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方法文章

高通量成像法对线粒体DNA合成及分布的定量分析

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DOI：

10.3791/65236

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2023年5月5日

 ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Institute of Genetics and Biotechnology, University of Warsaw, 2Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 3International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

本文内容

摘要

本文描述了一种利用多孔板和自动免疫荧光成像技术，在细胞中研究线粒体DNA（mtDNA）代谢动态过程的方法，可用于检测和定量mtDNA的合成与分布。该方法可进一步用于研究各种抑制剂、细胞应激以及基因沉默对mtDNA代谢的影响。

摘要

绝大多数细胞过程需要持续的能量供应，其中最常见的能量载体是ATP分子。真核细胞通过氧化磷酸化在线粒体中产生大部分ATP。线粒体是一种独特的细胞器，因其拥有独立的基因组，该基因组可进行复制并传递至下一代细胞。与核基因组不同，细胞中含有多个线粒体基因组拷贝。深入研究负责线粒体基因组复制、修复和维持的机制，对于理解线粒体及整个细胞在正常和疾病状态下的正常功能至关重要。本文介绍一种方法，可用于高通量定量分析培养的人类细胞中线粒体DNA（mtDNA）的合成与分布 体外 介绍了一种基于免疫荧光检测的方法，该方法通过掺入5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记新合成的DNA分子，并同时利用抗DNA抗体检测所有线粒体DNA（mtDNA）分子。此外，线粒体可通过特异性染料或抗体进行可视化。采用多孔板形式培养细胞，并结合自动化荧光显微镜，可在相对较短时间内，在多种实验条件下便捷地研究mtDNA动态变化及线粒体形态。 关键词：免疫荧光检测，5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），线粒体DNA（mtDNA），抗DNA抗体，线粒体形态，多孔板培养，自动化荧光显微镜

引言

对于大多数真核细胞而言，线粒体是必需的细胞器，因为它们在多种细胞过程中发挥着关键作用。首先，线粒体是细胞的主要能量供应者1。线粒体还参与调控细胞稳态（例如细胞内氧化还原2和钙平衡3）、细胞信号传导4,5、细胞凋亡6、多种生化物质的合成7,8以及先天免疫应答9。线粒体功能障碍与多种病理状态和人类疾病相关10。

线粒体的功能依赖于两个独立基因组中的遗传信息：核基因组和线粒体基因组。与核基因组相比，线粒体基因组编码的基因数量较少，但所有由线粒体DNA（mtDNA）编码的基因对人类生命均至关重要。维持mtDNA所必需的线粒体蛋白机器由核DNA（nDNA）编码。线粒体复制体的基本组分以及部分线粒体生物发生因子已被鉴定（详见前期研究综述11,12）。然而，线粒体DNA复制与维持机制仍远未被阐明。与核DNA不同，线粒体基因组以多拷贝形式存在，这为调控线粒体基因表达提供了额外层次。目前对于mtDNA在细胞器内的分布与分离规律、这些过程在多大程度上受到调控，以及若存在调控，涉及哪些蛋白质，所知甚少13。当细胞含有野生型与突变型mtDNA的混合群体时，其分离模式尤为关键。它们的不均等分布可能导致产生含有大量有害突变mtDNA的细胞。

迄今为止，维持线粒体DNA（mtDNA）所必需的蛋白质因子主要通过生化方法、生物信息学分析或与疾病相关的研究来鉴定。在本研究中，为了最大限度地提高发现此前未被识别因子的可能性，采用了一种不同的策略。该方法基于在mtDNA复制或修复过程中使用胸腺嘧啶核苷类似物5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）对其进行标记。BrdU在DNA合成过程中可被迅速整合到新生DNA链中，通常用于监测细胞核DNA的复制14。然而，本文所建立的方法已针对检测整合到mtDNA中的BrdU进行了优化，采用抗BrdU抗体的免疫荧光技术进行检测。

该方法可实现对培养的人类细胞中线粒体DNA合成与分布的高通量定量分析 体外一种高通量策略对于在相对较短时间内于不同实验条件下开展测试至关重要；因此，本方案建议采用多孔板格式进行细胞培养，并结合自动化荧光显微镜进行成像。该方案包括利用siRNA文库转染人HeLa细胞，随后通过BrdU对新合成DNA的代谢标记来监测线粒体DNA（mtDNA）的复制或修复过程。该方法结合使用抗DNA抗体对DNA进行免疫染色，并通过定量荧光显微镜分析上述两个参数。此外，使用特异性染料对线粒体进行可视化标记。为验证本方案的特异性，分别在缺乏mtDNA的细胞（rho0细胞）、沉默已知mtDNA维持因子的HeLa细胞以及经mtDNA复制抑制剂处理的HeLa细胞中检测了BrdU染色效果。同时，采用独立方法——定量PCR（qPCR）——检测mtDNA水平。

