基于图像的高通量线粒体DNA合成和分布定量

Summary

描述了使用多孔板格式和自动免疫荧光成像来检测和量化mtDNA合成和分布的细胞中线粒体DNA（mtDNA）代谢动力学的程序。这可以进一步用于研究各种抑制剂，细胞应激和基因沉默对mtDNA代谢的影响。

Abstract

绝大多数细胞过程需要持续的能量供应，其中最常见的载体是ATP分子。真核细胞通过氧化磷酸化在线粒体中产生大部分ATP。线粒体是独特的细胞器，因为它们有自己的基因组，可以复制并传递给下一代细胞。与核基因组相反，细胞中线粒体基因组有多个拷贝。详细研究负责线粒体基因组复制、修复和维持的机制对于了解线粒体和整个细胞在正常和疾病条件下的正常功能至关重要。本文提出了一种允许高通量定量体外 培养的人细胞 中线粒体DNA（mtDNA）的合成和分布的方法。该方法基于对通过5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）掺入标记的活性合成DNA分子进行免疫荧光检测，以及同时检测具有抗DNA抗体的所有mtDNA分子。此外，线粒体用特定的染料或抗体可视化。以多孔形式培养细胞和利用自动荧光显微镜使得在相对较短的时间内在各种实验条件下研究mtDNA的动力学和线粒体的形态变得更加容易。

Introduction

对于大多数真核细胞来说，线粒体是必不可少的细胞器，因为它们在许多细胞过程中起着至关重要的作用。首先，线粒体^是细胞1的主要能量供应商。线粒体还参与调节细胞稳态（例如，细胞内氧化还原²和钙平衡³），细胞信号传导⁴，5^，细胞凋亡⁶，不同生^{化化合物的}合成7^，8和先天免疫反应⁹。线粒体功能障碍与各种病理状态和人类疾病有关¹⁰.

线粒体的功能取决于位于两个独立基因组中的遗传信息:核基因组和线粒体基因组。与核基因组相比，线粒体基因组编码的基因数量很少，但所有mtDNA编码的基因对人类生命都是必不可少的。维持mtDNA所必需的线粒体蛋白机制由nDNA编码。线粒体爬替体的基本成分以及一些线粒体生物发生因子已经被确定（在以前的研究中回顾了^11，12）。然而，线粒体DNA的复制和维持机制仍远未被理解。与nDNA相反，线粒体基因组以多个拷贝存在，这为调节线粒体基因表达提供了额外的层。目前对细胞器内mtDNA的分布和分离知之甚少，这些过程在多大程度上受到调节，如果是，涉及哪些蛋白质¹³。当细胞包含野生型和突变mtDNA的混合群体时，分离模式至关重要。它们的不均匀分布可能导致产生具有有害数量突变mtDNA的细胞。

到目前为止，mtDNA维持所必需的蛋白质因子主要通过生化方法，生物信息学分析或通过疾病相关研究来确定。在这项工作中，为了确保识别以前逃脱识别的因素的高机会，描述了一种不同的策略。该方法基于在复制或修复过程中用5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记mtDNA，BrdU是胸苷的核苷类似物。BrdU在DNA合成过程中很容易掺入新生的DNA链中，并且通常用于监测核DNA¹⁴的复制。然而，这里开发的程序已经过优化，可以使用抗BrdU抗体的免疫荧光检测掺入mtDNA中的BrdU。

该方法允许对 体外培养的人类细胞中的mtDNA合成和分布进行高通量定量。需要高通量策略才能在相对较短的时间内在不同的实验条件下进行测试;因此，在协议中建议利用多孔格式进行细胞培养和自动荧光显微镜进行成像。该方案包括用siRNA文库转染人HeLa细胞，以及随后使用BrdU对新合成的DNA进行代谢标记来监测mtDNA的复制或修复。这种方法与抗DNA抗体的帮助下对DNA进行免疫染色相结合。这两个参数都使用定量荧光显微镜进行分析。此外，线粒体用特定的染料可视化。为了证明该方案的特异性，在缺乏mtDNA的细胞（rho0细胞）上测试了BrdU染色，在沉默了众所周知的mtDNA维持因子的HeLa细胞上，以及在用mtDNA复制抑制剂处理后的HeLa细胞上测试了BrdU染色。mtDNA水平也通过一种独立的方法测量，即qPCR。

