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无标记两步法分离线粒体以提升蛋白质发现与定量

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DOI：

10.3791/65252

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2023年6月2日

 , 
1Department of Immunobiology, University of Lausanne

本文内容

摘要

我们提出了一种两步法高纯度线粒体分离方案，适用于蛋白质组水平的蛋白质鉴定与定量分析。该方案无需基因工程操作，因此适用于从任何原代细胞和组织中提取线粒体进行研究。

摘要

从中心代谢到免疫反应再到神经退行性疾病，大多数生理和疾病过程均涉及线粒体。线粒体蛋白质组由1000多种蛋白质组成，每种蛋白质的丰度均可在外界刺激或疾病进展过程中发生动态变化。本文介绍一种从原代细胞和组织中分离高质量线粒体的实验方案。该两步法包括：（1）通过机械匀浆和差速离心分离粗线粒体；（2）采用无标签免疫捕获法纯化线粒体，以获得高纯度的细胞器并去除污染物。通过定量质谱分析各纯化阶段的线粒体蛋白质，并计算富集得率，从而利用减法蛋白质组学发现新的线粒体蛋白。本方案为研究细胞系、原代细胞及组织中的线粒体成分提供了一种灵敏且全面的方法。

引言

线粒体是复杂且动态的细胞器，能够感知并适应细胞的代谢需求。作为细胞代谢复杂性的核心，线粒体充当代谢枢纽，碳水化合物、蛋白质、脂质、核酸以及辅因子的代谢反应在此交汇1。它们还作为天然免疫反应通路以及对离子和活性氧物种变化响应的信号细胞器2,3。迄今为止，已有约1,100种蛋白质被定位到线粒体中4,5,6，但我们可推测仍有许多尚未被发现，尤其是那些仅在特定细胞类型中或在特定环境条件下短暂表达的蛋白质。开发用于量化线粒体组成在特定代谢状态下变化的新方法，将增进我们对这些细胞器的认识，并为以线粒体功能障碍为特征的疾病揭示新的治疗途径7。

目前已有多种线粒体分离方案，其产量和纯度各不相同8。基于离心的方法因其操作简便且成本较低而最为常用。尽管适用于大多数应用，差速离心法在获得较低纯度线粒体的同时，当采用更复杂的密度梯度方法时，还需要大量的起始材料。近年来，一些新的线粒体分离方法相继出现，例如基于标签的免疫捕获（"MITO-IP"）9和荧光激活细胞器分选技术10。虽然这两种方法均可获得高纯度的样品，但前者需要通过基因工程对线粒体进行标记以实现亲和纯化，因此这些方案无法适用于未经修饰的生物体或人类供体的原代材料；而后者则依赖于流式细胞仪及分选设备的可用性。结合不同的分离方法有望建立更为稳健的实验流程，并进一步提高纯度。

本文介绍了一种基于两种现有方法组合的新型线粒体分离方案：（1）差速离心法用于分离粗制线粒体组分；（2）利用超顺磁性微珠共价结合抗线粒体外膜转运酶22（Tomm22）的抗体，无需标签即可实现对线粒体的免疫捕获11，Tomm22是一种普遍存在的线粒体外膜蛋白（图1）。本方案适用于定量蛋白质质谱分析，且由于无需标签且不涉及基因操作，因此可广泛应用于多种研究模型，包括细胞系、体液以及完整动物组织。此外，该方案包含两个步骤，可实现减法蛋白质组学6,12，从而用于发现新的线粒体蛋白并研究其表达情况。

方案

必须始终佩戴手套，并在层流罩内进行细胞培养操作。细胞在37 °C、5% CO2的培养箱中维持培养。本方案中所涉及的研究已获得洛桑大学及瑞士关于动物使用指南的批准，并严格遵守相关规定执行。