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方案

1. siRNA 混合物的制备

  1. 实验开始前一天，将细胞（例如 HeLa 细胞）接种至 100 mm 培养皿中，使其在次日达到 70%–90% 的融合度。
    注意：所有操作均须在层流净化台内无菌条件下进行。
  2. 用 Opti-MEM 培养基将 siRNA 稀释至 140 nM 的浓度，并准备适当体积（参见 材料表）。可使用 96 孔板作为试剂储液板。
  3. 向黑色 384 孔细胞培养微孔板的每孔中加入 5 µL siRNA 溶液（对照样品加等体积 Opti-MEM 培养基）。
    注意：根据所测试 siRNA 样品的数量，可使用电子移液器或多通道移液器操作。
  4. 在 Opti-MEM 培养基中配制适量的 RNAiMAX 转染试剂溶液（参见 材料表），每 100 µL 培养基中加入 1 µL RNAiMAX。
  5. 向 384 孔板的每孔中加入 10 µL 转染试剂溶液。最方便快捷的方法是使用试剂分配器。
  6. 将 siRNA 与转染试剂在室温下孵育 30 分钟。

2. 转染用细胞的准备

  1. 孵育期间（步骤 1.6），使用吸液装置（参见材料表）吸去培养基，并用 3 mL PBS 洗涤细胞。
  2. 加入 1.5 mL 用 PBS 按 1:2 比例稀释的胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 10 分钟。
  3. 检查细胞是否已脱落；若已脱落，加入 3 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基。充分重悬细胞后转移至 15 mL 离心管中。取至少 150 µL 细胞悬液，使用细胞计数板进行细胞计数（参见材料表）。
  4. 在含 10% FBS、青霉素和链霉素的 DMEM 培养基中，将细胞重悬至适当浓度（HeLa 细胞系为 35,000/mL）。

3. 细胞转染

  1. 使用试剂分配器将 20 µL 细胞悬液加入 384 孔板的每个孔中。每孔将接种 700 个细胞。
  2. 将细胞在室温下孵育 1 小时，然后置于培养箱中孵育 72 小时（37 °C 和 5% CO2）。

4. BrdU 掺入

  1. 用含10% FBS的DMEM培养基配制90 µM的BrdU（参见材料表）溶液。
  2. 在siRNA转染后56小时（细胞固定前16小时），向384孔板的每孔中加入10 µL 90 µM BrdU溶液（最终BrdU浓度为20 µM）。
    注意：操作应尽可能迅速，因此最好使用试剂分配器、电子移液器或多通道分配移液器。请记得设置不加BrdU的对照孔。
  3. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育16小时。

5. 线粒体标记

  1. 在含有10% FBS的DMEM中配制20 µM的BrdU溶液，并加入线粒体示踪染料溶液（见材料表），使染料终浓度为1.1 µM。
  2. 在BrdU掺入开始后15小时（细胞固定前1小时），向384孔板的每孔中加入10 µL线粒体示踪染料溶液（见材料表），终浓度为200 nM。
    注意：使用试剂分配器、电子移液器或多通道分配移液器。请保留未添加BrdU但添加了线粒体示踪染料的对照孔。
  3. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。

6. 细胞固定

注意：所有洗涤步骤使用微孔板洗涤器操作最为方便，而试剂的添加则使用试剂分配器进行最为快速。

  1. 使用酶标板清洗仪（参见材料表），每孔加入100 µL PBS，清洗两次。第二次清洗后，每孔保留25 µL PBS。
    注意：在孔中保留PBS可降低下一步加液时细胞脱落的可能性。所有清洗步骤均需保留PBS；因此，下一步加入的溶液应始终配制为2倍浓度，因其将与残留的PBS以等体积混合。
  2. 向每孔加入25 µL含0.4% Triton X-100和Hoechst 33342（浓度为4 µg/mL）的8%多聚甲醛PBS溶液（各试剂的终浓度分别为4%、0.2%和2 µg/mL）以固定细胞（参见材料表）。
  3. 将酶标板置于室温避光孵育30分钟。

7. 封闭

  1. 用 100 µL PBS 每孔洗涤四次。最后一次洗涤后，每孔中保留 25 µL PBS。
  2. 每孔加入 25 µL 含 6% BSA 的 PBS 溶液（最终 BSA 浓度为 3%）。
  3. 将酶标板置于室温避光孵育 30 分钟。