Protocol

1. siRNA混合物的制备

1. 在实验开始前一天，将细胞（例如HeLa）接种在100毫米的培养皿上，以便第二天达到70%-90%的汇合。
   注意:所有操作必须在无菌条件下在层流室中进行。
2. 在Opti-MEM培养基中制备稀释至140nM浓度的适量的siRNA（参见 材料表）。96孔板可用作储液器。
3. 向黑色 384 孔细胞培养微孔板的每个孔中加入 5 μL siRNA 溶液（或用于对照样品的 Opti-MEM 培养基）。
   注意:根据测试的siRNA样品数量，可以使用电动或多通道移液器。
4. 在Opti-MEM培养基中制备适量的RNAiMAX转染试剂溶液（参见 材料表）。每 100 μL 培养基添加 1 μL RNAiMAX。
5. 向 384 孔板的每个孔中加入 10 μL 转染试剂溶液。最方便、最快捷的方法是使用试剂分配器。
6. 将siRNA与转染试剂在室温下孵育30分钟。

2. 转染用细胞的制备

1. 在孵育期间（步骤1.6），使用抽吸装置吸出培养基（参见 材料表），并用3mL PBS洗涤细胞。
2. 加入在PBS中以1:2稀释的1.5mL胰蛋白酶，并将细胞在37°C孵育10分钟。
3. 检查细胞是否已分离;如果是这样，请加入 3 mL 含有 10% FBS 的 DMEM 培养基。彻底悬浮细胞，并将其转移到 15 mL 管中。取至少 150 μL 悬浮液，并在细胞计数室中计数细胞（参见 材料表）。
4. 在含有 10% FBS、青霉素和链霉素的 DMEM 培养基中制备适当浓度（HeLa 系为 35，000/mL）的细胞悬液。

3. 细胞转染

1. 使用试剂分配器向 384 孔板的每个孔中加入 20 μL 细胞悬液。这将导致每孔接种700个细胞。
2. 将细胞在室温下孵育1小时，然后将它们置于培养箱中72小时（37°C和5%CO₂）。

4. 成立 BrdU

1. 在含有10%FBS的DMEM培养基中制备90μM的BrdU溶液（参见 材料表）。
2. 在siRNA转染后56小时（细胞固定前16小时），向384孔板的每个孔中加入10μL的90μM BrdU溶液（最终BrdU浓度为20μM）。
   注意:应尽快执行该操作;因此，最好使用试剂分配器、电动移液器或多分配器移液器。请记住准备不添加BrdU的控制孔。
3. 孵育细胞16小时（37°C和5%CO₂）。

5. 线粒体的标记

1. 用10%FBS在DMEM中制备20μM的BrdU溶液，并向其中加入线粒体示踪染料溶液（参见 材料表）至浓度为1.1μM。
2. 在BrdU掺入开始后15小时（细胞固定前1小时），向384孔板的每个孔中加入10μL线粒体跟踪染料溶液（参见 材料表）（最终染料浓度为200nM）。
   注意:使用试剂分配器、电动移液器或多分配器移液器。请记住保留对照孔，不添加BrdU，但添加线粒体跟踪染料。
3. 孵育细胞1小时（37°C和5%CO₂）。

6. 细胞固定

注意:所有洗涤都使用微孔板清洗机最方便地进行，而使用试剂分配器最快速地添加试剂。

1. 使用微孔板清洗机（参见 材料表），用 100 μL PBS 冲洗每个孔两次。第二次洗涤后，将 25 μL PBS 留在孔中。
   注意:将PBS留在孔中可降低下一步添加液体期间细胞脱离的可能性。所有的洗涤都是在PBS留下的情况下完成的;因此，下一步中添加的溶液应始终以2x浓度制备，因为它将以等体积添加到剩余的PBS中。
2. 通过在PBS中加入25μL的8%甲醛溶液，0.4%Triton X-100和Hoechst 33342，浓度为4μg/ mL（单个试剂的最终浓度分别为4%，0.2%和2μg/ mL）（参见 材料表）。
3. 将板在室温下在黑暗中孵育30分钟。