1. RAW264.7 巨噬细胞系的培养

  1. 在添加了5%热灭活胎牛血清（HI-FBS）以及100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（P/S）的高糖含谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞。
    注意：分离线粒体时，一个15 cm的完全汇合培养皿（约含70 × 107个RAW264.7细胞）已足够。
  2. 将RAW264.7细胞维持在组织培养皿中。初始接种密度为1 × 105 个细胞/mL时，可在3天内达到完全汇合。每个15 cm培养皿使用25 mL细胞悬液。RAW264.7细胞具有较高的细胞分裂速率，需比大多数细胞系更频繁地传代。
  3. 消化RAW264.7细胞
    1. 吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。
    2. 对于15 cm培养皿，加入8 mL预热的RAW细胞解离缓冲液（270 mM氯化钾，30 mM二水合柠檬酸钠溶于H2O中，经无菌过滤），于37 °C孵育5分钟。
    3. 向培养皿中加入等体积的培养基（使解离缓冲液稀释至1:1），用移液器吹打以使细胞脱离并混匀。
    4. 将细胞悬液转移至锥形管中，在室温下以300 × g离心3分钟。
    5. 吸除上清液，将沉淀重悬于适量培养基中（见步骤1.1），用于细胞计数。
      ​注意：也可采用其他方法消化RAW264.7细胞，例如胰酶消化或细胞刮刀刮取。但这些方法对细胞损伤较大，可能导致细胞在消化后数天内极化为M1样巨噬细胞。

2. 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的分离与培养

注意：此处描述的方案适用于单只小鼠，可根据需要按比例放大以适用于多只小鼠。关于BMDM分离与培养的详细方案已在其他文献中描述13,14。

  1. 使用高剂量 CO2 处死一只 8–12 周龄的 C57BL/6 小鼠。
    注：可使用雄性或雌性小鼠。
  2. 用 75% 乙醇喷洒小鼠体表以进行消毒。
  3. 解剖并采集小鼠的髋骨、股骨和胫骨15。
  4. 为采集股骨和胫骨中的骨髓，需去除两根骨骼的膝关节端15。通过去除髋臼获取髋骨中的骨髓。
  5. 将骨骼转移至含有 4 mL 冰上预冷的 BMDM 培养基（含高糖和谷氨酰胺的 DMEM，补充 5% 热灭活胎牛血清、青霉素/链霉素和 10 mM HEPES）的 50 mL 锥形管中。
    注：将骨骼保持在培养基中至关重要，以避免在解剖过程中骨髓干燥。
  6. 在 6 孔板的两个不同孔中分别加入 4 mL PBS 和 4 mL 预热的 BMDM 培养基。
  7. 将 50 mL 锥形管中的骨骼和培养基转移至 6 孔板的一个空孔中。
  8. 使用镊子将骨骼转移至 PBS 孔中进行清洗。
  9. 将骨骼转移至含有预热 BMDM 培养基的孔中。
  10. 用镊子在两个 0.5 mL 离心管底部打一个直径为 1–2 mm 的小孔，并将它们放入 1.5 mL 离心管中。
    注：此快速步骤无需在管中添加培养基。
  11. 在每个 0.5 mL 管中放入一根股骨、一根胫骨和一个髋骨，使暴露的骨髓端朝向管底。
  12. 以 13,000 × g 在室温下离心 1 分钟 ，使骨髓和残留培养基通过 0.5 mL 管底部的小孔进入 1.5 mL 管中。弃去带有骨骼的 0.5 mL 管。
  13. 用 BMDM 培养基重悬骨髓沉淀，并转移至 15 mL 锥形管中。
  14. 加入 BMDM 培养基至总体积为 10 mL。
  15. 将 40 µm 细胞筛置于 50 mL 锥形管上，过滤骨髓悬液。
  16. 以 300 × g 在室温下离心 5 分钟，以收集完整细胞并去除细胞悬液中的细小碎片。
  17. 准备 70 mL BMDM 培养基，并补充 50 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。
  18. 用 10 mL 含 M-CSF 的 BMDM 培养基重悬细胞沉淀。
  19. 向七个 10 cm 培养皿中各加入 9 mL 含 M-CSF 的 BMDM 培养基。
  20. 在每个 10 cm 培养皿中接种 1 mL 细胞悬液（约 1 × 107 个细胞）。
  21. 通过在培养皿中轻柔吹打使细胞悬液混匀，随后将培养皿放入培养箱中。
  22. 3 天后，向每个培养皿中加入 5 mL 预热的含 50 ng/mL M-CSF 的 BMDM 培养基。
  23. 在 3 天后（即骨髓分离后的第 6 天），通过显微镜观察验证 BMDM 的贴壁与分化情况。
    注：此时可直接进入线粒体分离步骤（步骤 3）。或者，也可对 BMDM 进行传代培养，以便 用细胞因子或小分子化合物处理。
  24. BMDM 的脱离
    1. 吸除各培养皿中的培养基，加入 7 mL 含 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的冷 PBS。
    2. 在 4 °C 下孵育细胞 7–8 分钟。
    3. 使用 10 mL 移液器轻柔吹打，使 BMDM 脱离培养皿表面。
    4. 将七个培养皿中重悬的 BMDM 合并至一个 50 mL 锥形管中，以 300 × g 在室温下离心 3 分钟。
    5. 吸除上清液，用 40 mL 预热的 BMDM 培养基重悬细胞，用于细胞计数。
      注：每只小鼠可获得 7–9 × 107 个 BMDM。建议用于蛋白质组学分析的线粒体分离至少需要 6 × 107 个 BMDM。
    6. 如实验需求，可将 BMDM 重新接种并进行相应处理；否则直接进入步骤 3.3。