8. 一抗的添加

  1. 使用微孔板洗板机吸去BSA，每孔保留10 µL溶液。
  2. 加入10 µL用含3% BSA的PBS配制的一抗溶液。使用终浓度为0.8 µg/mL的抗BrdU抗体和0.4 µg/mL的抗DNA抗体（抗体的最终浓度分别为0.4 µg/mL和0.2 µg/mL）（参见材料表）。
  3. 将酶标板置于4 °C避光条件下过夜孵育。

9. 加入二抗

  1. 用 100 µL PBS 将每孔洗涤四次。最后一次洗涤后，每孔中保留 10 µL PBS。
  2. 加入 10 µL 用含 6% BSA 的 PBS 配制的 4 µg/mL 二抗溶液（终浓度为 2 µg/mL）。使用与荧光染料（如 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 555）偶联的同种型特异性抗体（抗小鼠 IgG1 和抗小鼠 IgM）（参见 材料表）。
  3. 将酶标板置于室温避光孵育 1 小时。
  4. 用 100 µL PBS 将每孔洗涤四次。最后一次洗涤后，每孔中保留 50 µL PBS。
  5. 用粘性封板膜密封酶标板（参见 材料表），并于 4 °C 避光保存。成像必须在 2 周内完成。

10. 成像

注意：成像必须使用自动化的宽场显微镜进行；显微镜必须配备带有控制系统的电机化载物台，以自动对培养板的各个区域进行成像。

  1. 检查培养板角落区域（孔 A1、A24、P24、P1）以及中心区域的自动对焦设置。
    注意：成像时建议使用工作距离较短的 20 倍物镜（参见材料表），并尽可能选择数值孔径较高的物镜。
  2. 根据成像软件在实时预览模式下生成的强度直方图，为各个荧光通道选择足够长的曝光时间，以确保所得图像不出现过饱和现象。
  3. 设置 z 轴成像的适当层数。
    注意：在 20 倍放大倍数下，视场范围较大，因此并非所有细胞都处于同一焦平面，必须进行 z 轴层扫才能在各自正确的焦平面上观察所有细胞。通常情况下，五层即可满足需求。根据可用磁盘空间情况，可保存完整的 z 层堆栈图像，或仅保存最大强度投影图像。代表性结果部分所示的图像分析基于最大强度投影图像。
  4. 选择每个孔中需成像的视场数量。
    注意：根据细胞汇合度的不同，单个视场中可成像约 60–300 个细胞。通常情况下，对于汇合度为 60%–90% 的 HeLa 细胞，成像五个视场可分析 500 至 1,000 个以上的细胞。
  5. 选择需要成像的孔位，并开始成像。

11. 定量图像分析

注意：获取的图像的定量分析可以使用开源软件（如 Cell Profiler15）进行。本研究中，分析使用 ScanR 3.0.0 软件完成（见材料表）。

  1. 通过校正所有荧光通道图像的背景开始分析。根据被分析对象的大小，选择合适的滤波尺寸：细胞核为80像素，BrdU和线粒体DNA（mtDNA）斑点为4像素。
  2. 通过基于细胞核对应荧光通道的信号强度与背景强度之比，创建主对象的掩膜，开始图像分割。
  3. 分别使用适用于BrdU和mtDNA结构的荧光通道，创建代表BrdU和mtDNA斑点的子对象掩膜。
    注意：每个子对象将被分配给距离最近的主对象（细胞核）。
  4. 设置分析过程中需测量的参数，并测量每个掩膜内所有荧光通道中各个像素的强度。
    注意：还需计算分配给特定细胞核的子对象数量以及每个子对象的面积。
  5. 根据获得的数据定义需计算的衍生参数。为获得BrdU或mtDNA通道的总荧光强度，需将分配给特定细胞核的所有子对象的强度相加；为获得平均荧光强度，将总荧光强度除以分配给该细胞核的子对象面积之和。
    注意：为确保所创建的子对象（BrdU或mtDNA斑点）确实位于线粒体内，必须根据线粒体示踪染料的荧光强度对其进行设门筛选。
  6. 使用R 4.2.2统计软件16及以下软件包对ScanR软件获得的数据进行进一步分析：dplyr17、data.table18、ggplot219、 和ggpubr20。此步骤为可选。

