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方法文章

成年小鼠血管纹组织的解剖用于单核测序或免疫染色

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DOI：

10.3791/65254

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2023年4月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Auditory Development and Restoration Program, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

本文内容

摘要

血管纹对于耳蜗内电位的产生至关重要。本文介绍了用于单核测序或免疫染色的成年小鼠血管纹解剖方法。

摘要

由血管纹生成的耳蜗内电位对于维持毛细胞机械转导及最终实现听觉所需的适宜环境至关重要。血管纹的病理改变可导致听力下降。对成年个体血管纹进行解剖，可实现特异性单细胞核捕获，进而开展单细胞核测序和免疫染色。这些技术被用于在单细胞水平上研究血管纹的病理生理机制。

单核测序可用于血管纹的转录组学分析。与此同时，免疫染色在鉴定特定细胞群体方面仍然具有重要价值。这两种方法均需以准确的血管纹分离为前提，而这一操作在技术上可能具有挑战性。

引言

耳蜗由三个充满液体的腔室组成，即前庭阶、中阶和鼓室阶。前庭阶和鼓室阶内均含有外淋巴液，其钠离子浓度较高（138 mM），钾离子浓度较低（6.8 mM）1。中阶内含有内淋巴液，其钾离子浓度较高（154 mM），钠离子浓度较低（0.91 mM）1,2,3。这种离子浓度差异被称为耳蜗内电位（EP），主要由钾离子通过耳蜗外侧壁的血管纹（SV）中的多种离子通道和缝隙连接移动而产生4,5,6,7,8,9,10,11。血管纹是一种结构异质、高度血管化的组织，位于耳蜗外侧壁的内侧部分，包含三种主要细胞类型：边缘细胞、中间细胞和基底细胞12（图1）。

边缘细胞通过紧密连接相互连接，形成血管纹（SV）最内侧的表面。其顶膜面向蜗管内的内淋巴液，并利用多种通道（包括KCNE1/KCNQ1、SLC12A2和Na+-K+-ATPase（NKA））将钾离子转运至内淋巴液中5,10,13,14。中间细胞是位于边缘细胞与基底细胞之间的色素细胞，通过KCNJ10（Kir 4.1）通道促进钾离子在血管纹中的转运15,16。基底细胞紧邻耳蜗外侧壁，与螺旋韧带中的成纤维细胞密切相关，有助于钾离子从外淋巴液中回收12。血管纹的病理改变与多种耳科疾病相关17,18。在主要血管纹细胞类型中表达的基因（如Kcnq1、Kcne1、Kcnj10和Cldn11）发生突变时，可导致耳聋及血管纹功能障碍，包括内耳电位（EP）的丧失19,20,21,22,23。除了上述三种主要细胞类型外，血管纹中还存在其他研究较少的细胞类型，例如纺锤形细胞22、根细胞12,24、巨噬细胞25、周细胞26和内皮细胞27，它们在离子稳态维持和内耳电位（EP）生成中的作用尚未完全明确28。

与传统的批量RNA测序相比，单细胞核RNA测序（sNuc-Seq）能够提供关于细胞异质性的信息，而非多个细胞间mRNA的平均值29，在研究具有异质性的SV时尤为有用30。例如，sNuc-Seq已获得的转录组分析结果提示，纺锤体细胞和根细胞可能在EP生成、听力损失以及梅尼埃病中发挥一定作用18。对SV中各类细胞类型进行进一步的转录组学表征，将为我们理解不同类型SV相关性听力波动及听力损失背后的病理生理机制提供宝贵信息。因此，获取这些精细的内耳结构对于实现最佳的组织分析至关重要。

本研究描述了从成年小鼠耳蜗中获取并分离血管纹组织以进行单核RNA测序（sNuc-Seq）或免疫染色的显微解剖方法。对成年小鼠血管纹（SV）进行解剖，有助于理解其多种细胞类型，并进一步阐明它们在听觉功能中的作用。

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方案

所有动物实验和操作均根据美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会批准的方案进行。所有实验方案均经美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会批准。所有方法均按照美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会的相关指南和规定实施。

1. 动物安乐死

  1. 使用出生后第30天及以上（P30+）、体重在15–20 g之间的C57BL/6J或Kcnj10-ZsGreen转基因小鼠。
  2. 采用批准的安乐死程序（此处为CO2窒息法）处死一只成年小鼠（年龄P30或以上），并以断头作为辅助步骤。
    注意：若进行免疫染色，某些抗体可能因非特异性结合血管纹（SV）毛细血管中的血液而产生背景信号。通过心脏灌注固定液可清除血管纹毛细血管中的血液，从而解决此问题。然而，大多数抗体无需此步骤即可获得良好结果，因此本方案不涵盖该方法。