3. 通过差速离心法制备粗线粒体组分

注意：所有离心步骤均须在 4 °C 下进行。需要两台离心机，一台配备可摆动转子及适用于锥形管的适配器，相对离心力至少为 300 x g；另一台相对离心力至少为 21,000 x g，适用于 1.5 mL 离心管。使用贴壁细胞时，需使用细胞刮刀。

  1. 对于贴壁细胞，吸去培养基，每15 cm培养皿加入10 mL PBS。
    注意：在 PBS 中刮取细胞可同时实现洗涤。若细胞已处于悬浮状态，可直接进行步骤 3.3。
  2. 使用细胞刮刀刮下细胞，并将细胞收集至一个50 mL锥形管中。通过反复吹打混匀细胞悬液。
    注意：可以使用细胞刮刀使细胞脱落，因为这种方法更快，且细胞在之后会很快被裂解。
  3. 对于每个实验条件，将细胞悬液体积的5%转移至一个1.5 mL离心管中，并在300 x g下离心 g 室温下孵育5分钟。
    注意：使用悬浮细胞时，务必先用 PBS 清洗细胞一次，以去除培养基中可能存在的污染物（如 FBS）。
  4. 弃去上清液，将沉淀物置于冰上保存。
    注意：这将代表 "总细胞数" 蛋白质组学用组分
  5. 将步骤 3.1 或 3.2 中剩余的样品在 300 ×g 离心 x g 室温下孵育5分钟。
  6. 所有后续步骤均需在冰上操作，并使用预冷的缓冲液。
  7. 吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL预冷的线粒体缓冲液（MB）（210 mM甘露醇，70 mM蔗糖，10 mM HEPES/NaOH [pH 7.4]，1 mM EDTA）中。
  8. 通过离心（300 x g）回收细胞 g 4 °C下离心5分钟。
  9. 将细胞沉淀重悬于0.5 mL预冷的MB中，转移至1.5 mL离心管。
    注意：此步骤获得的细胞浓度约为 1.5 x 108 BMDM 细胞/mL 或 3 x 108 RAW264.7 细胞/mL
  10. 使用带有25 G针头的1 mL注射器，通过针头反复吹打细胞悬液30次以进行匀浆处理（图1A).
  11. 加入1 mL预冷的MB至离心管中，通过倒置混匀。将匀浆后的细胞悬液在2,000 x g 4 °C下离心5分钟。
  12. 将1 mL上清液转移至预冷的1.5 mL离心管中，注意不要扰动细胞沉淀。重新悬浮细胞沉淀，并按照步骤3.7再次进行匀浆处理。
  13. 将前两步获得的匀浆细胞沉淀和上清液合并至一个1.5 mL离心管中，于2,000 x g离心 g 4 °C下离心5分钟。
    注意：此时沉淀物主要含有细胞核和未破碎的细胞，应弃去。上清液含有细胞碎片、胞质溶胶和细胞器，包括线粒体（图1B).
  14. 将上清液分装至四个1.5 mL离心管中。
    注意：在此阶段将上清液分装至多个管中，有助于在后续步骤中更有效地去除污染物。
  15. 向四支试管中分别加入MB，使每管终体积为1 mL。颠倒混匀后，于13,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
    注意：此步骤之后，可见到具有两层的沉淀。底部紧实的棕色沉淀含有线粒体，保留用于进一步纯化（图1C上层松散的白色沉淀物含有其他细胞结构，可弃去。
  16. 小心操作此步骤。尽可能多地移除上清液及白色上层沉淀。通过轻轻吹打，可将白色沉淀重新悬浮后弃去，从而保留完整的棕色线粒体沉淀。
  17. 将四支试管中的一支含有线粒体沉淀的试管置于冰上。这代表 "粗线粒体" 蛋白质组学组分
  18. 将其余三个沉淀合并至一个1.5 mL离心管中，加入1 mL MB缓冲液，使终体积为1 mL。

