 图3. 图4 显示背根神经节切片在玻片上的正确放置位置。 图5 显示小鼠DRG切片生理结构的共聚焦荧光显微镜图像。尼氏染色显示不同大小的DRG感觉神经元，DAPI染色显示围绕神经元的周围细胞。该图像展示了采用本方案所获得DRG切片的质量。可使用不同抗体对DRG进行免疫组织化学研究，包括鉴定DRG中不同类型的神经元。

讨论

本方案提供了一种简便的分步操作流程，用于对小鼠背根神经节（DRG）进行恒冷切片，以可靠地在载玻片上获得高质量的DRG切片。本方案包含四个关键步骤。第一，在将DRG样本放置于OCT包埋基质底座上之前，必须确保DRG样本和镊子完全干燥。任何围绕DRG样本的液体都会在其周围形成冰壳，导致DRG切片从OCT上分离并向上卷曲。第二，如果铝块上没有标记，或OCT底座覆盖了铝块上的标记，则必须在OCT底座底部（六点钟位置）做一标记，并在整个操作过程中始终保持该标记位于六点钟位置。保持恒定的方向有助于获得更多的DRG切片，否则DRG无法从顶部到底部被完整切下，部分DRG样本将被遗漏而浪费。第三，OCT底座和OCT覆盖层的上边缘必须与铝块的上边缘齐平。这样可避免铝块上边缘阻碍载玻片接取DRG切片。第四，应避免将DRG切片置于邻近DRG切片的OCT区域内，否则第二个DRG切片无法直接粘附在载玻片上，从而在后续步骤中容易被冲洗掉。

背根神经节（DRG）冰冻切片技术在研究疼痛和瘙痒机制中具有重要意义^1,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	麻醉动物
Epredia Cryotome冷冻切片机用冷冻切片盒，25 mm直径，交叉网格	Fisherbrand	1910	握住OCT切片的底部
Ergo 镊子	Fisherbrand	S95310	使用镊子末端轻轻触碰底部（6 点钟位置）’时钟）使切片贴附于平台表面，以防止切片向后卷曲
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	1255015	收集背根神经节切片
标记笔	Fisherbrand	133794	标记基底OCT的方向
Scigen Tissue-Plus O.C.T. 包埋剂	Fisherbrand	23730571	用于冷冻组织样本的包埋介质，以确保最佳切片温度（O.C.T.）