7. 阻止

1. 用 100 μL PBS 冲洗每个孔四次。最后一次洗涤后，将 25 μL PBS 留在孔中。
2. 向每个孔中加入 25 μL 6% BSA 的 PBS（最终 BSA 浓度为 3%）。
3. 将板在室温下在黑暗中孵育30分钟。

8. 添加一抗

1. 使用微孔板清洗机吸出BSA，并将10μL溶液留在孔中。
2. 在PBS中加入10 μL在3%BSA中制备的一抗溶液。使用0.8μg/mL的抗BrdU和0.4μg/mL的抗DNA（抗体的最终浓度分别为0.4μg/mL和0.2μg/mL）（参见 材料表）。
3. 将板在4°C的黑暗中孵育过夜。

9. 二抗的添加

1. 用 100 μL PBS 冲洗每个孔四次。最后一次洗涤后，将 10 μL PBS 留在孔中。
2. 在PBS中加入10 μL在6%BSA中制备的4 μg/mL二抗溶液（终浓度为2 μg/mL）。使用与荧光染料（如Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555）偶联的同种型特异性抗体（抗小鼠IgG1和抗小鼠IgM）（参见 材料表）。
3. 将板在室温下在黑暗中孵育1小时。
4. 用 100 μL PBS 冲洗每个孔四次。最后一次洗涤后，将 50 μL PBS 留在孔中。
5. 用粘性密封膜密封板（见 材料表），并将其储存在4°C的黑暗中。 影像学检查必须在 2 周内进行。

10. 成像

注意:必须使用自动宽视场显微镜进行成像;显微镜必须配备一个电机载物台，该载物台配有控制器，以自动对板的各个区域进行成像。

1. 检查板角区域（孔 A1、A24、P24、P1）和中心的自动对焦设置。
   注意:对于成像，建议使用具有最高数值孔径的20倍短工作距离物镜（见 材料表）。
2. 根据成像软件在实时取景模式下生成的强度直方图，为各个荧光通道选择足够长的曝光时间，以便生成的图像不会过饱和。
3. 在 z 轴上设置适当的平面数以进行成像。
   注意:20倍放大倍率下的视场足够大，并非所有细胞都在同一焦点平面上，因此必须执行z切片才能在正确的焦点平面上查看所有细胞。通常，五架飞机就足够了。根据磁盘空间的可用性，可以保存单个 z 堆栈或仅保存最大强度投影。代表性结果部分中显示的图像分析基于最大强度预测。
4. 选择每个孔要显示的适当数量的视野。
   注意:根据汇合度，可以在一个视野中对大约 60-300 个细胞进行成像。通常，对于汇合度为60%-90%的HeLa细胞，对五个视场进行成像将允许分析从500个细胞到超过1，000个细胞。
5. 选择要成像的孔，然后开始成像。

11. 定量图像分析

注意:采集图像的定量分析可以使用开源软件（如Cell Profiler¹⁵）进行。在本研究中，使用ScanR 3.0.0软件进行分析（见 材料表）。

1. 通过对所有荧光通道的所有图像进行背景校正来开始分析。根据分析对象的大小，选择合适的过滤器尺寸:细胞核为80像素，BrdU和mtDNA斑点为4像素。
2. 通过根据荧光信号强度与对应于细胞核的通道的背景之比创建主要对象的掩模来开始分割图像。
3. 使用适合给定结构的荧光通道，分别为代表BrdU和mtDNA斑点的子对象创建掩模。
   注意:每个子对象都分配给最近的主对象（细胞核）。
4. 设置分析过程中要测量的参数，并测量所有荧光通道的每个掩模内单个像素的强度。
   注意:还需要计算分配给给定细胞核的子对象的数量以及每个子对象的面积。
5. 定义要根据获得的数据计算的派生参数。为了获得BrdU或mtDNA通道的总荧光强度，请汇总分配给给定细胞核的所有子对象的强度。要获得平均荧光强度，请将总荧光强度除以分配给给定细胞核的子对象的面积之和。
   注意:为了确保创建的子对象（BrdU或mtDNA斑点）实际上位于线粒体中，有必要根据线粒体跟踪染料的荧光强度来门控它们。
6. 使用 R 4.2.2 统计软件¹⁶ 以及以下软件包对使用 ScanR 软件获得的数据进行进一步分析:dplyr 17、data.table 18、ggplot2¹⁹ 和 ggpubr²⁰。此步骤是可选的。