4. 基于超顺磁性抗体的线粒体纯化

注意：所有以下步骤均须在4 °C的冷室中进行。

  1. 将步骤 3.18 中得到的 1 mL 粗线粒体样品转移至一个 15 mL 圆锥形离心管中，并加入 7 mL 添加了 150 mM NaCl 的 MB 缓冲液（MB + NaCl）。
    注意：添加 NaCl 可改善抗体结合效果，并减少杂质与磁珠及线粒体的非特异性结合。
  2. 向 8 mL 粗线粒体悬液中加入 50 µL Tomm22 磁珠（图 1D），将离心管置于 4 °C 低速旋转仪上孵育 15 分钟。
    注意：Tomm22 磁珠共价结合了小鼠来源的抗 Tomm22 单克隆抗体，并偶联于超顺磁性磁珠上。
  3. 同时，将层析柱置于磁力架上。
  4. 用 8 mL MB + NaCl 缓冲液平衡层析柱，并弃去穿流液。
  5. 样品与 Tomm22 磁珠在 4 °C 孵育 15 分钟后，将样品转移至层析柱中，弃去穿流液。
    注意：线粒体将通过磁珠保留在层析柱内（图 1E）。
  6. 用 8 mL MB + NaCl 缓冲液洗涤层析柱三次。
  7. 将层析柱从磁力架上取下，放入一个 15 mL 圆锥形离心管中。
  8. 向层析柱中加入 1.5 mL MB + NaCl 缓冲液以洗脱线粒体，并立即插入推杆，使纯化的线粒体洗脱至离心管中。
  9. 将洗脱得到的线粒体转移至一个 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 下以 21,000 × g 离心 10 分钟。
    注意：将形成棕色沉淀，其中包含分离的线粒体以及部分抗体偶联磁珠（图 1F）。
  10. 小心移除沉淀上方的上清液。所得沉淀即为蛋白质组学分析所用的"纯线粒体"组分。该沉淀以及步骤 3.4 和 3.17 所得沉淀可保存于 -20 °C，用于后续实验分析。