2. 暴露骨迷路

  1. 用70%乙醇喷洒小鼠并用纸巾擦拭以进行清洁。特别注意头部区域，以降低污染风险。通过将皮肤向鼻部方向拉扯，去除颅骨上的皮肤。
  2. 使用锋利的剪刀沿正中矢状面切开颅骨，分离左侧和右侧部分。
  3. 将脑组织从颅骨中取出，以暴露骨迷路。

3. 内耳提取

  1. 在颞骨内识别内耳结构（图2A），使用#55镊子刮除脑神经。
    注意：操作者应使用非优势手持另一把#55镊子固定标本。在解剖过程中，可根据需要使用固定镊子夹持标本的不同部位，但需避免夹持关键区域（例如，切勿压碎耳蜗）。
  2. 使用#55镊子分离鼓室和囊结构，并将其从周围骨组织中剥离。清除内耳表面残留的所有软组织。
  3. 将标本转移至含有1×冷PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4）的透明组织培养皿中，并置于解剖显微镜下（图2B）。

4. SV 分离

注意：经过练习，有可能将精囊完整剥离成一条类似带状的长条结构。精囊较为脆弱，若断裂成多个片段，可将其共同存放；或者，也可根据其位置（如基底段、中段、顶端段）分别放入不同且标记清楚的孔中单独保存。

  1. 如果解剖显微镜的光源可调节，将一个光源置于培养皿上方，另一个光源从侧面平行于解剖平面照射。这样可提高耳蜗骨下组织的对比度。
  2. 使用 #55 镊子夹住标本的前庭部分，使耳蜗朝上。
  3. 使用 #55 镊子在耳蜗顶处刺穿耳蜗骨。
    注意：#5 镀子比 #55 更粗，可用于折断骨骼，但其尺寸/强度的增加牺牲了镀子的精细度以及对微小组织的操作能力。建议使用由inox或dumostar等材料制成的镀子，以避免对更精密的镀子造成损伤。操作时应避免将镀子过度深入骨下方，以防损伤SV。
  4. 使用 #55 镊子，沿耳蜗顶回进行刮取（图2C），施加轻柔的力量，剥离外层骨质的小碎片。轻轻抬起骨骼，并将其从侧壁分离。
    注意：将此解剖过程视为以下步骤可能有助于操作 "移除SV周围的所有物质"，而不是 "从耳蜗中解剖出SV".
  5. 继续使用 #55 镊子从耳蜗的顶端和中回部分去除骨组织碎片（图 2D，E)。轻压外侧壁，撬动并移除朝向中回的骨壁碎片，以暴露尖回和中回的外侧壁。
  6. 继续使用#55镊子，轻柔地将耳蜗顶回侧壁推开，以暴露螺旋神经节。沿外毛细胞层将顶回和中回的侧壁从螺旋神经节上分离。从耳蜗内部取出螺旋神经节组织块。
    注意：#55 镊子尺寸较小，在操作小型且精细的组织时具有优势。使用时应格外小心，避免弯曲或损坏。
  7. 为了更好地接触基底回的侧壁，使用#55镊子将耳蜗从颞骨的前庭部分分离。将#55镊子插入圆窗和卵圆窗，并向下朝向前庭方向推动，耳蜗即可分离。随后去除内耳的前庭部分。
  8. 继续使用 #55 镊子，从耳蜗中回区域开始，去除基底耳蜗骨片。轻轻推动骨下侧壁层，使其分离。
  9. 用工具撬动并轻轻牵拉组织，去除侧壁最远端的基底部。该区域的骨质可能过厚，强行去除会损伤下方的软组织。
  10. 现在，随着侧壁基底部的分离，尽可能将侧壁从耳蜗上完整剥离。可通过沿侧壁使用#55镊子进行操作，轻柔地在骨壁与残留的侧壁之间滑动镊子进行分离。若操作者经验丰富，可将侧壁完整剥离至顶回。随后将分离的侧壁转移至新鲜的PBS中。
    注意：尽管较大的SV组织块可能更易于成像，但由于组织较为脆弱，也可取较小的组织块（图 2F，G），并且根据尺寸大小，也可用于成像。
  11. 使用#55号镊子将侧壁展平。精索静脉应在侧壁内侧呈现为颜色较深的组织层。
    注意：在解剖过程中，用户可能会发现，尤其靠近顶端时，部分精囊组织会偶然从侧壁脱离。
  12. 轻轻撬起SV层，使其基端从侧壁分离（图 2H）。轻轻推开已分离的SV，将镊子进一步向侧壁的顶端移动，尽可能将SV作为一个长条状整体剥离（图 2I）。不要用镊子用力挤压精索静脉来牵拉。如果组织过于脆弱而无法抓取，可改用组织刮匙（如睑板腺囊肿刮匙）收集。
    注意：移动SV时应始终在光学显微镜下进行，以确保其不丢失。使用镊子夹取时需格外小心，以防造成损伤。使用者可发现，使用睑板腺囊肿刮匙可降低对SV组织造成损伤的风险。如需进行单核测序，请进入第5节；如需进行SV免疫染色，请进入第7节。

