成年小鼠血管纹组织的解剖用于单核测序或免疫染色

摘要

血管纹对于耳蜗内电位的产生至关重要。本文介绍了用于单核测序或免疫染色的成年小鼠血管纹解剖方法。

摘要

由血管纹生成的耳蜗内电位对于维持毛细胞机械转导及最终实现听觉所需的适宜环境至关重要。血管纹的病理改变可导致听力下降。对成年个体血管纹进行解剖，可实现特异性单细胞核捕获，进而开展单细胞核测序和免疫染色。这些技术被用于在单细胞水平上研究血管纹的病理生理机制。

单核测序可用于血管纹的转录组学分析。与此同时，免疫染色在鉴定特定细胞群体方面仍然具有重要价值。这两种方法均需以准确的血管纹分离为前提，而这一操作在技术上可能具有挑战性。

引言

耳蜗由三个充满液体的腔室组成，即前庭阶、中阶和鼓室阶。前庭阶和鼓室阶内均含有外淋巴液，其钠离子浓度较高（138 mM），钾离子浓度较低（6.8 mM）¹。中阶内含有内淋巴液，其钾离子浓度较高（154 mM），钠离子浓度较低（0.91 mM）^1,2,3。这种离子浓度差异被称为耳蜗内电位（EP），主要由钾离子通过耳蜗外侧壁的血管纹（SV）中的多种离子通道和缝隙连接移动而产生^{4,5,6,7,8,9,10,11}。血管纹是一种结构异质、高度血管化的组织，位于耳蜗外侧壁的内侧部分，包含三种主要细胞类型：边缘细胞、中间细胞和基底细胞¹²（....

方案

所有动物实验和操作均根据美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会批准的方案进行。所有实验方案均经美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会批准。所有方法均按照美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会的相关指南和规定实施。

1. 动物安乐死

1. 使用出生后第30天及以上（P30+）、体重在15–20 g之间的C57BL/6J或Kcnj10-ZsGreen转基因小鼠。
2. 采用批准的安乐死程序（此处为CO₂窒息法）处死一只成年小鼠（年龄P30或以上），并以断头作为辅助步骤。
   注意：若进行免疫染色，某些抗体可能因非特异性结合血管纹（SV）毛细血管中的血液而产生背景信号。通过心脏灌注固定液可清除血管纹毛细血管中的血液，从而解决此问题。然而，大多数抗体无需此步骤即可获得良好结果，因此本方案不涵盖该方法。

2. 暴露骨迷路

1. 用70%乙醇喷洒小鼠并用纸巾擦拭以进行清洁。特别注意头部区域，以降低污染风险。通过将皮肤向鼻部方向拉扯，去除颅骨上的皮肤。
....

结果

我们介绍一种用于分离血管纹（SV）的方法，可用于单核测序（sNuc-Seq）或免疫染色。耳蜗相对于血管纹（SV）的相关解剖结构（图1）有助于用户更好地理解血管纹的组织结构以及解剖操作步骤。

该视频详细展示了从一只P30小鼠中进行SV显微解剖的每一步操作，图2则呈现了SV解剖与分离关键步骤的截图。

sNuc-Seq 可用于研究异质性 SV 中各类细胞的转录谱。一种可视化方法是在二维 UMAP 上进行聚类（图 3）。通过 sNuc-Seq 产生的数据集可采用多种数据分析技术进行评估，具体将在讨论部分进一步阐述。

SV 经 GS-IB4 和 DAPI 免疫标记以及 Kcnj10-ZsGreen 荧光标记后的整体封片结果如图4.......

讨论

在单细胞测序技术出现之前，许多研究人员采用组织整体分析方法，这种方法仅能对细胞群体的转录组进行平均化分析。而单细胞测序和单细胞核转录组测序（sNuc-Seq）则分别实现了对单个细胞或单个细胞核转录组的分离与分析³²。在此基础上，可分别鉴定出边缘细胞、中间细胞、基底细胞以及梭形细胞的单细胞核转录组³⁰。这使得研究人员能够探究螺旋韧带（SV）不同细胞类型之间的转录异质性，并可用于未来进一步研究这些细胞类型在SV功能中的作用，包括内电位（EP）的产生与维持。通过sNuc-Seq生成的数据集可通过降维方式呈现，以帮助理解整体转录差异，并利用UMAP图对不同细胞群体进行比较 图4。对sNuc-Seq数据集的生物信息学分析有多种方法，包括但不限于：差异表达分析、单细胞调控网络推断与聚类（SCENIC）、热图或网格小提琴图构建，以及调控子分析¹⁸。针对单细胞RNA测序的其他计算分析技术与sNuc-Seq类似，更多细节可参见Hwang等

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-µm 滤膜（聚对苯二甲酸乙二醇酯）	PluriSelect	#43-50010-01	在 sNuc-Seq 过程中过滤组织
18 x 18 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-541A	用于封片 SV 样本
30-µm 滤膜（聚对苯二甲酸乙二醇酯）	PluriSelect	#43-50030-03	在 sNuc-Seq 过程中过滤组织
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorfrost Plus 显微载玻片	Daigger	EF15978Z	用于承载 SV 样本的载玻片
C57BL/6J 小鼠	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	通用型小鼠品系，其色素在 SV 中间细胞中更易观察。
细胞计数仪	Logos Biosystems	L20001	用于细胞计数
Chalizon 刮匙 5''，3 号，2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	用于转移 SV
Chromium Next GEM 单细胞 3' GEM 试剂盒 v3.1	Chromium	PN-1000141	用于构建单细胞 3' 基因表达文库
透明指甲油	Fisher Scientific	NC1849418	用于密封 SV 封片
Corning Falcon 标准组织培养皿，24 孔	Corning	08-772B	解剖过程中用于盛放样本的培养皿
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	用于细胞核标记的染料
Dounce 匀浆器	Sigma-Aldrich	D8938	用于 sNuc-Seq 前组织匀浆
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-30	通用解剖镊
Dumont #55 镊子	Fine Science Tools	11255-20	尖端精细的镊子，便于操作 SV
胎牛血清	ThermoFisher	16000044	用于 sNuc-Seq 的若干步骤
胶棒	Fisher Scientific	NC0691392	用于固定 SV
GS-IB4 抗体	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	用于毛细血管标记的抗体
KCNJ10-ZsGreen 转基因小鼠	n/a	n/a	表达 KCNJ10-ZsGreen 的转基因小鼠，尤其在 SV 的中间细胞中表达。
MgCl₂	ThermoFisher	AM9530G	用于 sNuc-Seq 的若干步骤
封片剂	ThermoFisher	#S36940	用于 SV 封片的试剂
24 孔多孔板	Corning	#353047	用于免疫染色的板
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	用于 sNuc-Seq 的若干步骤
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	用于 sNuc-Seq 的若干步骤
无核酸酶水	ThermoFisher	4387936	用于 sNuc-Seq 的若干步骤
轨道摇床	Silent Shake	SYC-2102A	用于免疫染色步骤
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	用于免疫染色和解剖步骤
RNA Later	Invitrogen	AM7021	用于保存 SV 以进行 sNuc-Seq
剪刀	Fine Science Tools	14058-09	用于剪开小鼠颅骨
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	用于 sNuc-Seq 的若干步骤
台盼蓝染液	Gibco	15250061	用于细胞计数
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	用于 sNuc-Seq 的若干步骤
Zeiss STEMI SV 11 Apo 体视显微镜	Zeiss	n/a	用于解剖的显微镜