结果

本方案中生成了三种线粒体纯度逐步提高的样品：全细胞、粗线粒体（“mito-crude”）和纯线粒体（“mito-pure”）（图1）。我们通过将各组分等量蛋白质上样进行凝胶电泳及免疫印迹分析，验证了RAW264.7巨噬细胞系中线粒体的纯化效果，结果发现线粒体柠檬酸合酶（Cs）在每一步纯化过程中均逐渐富集；与此同时，来自细胞质（GAPDH）、质膜（Na/K ATP酶）、细胞核（Lamin B）、溶酶体（Lamp1）以及内质网（ER）（Pdi）的蛋白则逐步减少直至消失（图2A）。在骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中也获得了类似结果。为进一步验证分离所得线粒体的纯度与完整性，我们对纯线粒体组分进行了透射电子显微镜观察。结果显示，线粒体呈典型的椭圆形结构，具有完整的嵴，并被对应于抗体包被磁珠的电子致密颗粒所包围（图2B）。因此，可以得出结论：本方案能够有效富集线粒体，去除其他细胞组分，并保持线粒体结构的完整性。

接下来，使用液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）对每个组分进行蛋白质组分析。在全细胞提取物中总共鉴定出6,248种蛋白质，其中907种在MitoCarta3.0数据库中先前被注释为线粒体蛋白5。在筛选出至少含有两个独特肽段的蛋白质后，我们根据各蛋白质在各样品中的信号强度相对于全细胞的比值，计算了每种蛋白质的富集分数。随后，我们参考基因本体（Gene Ontology, GO）16,17 和 MitoCarta3.05，将这些蛋白质分配至七个主要的亚细胞区室：线粒体、内质网（ER）、溶酶体、高尔基体、细胞骨架、细胞核和胞质溶胶。重要的是，在粗线粒体和纯化线粒体组分中，线粒体蛋白的平均富集倍数分别超过10倍和20倍（图2C）。相比之下，在纯化过程中，其余六个亚细胞区室的组分均被显著去除。值得注意的是，在粗线粒体组分中，我们观察到内质网和溶酶体蛋白出现短暂富集，这两类污染物蛋白在差速离心操作后常有残留18。这可能是由于细胞器之间的相互作用以及相近的沉降系数所致，尤其是溶酶体在巨噬细胞中含量较高，更易发生此类情况19。尽管在免疫捕获后这两类蛋白大部分已被去除，我们仍在纯化线粒体组分（mito-pure fraction）中检测到少量来自内质网-线粒体接触位点的蛋白质信号。

随后，我们直接比较了全细胞和线粒体纯化样品中的蛋白质丰度，观察到两个不同的蛋白群体，分别对应线粒体蛋白和非线粒体蛋白（图2D）。尽管绝大多数MitoCarta蛋白聚集在一起，但我们发现有少数（<5%）与非MitoCarta蛋白聚类。这些蛋白可能代表：（1）细胞质中与线粒体相互作用的蛋白（MitoCarta 3.0版本中新注释的一类）；（2）双定位蛋白；或（3）注释错误的蛋白。相反，我们也发现了一些非MitoCarta蛋白与线粒体蛋白聚类的情况。这类蛋白可能源于分离过程中的污染物，但也可能代表此前未被归类为存在于线粒体中的蛋白。

为了研究这类新的潜在线粒体蛋白，可采用减法蛋白质组学方法，该方法已被证明在包括线粒体在内的细胞器蛋白质组发现中具有重要作用。6,12，被使用。减法蛋白质组学假设在线粒体纯化步骤中其含量应逐渐富集，而污染物则应逐渐减少。6例如，在差速离心过程中污染物可能会积累（例如由于沉降特性相似），或在免疫捕获过程中积累（例如由于抗体的非特异性结合），而仅 真正有效的 线粒体蛋白应在两者中显著富集。因此，可以过滤掉那些在纯化的线粒体组分中被检测到但富集模式不一致的蛋白质。在本例使用RAW264.7细胞的实验中，通过设定线粒体粗提物（mito-crude）和纯化线粒体（mito-pure）样本中唯一肽段数阈值≥1，并采用严格的富集阈值，我们将差速离心后从粗线粒体组分中最初鉴定到的1,127种线粒体蛋白质组减少至经Tomm22免疫筛选二次纯化后的481种。纯化线粒体组分中MitoCarta注释蛋白数量的减少反映了筛选过程所采用的高严格性。有趣的是，在纯化线粒体组分中存在的蛋白质中，有70种未出现在MitoCarta3.0数据库中图3A，B这些后者蛋白可能代表潜在的新型线粒体候选蛋白，可能仅在RAW264.7巨噬细胞系及相关细胞中表达，值得进一步研究。