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结果

高通量研究线粒体DNA（mtDNA）合成与分布动态的实验流程示意图见图1。采用多孔板格式可同时分析多种不同的实验条件，例如利用siRNA文库对不同基因进行沉默。使用BrdU标记新合成的DNA分子的条件可用于检测HeLa细胞线粒体中的BrdU标记DNA（图2A），也可作为其他细胞类型检测方法建立的起始条件。BrdU孵育时间应根据时间进程实验针对不同细胞系进行优化（补充图1）。本研究选用HeLa细胞，因为siRNA筛选需要转染效率高的细胞。重要的是，抗BrdU抗体所获得的信号具有特异性，仅在经BrdU处理的细胞中可观察到（图2）。进一步利用缺乏线粒体DNA的rho0细胞验证了抗BrdU抗体和抗DNA标记的特异性21（补充图2）。如预期，在这些细胞中，无论是否进行BrdU处理，抗BrdU抗体和抗DNA抗体在线粒体中均未检测到信号（

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讨论

传统上，通过BrdU掺入及抗体检测对DNA进行标记，已被用于核DNA复制和细胞周期研究14,27,28到目前为止，所有用于检测 BrdU 标记 DNA 的实验方案均包含 DNA 变性步骤（酸性或热变性）或酶消化步骤（DNase 或蛋白酶处理），以暴露表位并促进抗体渗透。这些方案最初是针对高度致密的核 DNA 设计的。然而，由于线粒体 DNA（mtDNA）具有不同的结构组织，研究人员开发出一种无需变性步骤的检测方法，从而简化了操作流程，并使其更适用于高通量应用。该方法取得了优异的效果，因为省略变性步骤后，BrdU 标记的 DNA 仅在细胞核外被检测到图2 和 图3因此，当包含变性步骤时，总是会出现较强的核DNA信号，这可能会严重干扰BrdU标记的线粒体DNA信号的检测...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由波兰国家科学中心资助（资助/奖项编号：2018/31/D/NZ2/03901）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2′,3′-双脱氧胞苷 (ddC)Sigma-AldrichD5782
384 孔黑色细胞培养微孔板Greiner Bio-One#781946
5-溴-2′-脱氧尿苷 (BrdU)Sigma-AldrichB5002-1G将 BrdU 粉末溶于水中，配制成 20 mM 储存液，并分装。标记时使用 20 µM BrdU 溶液。
粘性封板膜Nerbe Plus04-095-0060
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 二抗Thermo Fisher ScientificA-21121
Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgM 二抗Thermo Fisher ScientificA-21426
BioTek 405 LS 微孔板洗板机Agilent
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma-AldrichA4503
Thoma 细胞计数板Heinz HerenzREF:1080339
杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)CytivaSH30243.01
杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965-062
胎牛血清 (FBS)Thermo Fisher Scientific10270-106
甲醛溶液Sigma-AldrichF1635甲醛具有毒性，请仔细阅读安全数据表。
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IgG1 小鼠单克隆抗 BrdU (IIB5) 一抗Santa Cruz Biotechnologysc-32323
IgM 小鼠单克隆抗 DNA (AC-30-10) 一抗Progen#61014
LightCycler 480 系统Roche
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂Thermo Fisher Scientific#13778150
MitoTracker Deep Red FMThermo Fisher ScientificM22426线粒体示踪染料 
Multidrop Combi 试剂分配器Thermo Fisher Scientific
Opti-MEMThermo Fisher Scientific51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD 相机Hamamatsu
青霉素-链霉素 Sigma-AldrichP0781-100ML
磷酸盐缓冲液 (PBS)Sigma-AldrichP4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
qPCR 引物 Fw B2M (内参基因)CAGGTACTCCAAAGATTCAGG 
qPCR 引物 Fw GPI (内参基因)GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR 引物 Fw MT-ND1 TAGCAGAGACCAACCGAACC 
qPCR 引物 Fw POLGTGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR 引物 Fw TFAMGATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR 引物 Fw TWNKGCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR 引物 Rev B2M (内参基因)GTCAACTTCAATGTCGGATGG 
qPCR 引物 Rev GPI (内参基因)AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR 引物 Rev MT-ND1 ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
qPCR 引物 Rev POLGGGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR 引物 Rev TFAMGGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR 引物 Rev TWNKAACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR 显微镜Olympus
siRNA CtrlDharmaconD-001810-10-5
siRNA POLGInvitrogenPOLGHSS108223
siRNA TFAMInvitrogenTFAMHSS144252
siRNA TWNKInvitrogenC10orf2HSS125597
吸液装置NeoLab2-9335用于细胞培养的吸液装置
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500ML
胰蛋白酶BiowestL0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA 物镜Olympus

参考文献

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