自由移动小鼠中的多通道胞外记录

摘要

该方案描述了在运动皮层（MC）进行细胞外记录的方法，以揭示自由活动的清醒小鼠的细胞外电生理特性，以及局部场电位（LFPs）和锋电位的数据分析方法，这对于评估与特定行为相关的神经网络活动具有重要意义。

摘要

本方案旨在通过将电生理信号与自发性行为和/或特定行为相关联，揭示执行特定任务的行为小鼠中神经元放电特性及神经网络局部场电位（LFPs）的特征。该技术是研究这些行为背后神经网络活动的有力工具。本文提供了在自由活动的清醒小鼠中进行电极植入及随后细胞外记录的详细而完整的操作流程。研究内容包括微电极阵列植入的详细方法、利用多通道系统记录运动皮层（MC）中的局部场电位和神经元锋电位信号，以及后续的离线数据分析。在清醒动物中进行多通道记录的优势在于，可以获得并比较更大量的放电神经元及神经元亚型，从而评估特定行为与相关电生理信号之间的关系。值得注意的是，本研究中所述的多通道细胞外记录技术及数据分析方法在对行为小鼠进行实验时，亦可应用于其他脑区。

引言

局部场电位（LFP）是细胞外信号的重要组成部分，反映了大量神经元的突触活动，这些活动构成了多种行为的神经编码¹。神经元活动产生的峰电位被认为对LFP有贡献，并在神经编码中起重要作用²。已有研究证实，峰电位和LFP的改变介导了多种脑部疾病（如阿尔茨海默病）以及恐惧等情绪过程^3,4。值得注意的是，许多研究强调，动物在清醒状态与麻醉状态下，其峰电位活动存在显著差异⁵。尽管在麻醉动物中进行记录有助于在高度明确的皮层同步状态下评估LFP，并减少伪迹干扰，但其结果在一定程度上与清醒状态下的情况有所不同^6,7,8。因此，通过植入脑内的电极，在清醒状态下对各种疾病中的神经活动进行长时间、大空间尺度的检测更具意义。本文旨在为初学者提供制作微型驱动系统的方法，并介绍如何使用常用软件快速、简便地设置参数，以实现峰电位和LFP信号的记录与分析，帮助研究者迅速启动实验和数据分析工作。

尽管非侵入性脑功能记录技术（例如通过头皮记录脑电图（EEG）和事件相关电位（....

方案

所有小鼠均购自商业渠道，在室温22-25 °C、相对湿度50%-60%的环境下维持12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为当地时间上午08:00）。小鼠可自由获取食物和水。所有实验均按照华南师范大学《实验动物护理与使用指南》进行，并经机构动物伦理委员会批准。实验使用3-5月龄的雄性C57BL/6J小鼠。

1. 微驱动系统组装

1. 使用两个撑条和一个用于固定可移动微驱动装置的螺钉，将两个计算机设计的板连接起来，并将连接器安装到其中一块板上图1A，Bi-III）。通过旋转螺丝（0.5 毫米/圈）驱动微型驱动装置。
2. 确保微型驱动装置每侧可容纳两组八根导管（长约3 cm，内径约50 µm，外径约125 µm），用于MC区域两侧，然后将其切割至相同长度（至少15 mm）； 图1Biv，v).
3. 剪切16根直径为35 µm、长约5 cm的镍铬合金丝，依次装入导引管中，随后涂胶固定图1Bi，vi，vii).
4. 剥离导线绝缘层，根据通道图将每根裸露的导线依次缠绕至连接器的各个引脚，以及参考电极和接地电....

结果

应用高通滤波器（250 Hz）以从原始信号中提取多单位放电尖峰信号图6A）。此外，通过主成分分析（PCA）对正常小鼠运动皮层（MC）记录的神经元单位进行了验证（图7A-D），并记录了小鼠运动皮层（MC）中神经元单位的谷宽和波形持续时间。结果表明，小鼠MC中假定的锥体神经元（Pyn）的谷宽和波形持续时间均高于假定的中间神经元（IN）的相应值（图7E,F；双样本 Mann-Whitney 检验；对于谷宽，假定的 Pyn：0.636 ms ± 0.004 ms，假定的 IN：0.614 ms ± 0.001 ms， p = 0.002；对于波形持续时间，假定的Pyn：0.095 ms ± 0.004 ms，假定的IN：0.054 ms ± 0.002 ms， p = 1.402 × 10⁻¹⁶），对应于先前研.......