线粒体分离示意图：细胞匀浆、细胞核分离、磁性分离、纯度。
图1：两步无标签线粒体分离方案示意图。（A）细胞悬液通过25 G针头进行机械破碎。（B）在2,000 × g 条件下离心，分离细胞核和完整细胞，保留上清液。（C）将上清液在13,000 × g 条件下进行差速离心，分离粗线粒体（mito-crude）。（D）将粗线粒体与共价连接于超顺磁性微珠的Tomm22抗体（Ab）共同孵育。（E）利用磁性柱将线粒体-Tomm22抗体-微珠复合物与杂质分离并洗脱。（F）通过离心收集并浓缩纯化的线粒体（mito-pure）。请点击此处查看该图的放大版本。

静态平衡；蛋白质丰度比较；Western印迹、电子显微镜、折线图、散点图。
图2。从小鼠巨噬细胞两种来源分离线粒体的代表性结果。 （A）使用针对线粒体柠檬酸合酶（Cs - 线粒体）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh - 胞质溶胶）、钠钾泵（Na/K ATPase - 质膜）、Lamin B（Lamin B - 细胞核）、溶酶体相关膜蛋白1（Lamp1 - 溶酶体）和蛋白二硫键异构酶（Pdi - 内质网）的抗体，对RAW264.7（上图）和BMDM细胞（下图）进行蛋白质免疫印迹分析。 （B）从RAW264.7细胞中纯化的线粒体的电子显微镜图像。线粒体周围高密度颗粒对应于Tomm22磁珠，这些磁珠在从层析柱洗脱后仍保留在mito-pure样品中。比例尺：80 nm。 （C）在RAW264.7细胞中，全细胞、mito-粗提物和mito-纯化物中七个细胞区室的富集评分。使用MitoCarta3.0和GO进行蛋白质注释，并展示平均评分。缩写：ER = 内质网。 （D）RAW264.7细胞中全细胞和mito-纯化样品中蛋白质的丰度值（riBAQ）。MitoCarta3.0蛋白质以橙色显示。 请点击此处查看该图的放大版本。

线粒体蛋白富集过程；饼图、相对丰度图；MitoCarta 分析。
图 3。利用减法蛋白质组学发现新的线粒体蛋白。 （A）用于发现新线粒体蛋白的减法蛋白质组学策略。采用高筛选阈值（4倍和2倍），以尽量减少假阳性蛋白的筛选。(B) 在 MitoCarta3.0 数据库中先前未注释的新线粒体候选蛋白的富集产量（相对于总细胞的倍数）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们结合了差速离心和免疫捕获技术，以提高线粒体分离的纯度。本方法可获得用于鉴定和表征新型线粒体蛋白的初级样品。该实验方案简便且可靠，适用于细胞系、原代细胞和组织，无需进行遗传修饰。我们通过对纯化过程中不同阶段的样品进行免疫印迹和蛋白质组学分析，验证了本方案的有效性。

与单一的分离方法相比，结合不同类型富集步骤（此处为离心和免疫标记）能够建立一种更为可靠的线粒体分离方案。这是因为虽然线粒体蛋白在两种纯化过程中均会得到富集，但污染物同时在两个富集步骤中被富集的可能性较低。尽管通过密度梯度超速离心也可实现高纯度的线粒体分离，但该方法需要大量起始材料以及超速离心机的使用条件。最后，与基于标签的线粒体分离新方法20相比，本方法无需对样本进行遗传修饰，因此适用于来自任何来源的原代材料。