5. SV 单核悬液

注意：本方案专为SV组织改编自已发表的制造商单细胞核悬液制备方案。可使用不同制造商的平台31。由于不同平台之间存在差异，建议查阅随设备提供的针对特定制造商的实验方案。为获得sNuc-Seq的最佳结果并最大限度减少RNA降解，组织解剖应尽可能迅速完成（建议在动物安乐死后15-20分钟内开始）。可考虑每次仅对一只动物实施安乐死，并在准备解剖时再进行。多人同时进行解剖操作也有助于缩短降解时间（例如，一名实验人员处理左耳，另一名同时处理右耳）。

  1. 如果SV组织将用于sNuc-Seq，请将组织置于预冷的裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl，10 mM NaCl，3 mM MgCl2，0.005% Nonidet P40，溶于无核酸酶水中）。
    注意：如果解剖后立即进行测序，请继续执行本方案。如果需要暂停实验流程，可通过将SV组织放入RNAlater中进行保存：在4 °C下过夜储存，随后在液氮中速冻，并转移至-80 °C保存直至使用。使用时，将其解冻后用PBS洗涤两次，每次5分钟，然后继续进行匀浆（步骤5.2）。
  2. 在2 mL玻璃匀浆器中，于冰上用10–20次冲程匀浆组织。
    注意：玻璃杵应手动接触玻璃管底部，以破碎SV组织。由于SV组织较为脆弱，通常20次冲程即可实现充分匀浆。
  3. 在冰上裂解组织25分钟。
    注意：裂解时间根据组织类型而异。在SV组织中，25分钟的裂解可能导致细胞活力较低（低于4%），但如果细胞活力过高（见步骤5.8），可适当调整裂解时间。
  4. 通过30 µm滤膜过滤，并在4 °C下以500 × g离心5分钟收集滤液。
  5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL核洗涤与重悬缓冲液（1× PBS，1%牛血清白蛋白[BSA]，0.2 U/µL RNase抑制剂）中。
  6. 将细胞通过10 µm滤膜过滤，并在4 °C下以500 × g离心5分钟。
  7. 弃去上清液，将沉淀重悬于50 µL核洗涤与重悬缓冲液中。
  8. 使用细胞计数仪和台盼蓝染色对细胞核进行计数；取5 µL细胞悬液加入50 µL 1× PBS中用于计数。此时细胞活力应极低（3%–4%）。若发现细胞活力偏高，请调整步骤5.3（裂解）的实验条件，并标准化裂解时间，以确保细胞充分裂解。
    注意：单细胞核制备中细胞活力过高，表明完整细胞数量多于预期，可能需要进一步消化处理。
  9. 按照制造商的操作指南，将样品以所需核密度加载至仪器/芯片上。此时单细胞核捕获已准备就绪。
    ​注意：通常从一只成年小鼠的SV组织可获得50 µL悬液，浓度约为150,000个细胞核/mL。

6. SV 单核测序

  1. 将样品送至测序核心平台进行测序。
    注意：本实验方案的此部分遵循以下通用步骤：（1）乳液中凝胶珠（GEM）的生成与条形码标记，（2）GEM逆转录后纯化及cDNA扩增，（3）3'端基因表达文库构建。单核测序（sNuc-Seq）方案的其余部分相对繁琐，建议读者参考相应仪器制造商提供的专用操作指南。制造商提供的操作手册通常包含具体步骤说明及配套图像，其官方网站上也可能提供“操作视频”。生成的数据集可采用降维方式呈现，例如均匀流形近似与投影（UMAP；图3）。许多实验室会利用测序核心平台代为完成本项操作。