Results

图1显示了mtDNA合成和分布动力学的高通量研究程序方案。使用多孔板形式可以同时分析许多不同的实验条件，例如使用siRNA文库沉默不同的基因。用于用BrdU标记新合成的DNA分子的条件允许检测HeLa细胞线粒体中的BrdU标记DNA（图2A），但也可以用作建立其他细胞类型测定的起始条件。应根据时程实验为单个细胞系选择BrdU孵育时间（补充图1）。在本研究中，使用了HeLa细胞，因为siRNA的筛选需要可以高效转染的细胞。重要的是，用抗BrdU抗体获得的信号是特异性的，因为它只能在用BrdU处理的细胞中观察到（图2）。使用缺乏线粒体DNA²¹的rho0细胞进一步证实了抗BrdU和抗DNA标记的特异性（补充图2）。正如预期的那样，在这些细胞中，无论BrdU处理如何，在线粒体中都没有检测到抗BrdU或抗DNA抗体的信号（

Discussion

从历史上看，通过BrdU掺入和抗体检测进行DNA标记已被用于核DNA复制和细胞周期研究¹⁴，^27，28。到目前为止，所有用于检测BrdU标记DNA的方案都包括DNA变性步骤（酸性或热性）或酶消化（DNase或蛋白酶），以实现表位暴露并促进抗体渗透。这些协议是为紧密包装的核DNA开发的。然而，mtDNA的不同组织使得开发没有变性步骤的程序成为可能;这简化了程序，使其更适合高通量应用。这种方法带来了出色的结果，因为省略变性步骤会导致仅在细胞核外检测BrdU标记的DNA（图2和图3）。因此，该协议可以避免来自核DNA的强信号，当包括变性步骤时始终存在，并且可能通过掩盖来自BrdU标记的mtDNA²⁹的信号而导致严重问题。此外，没有剧烈的变性确保了细胞结构的更好...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′，3′-二脱氧胞苷 （ddC）	Sigma-Aldrich	D5782
384 孔细胞培养微孔板，黑色	Greiner Bio-One	#781946
5-溴-2′-脱氧尿嘧啶 （BrdU）	Sigma-Aldrich	B5002-1G	BrdU 粉末溶于水中，溶于 20 mM 储备液并分装。使用 20 µM BrdU 溶液进行标记。
胶粘剂密封膜	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 二抗	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgM 二抗	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS 洗板机	安捷伦
血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A4503
细胞计数室 Thoma	Heinz Herenz	参考文献：1080339
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Thermo Fisher Scientific	41965-062
胎牛血清 （FBS）	Thermo Fisher Scientific	10270-106
甲醛溶液	Sigma-Aldrich	F1635	甲醛有毒;请仔细阅读安全数据表。
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 小鼠单克隆抗 BrdU （IIB5） 一抗	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM 小鼠单克隆抗 DNA （AC-30-10） 一抗	Progen	#61014
LightCycler 480 系统	Roche
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂	ThermoFisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	线粒体追踪染料
Multidrop Combi 试剂分配器	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 （C10600） CCD 相机	滨松
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green 预混液	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR 引物 Fw B2M（参考）			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR 引物 Fw GPI （参考基因）			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR 引物 Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR 引物 Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR 引物 Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR 引物 Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR 引物 Rev B2M （参考）			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR 引物 Rev GPI （参考基因）			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR 引物 Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR 引物 Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR 引物 Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR 引物 Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR 显微镜	奥林巴斯
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
吸引装置	NeoLab	2-9335	细胞培养用吸引装置
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
胰蛋白酶	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA目标	奥林巴斯