在应用本实验方案时，实验设计中需考虑一些技术和生物学因素。（1）起始材料的数量至关重要，以确保获得足够的产物。在匀浆过程中（步骤 3.10）不可避免会损失少量线粒体，因为并非所有细胞都会被裂解，此外在三次柱洗涤过程中（步骤 4.6）也会造成损失。尽管本方案更注重纯度而非得率，但线粒体分离的效率及其得率尚未被测量或优化。使用更多的 Tomm22 磁珠和更多层析柱有望提高线粒体回收得率。同时，对匀浆步骤进行充分优化也有助于提升线粒体得率。本方案以及我们在此报告的 RAW264.7 细胞和 BMDMs 所需的初始细胞数量适用于蛋白质组学分析，也可根据其他应用进行调整。对于原代 BMDMs，我们发现一只小鼠即可满足一个重复实验的需求。在 必要时，可扩大实验规模，从多只动物中分离 BMDMs 并合并样本以获得足够的材料。细胞数量可根据细胞类型、细胞大小及其线粒体含量进行优化。（2）Tomm22 在所有细胞类型和组织来源的线粒体上均有表达21，但其表达水平可能存在差异。因此，在设计用于比较不同条件的实验时，必须确保 Tomm22 的表达水平具有可比性。此外，由于 Tomm22 具有广泛表达特性，无法利用该方法研究复杂组织中特定细胞类型的线粒体蛋白。（3）获得高纯度线粒体所需的时间（约 2.5 小时）不适合研究瞬时事件，例如代谢谱的动态变化。在此情况下，我们推荐采用基于标签的直接免疫捕获技术9，该方法还可用于在活体（in vivo）条件下研究特定细胞类型的线粒体20。（4）尽管已有研究显示，仅使用 Tomm22 抗体标记的磁珠所分离的线粒体在功能检测中表现出活性11，但尚需确定本方案所获得的线粒体是否适用于后续基于活性的功能检测。MitoTracker 或四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）染色，以及呼吸测定法，是评估分离线粒体功能状态的潜在方法22。（5）在将“"mito-pure"”样品从层析柱洗脱后，部分 Tomm22 磁珠会存在于高纯度线粒体组分中（图 2B）。虽然我们观察到这些磁珠对胰蛋白酶消化和蛋白质质谱分析无干扰，但在其他下游应用中仍需考虑磁珠及免疫球蛋白的存在。Tomm22 抗体是由小鼠产生的单克隆抗体23，因此在免疫印迹实验中若使用抗小鼠的二抗，将产生与免疫球蛋白链大小一致的非特异性条带，这一点需特别注意。（6）细胞悬液的充分匀浆是成功分离线粒体的关键。本实验中，我们使用带有 25 G 针头的注射器裂解 RAW264.7 细胞和 BMDMs。然而，根据细胞类型和大小的不同，其他机械匀浆方法（如使用 Dounce 匀浆器）或更可控的方法（如细胞匀浆仪设备）可能更为合适。非机械匀浆方法，例如温和超声处理，也可考虑使用。组织匀浆方法在其他研究中已有进一步讨论24,25。（7）尽管免疫印迹验证是最直接且成本较低的方法，但其结果并不总能与整个细胞器水平的变化相对应。因此，我们建议采用蛋白质组学方法全面验证线粒体及其他细胞器的富集或耗竭情况。

本文所述的两步线粒体纯化方案使我们能够获得线粒体纯度逐步提高的连续样品，从而通过减法蛋白质组学发现新的线粒体蛋白候选分子12。在分析中，我们采用严格的阈值筛选显著富集的线粒体蛋白；尽管这种方法可能无法识别某些已知的 线粒体蛋白（图3A），但可降低新线粒体蛋白发现的假阳性率。然而，必须强调的是，本方案所揭示的任何候选蛋白都必须通过正交方法进行验证。我们建议采用羧基末端GFP标记，或使用针对内源蛋白的抗体，通过显微镜观察或蛋白酶保护实验来验证其与线粒体的关联。