讨论

在神经科学研究中，自由活动小鼠的多通道记录技术被认为是一种有用的方法，但对于初学者而言，信号的记录与分析仍然具有较大挑战性。本研究提供了微驱动系统的制作与电极植入的简化操作指南，以及电信号采集与分析的简化流程。 通过 神经生理数据分析软件和 spike 排序软件

鉴于定制的微型驱动系统质量对在自由活动小鼠中获取稳定且高质量的信号具有重要影响^14,15,16,17，本研究设计并采用了一种更坚固且轻量化的微型驱动系统结构，初学者可轻松且清晰地遵循其制造步骤完成系统的构建。此外，该微型驱动系统的结构采用价格低廉且在五金商店易于获取的材料制成，不同于以往研究中使用的体积更大、更重的微型驱动系统^14,15.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.54 mm 针式排针	YOUXIN 电子有限公司	1 × 5	申请可沿其支架滑动的可移动微型驱动装置。
Adobe Illustrator CC 2017	Adobe	N/A	优化 GraphPad 图像。
BlackRock Microsystems	Blackrock Neurotech	Cerebus	该系统包括前置放大器、数模转换器、放大器和计算机。
黄铜螺母	东莞高斯科技有限公司	M0.8 黄铜螺母	螺母固定螺钉的位置。
黄铜螺丝	东莞高斯科技有限公司	M0.8 × 11 mm 黄铜螺丝	固定可移动微驱动器的螺钉。
C57BL/6J	广东智源生物医药科技有限公司	N/A	12 周龄
离心管	Biosharp	15 mL；BS-150-M	用蔗糖溶液保存小鼠脑组织。
导电涂料	Structure Probe, Inc.	7440-22-4	提高连接器引脚与镍丝之间铅连接的质量。
导电铜箔胶带	3M	1181	为减少干扰。
连接器	YOUXIN 电子有限公司	2 x 10P	将头帽连接至微型驱动系统。
直流电源	Maisheng	MS-305D	一种用于  电解损伤
牙科粘固剂	上海新世纪齿科材料有限公司	N/A	在完成植入后，将电极阵列固定在小鼠颅骨上。
数模转换器	Blackrock	128通道	一种将数字数据转换为模拟信号的设备。
环氧树脂	Alteco	N/A	用于覆盖针脚。
Excel	微软	N/A	分析后总结数据。
眼科剪	江西玉源医疗设备有限公司	N/A	用于手术或切割镍铬丝
精细镊子	江西玉源医疗设备有限公司	N/A	用于手术。
镊子	江西玉源医疗设备有限公司	N/A	用于手术或组装微型驱动系统。
冷冻切片机	Leica	CM3050 S	切开小鼠’将大脑切成薄片
熔融石英毛细管管材	郑州英诺赛普科技有限公司	TSP050125	至  作为镍铬丝的导向管。
玻璃微电极	Sutter Instrument Company	BF100-50-10	使用填充的墨水标记植入的预定位置。
GraphPad Prism 7	GraphPad Software	N/A	分析并可视化结果。
导管	Polymicro Technologies	1068150020	加载镍铬丝。
前置放大器	Blackrock	N/A	信号传递工具
氦气球	Yili Festive products Co., Ltd.	24 英寸	用于平衡头件和微型驱动系统的重量。
墨水	Sailor Pen Co.,LTD.	13-2001	标记所需的植入位置。
碘酊	广东恒健制药有限公司	N/A	对小鼠头皮进行消毒。
盐酸林可霉素与利多卡因  盐酸凝胶	湖北康正药业有限公司	10g	一种用于减轻炎症的药物。
美洛昔康	Vicki Biotechnology Co., Ltd.	71125-38-7	减轻小鼠术后疼痛。
显微操作仪	Scientifica	Scientifica IVM Triple	用于电极阵列植入。
显微镜	尼康	ECLIPSE Ni-E	拍摄脑切片图像
nanoZ 阻抗测试仪	Plexon	nanoZ	用于多通道微电极阵列的阻抗测量或电极阻抗谱（EIS）分析。
NeuroExplorer	Plexon	NeuroExplorer	一种用于分析电生理数据的工具。
NeuroExplorer	Plexon，美国	N/A	一种软件。
镍铬丝	California Fine Wire Co.	M472490	35 μm 镍铬丝。
离线分选器	Plexon	离线分选器	一种用于对记录的多通道单位进行分类的工具。
PCB板	杭州杰佩信息技术有限公司	N/A	计算机设计的电路板
戊巴比妥	Sigma	P3761	麻醉小鼠。
戊巴比妥钠	Sigma	57-33-0	对小鼠进行麻醉。
蠕动泵	更长	BT100-1F	用于灌注的装置
多聚甲醛	Sangon Biotech	A500684-0500	固定小鼠脑组织所用固定液的主要成分
PtCl4	天津金博兰精细化工有限公司	13454-96-1	镀金液的配制
生理盐水	广东恒健制药有限公司	N/A	清洁小鼠颅骨。
银丝	苏州新业电子有限公司	2 mm 直径	安放接地电极和参考电极。
颅骨钻孔	RWD生命科学	78001	在小鼠颅骨上小心钻两个小孔。
不锈钢螺钉	YOUXIN电子有限公司	M0.8 × 2	用于保护微驱动系统，并连接接地电极和参考电极。
立体定位仪	RWD生命科学	68513	进行双侧运动皮层的立体定位坐标操作。
蔗糖	Damao	57-50-1	对小鼠大脑进行脱水  灌注后
超级胶水	Henkel AG & Co.	PSK5C	固定导管和镍铬丝。
温度控制器	哈佛仪器公司	TCAT-2	保持小鼠直肠温度在37°C
四环素眼膏	广东恒健制药有限公司	N/A	手术过程中保护小鼠的眼睛。
穿线	拉帕拉	N/A	连接球囊与前置放大器。
Vaseline	联合利华 plc	N/A	用于填补电极阵列与小鼠颅骨之间的间隙。