我们的方法在未经修饰的细胞和组织中的直接应用，为研究线粒体在健康和疾病状态下如何变化及其对环境的适应提供了强有力的工具。将本方案应用于细胞系、动物疾病模型、人体体液，甚至手术活检样本，可能对深入理解线粒体及其相关疾病具有特别重要的意义。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢洛桑大学蛋白质分析平台和电子显微镜平台的Manfredo Quadroni提供的帮助。同时感谢H.G. Sprenger、K. Maundrell以及Jourdain实验室成员对本文手稿提出的建议和反馈。本工作得到了Pierre-Mercier科学基金会和瑞士国家科学基金会（项目资助号310030_200796）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD Plastipal309628
25 G 针头BD Microlance300400
40 µm 细胞筛Corning352340
抗 TOM22 磁珠（小鼠）Miltenyi Biotec130-127-693
细胞刮刀FisherScientific11577692
DMEM，高糖，含 GlutaMAXThermoFisher31966
乙二胺四乙酸FisherScientificBP-120-1
胎牛血清Gibco10270
HEPESBioConcept5-31F00-H
LS 柱及推杆Miltenyi Biotec130-042-401
巨噬细胞集落刺激因子Immunotools12343115 
甘露醇SigmaM4125
氯化钠Sigma71380
蔗糖SigmaS1888
青霉素/链霉素BioConcept4-01F00-H
培养皿CorningBH93B-102
10X 磷酸盐缓冲液Eurobio ScientificCS3PBS01-01
QuadroMACS 分离器Miltenyi Biotec130-090-976
Vi-CELL BLU 细胞活力分析仪Beckman CoulterC19196

参考文献

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Chakrabarty, R. P., Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles control mammalian stem cell fate. Cell Stem Cell. 28 (3), 394-408 (2021).
  4. Morgenstern, M., et al. Quantitative high-confidence human mitochondrial proteome and its dynamics in cellular context. Cell Metabolism. 33 (12), 2464-2483 (2021).
  5. Rath, S., et al. MitoCarta3.0: an updated mitochondrial proteome now with sub-organelle localization and pathway annotations. Nucleic Acids Research. 49, D1541-D1547 (2021).
  6. Pagliarini, D. J., et al. A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology. Cell. 134 (1), 112-123 (2008).
  7. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocrine Reviews. 41 (3), 005(2020).
  8. Bury, A. G., Vincent, A. E., Turnbull, D. M., Actis, P., Hudson, G. Mitochondrial isolation: when size matters. Wellcome Open Research. 5, 226(2020).
  9. Chen, W. W., Freinkman, E., Sabatini, D. M. Rapid immunopurification of mitochondria for metabolite profiling and absolute quantification of matrix metabolites. Nature Protocols. 12 (10), 2215-2231 (2017).
  10. Daniele, J. R., Heydari, K., Arriaga, E. A., Dillin, A. Identification and characterization of mitochondrial subtypes in Caenorhabditis elegans via analysis of individual mitochondria by flow cytometry. Analytical Chemistry. 88 (12), 6309-6316 (2016).
  11. Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), e82392(2013).
  12. Yates, J. R., Gilchrist, A., Howell, K. E., Bergeron, J. J. M. Proteomics of organelles and large cellular structures. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (9), 702-714 (2005).
  13. Trouplin, V., et al. marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).
  14. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323(2013).
  15. Toda, G., Yamauchi, T., Kadowaki, T., Ueki, K. Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis. STAR Protocols. 2 (1), 100246(2020).
  16. Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Research. 49, D325-D334 (2021).
  17. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
  18. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
  19. Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., Trombetta, E. S. Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science. 307 (5715), 1630-1634 (2005).
  20. Bayraktar, E. C., et al. MITO-Tag mice enable rapid isolation and multimodal profiling of mitochondria from specific cell types in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (1), 303-312 (2019).
  21. Nusinow, D. P., et al. Quantitative proteomics of the cancer cell line encyclopedia. Cell. 180 (2), 387-402 (2020).
  22. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  23. Hornig-Do, H. T., et al. Isolation of functional pure mitochondria by superparamagnetic microbeads. Analytical Biochemistry. 389 (1), 1-5 (2009).
  24. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
  25. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods in Enzymology. 457, 349-372 (2009).

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