7. SV 免疫染色与组织封片

  1. 如果组织将用于免疫染色，将其转移至24孔板中，浸入200 µL含4%多聚甲醛（PFA）的1x PBS溶液中，在室温下孵育20分钟。
    注意：建议在显微镜下进行所有液体移除、洗涤和免疫染色操作。在移液过程中观察组织可确保其不会在液体移除时意外丢失。只要液体体积足以完全浸没SV组织，抗体和洗涤液的体积可根据需要调整。
  2. 固定步骤完成后，在4 °C条件下，使用1x PBS（每孔约500 µL）在低速（30–50）RPM的旋转摇床上进行两次短暂洗涤，每次5分钟。如需储存，可将组织保存在4 °C的1x PBS中。
  3. 移除PBS，并在室温下用约300 µL PBS-T溶液（含0.05 Tween20的1x PBS，添加10%胎牛血清）对组织进行通透和封闭，时间不少于1小时。
    注意：一抗和二抗应使用此封闭液进行稀释。
  4. 根据所用一抗的具体说明进行组织染色，通常在4 °C孵育过夜。移除残留PBS后，加入稀释后的一抗。
    注意：稀释比例应依据生产商建议、已发表数据或既往经验等确定。通常初始测试浓度为1:100–200。本文示例中，GS-IB4和DAPI抗体均按1:200稀释。若需同时检测多个蛋白，可将多种一抗混合于同一溶液中，但需确保每种一抗来自不同宿主，以避免二抗交叉反应。
  5. 在低速RPM的旋转摇床上，用约500 µL 1x PBS洗涤组织两次，每次10分钟，以去除残留的一抗。
    注意：持续确保SV组织完全浸没于溶液中，避免其粘附在孔壁上。
  6. 根据所用二抗的具体说明进行染色，通常在室温下于低速RPM的旋转摇床上孵育2小时。用遮光材料覆盖24孔板，防止荧光标记的二抗暴露于光照下。
    注意：若需使用多种二抗，可将其混合于同一溶液中，但需注意避免交叉标记。
  7. 在低速RPM的旋转摇床上，用约500 µL 1x PBS洗涤组织四次，每次5分钟，以去除残留的二抗。保持24孔板处于遮光状态，防止荧光淬灭。
  8. 准备大号载玻片（75 mm × 25 mm），沿25 mm边轴方向涂抹两条细小胶线，胶线间距略小于18 mm × 18 mm的小型玻璃盖玻片。在两条胶线之间滴加一滴封片剂（约50 µL）。
    注意：胶线可提供微小的垂直空间，使放置上层盖玻片时，SV组织样本能安全容纳其中并保持固定位置。尽管血管纹厚度为30–40微米，但仍应避免将组织过度挤压于玻璃表面之间，以保持其形态完整性。也可使用透明胶带作为替代方案。
  9. 使用#55镊子，仅夹取SV一端的少量组织，将其从PBS转移至大号载玻片（75 mm × 25 mm）上的封片剂液滴中。将小型玻璃盖玻片（18 mm × 18 mm）一端置于已涂胶线的位置，缓慢释放，避免产生气泡。盖玻片将自然滑落至另一条胶线上，覆盖SV组织。
  10. 用透明指甲油在封片四周的每个角落轻点封固。在远离观察区域的盖玻片表面正确标记样本信息。此时样本已准备好用于共聚焦显微镜观察（图4）。
  11. 使用解剖显微镜观察SV组织，确保其平铺且远离气泡区域。若SV组织方向不正确，可尝试轻推排除气泡，或小心取下小型玻璃盖玻片后重新调整SV位置。操作时必须轻柔，避免损坏玻璃盖玻片。

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结果

我们介绍一种用于分离血管纹（SV）的方法，可用于单核测序（sNuc-Seq）或免疫染色。耳蜗相对于血管纹（SV）的相关解剖结构（图1）有助于用户更好地理解血管纹的组织结构以及解剖操作步骤。

该视频详细展示了从一只P30小鼠中进行SV显微解剖的每一步操作，图2则呈现了SV解剖与分离关键步骤的截图。

sNuc-Seq 可用于研究异质性 SV 中各类细胞的转录谱。一种可视化方法是在二维 UMAP 上进行聚类（图 3）。通过 sNuc-Seq 产生的数据集可采用多种数据分析技术进行评估，具体将在讨论部分进一步阐述。

SV 经 GS-IB4 和 DAPI 免疫标记以及 Kcnj10-ZsGreen 荧光标记后的整体封片结果如图4...

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讨论

在单细胞测序技术出现之前，许多研究人员采用组织整体分析方法，这种方法仅能对细胞群体的转录组进行平均化分析。而单细胞测序和单细胞核转录组测序（sNuc-Seq）则分别实现了对单个细胞或单个细胞核转录组的分离与分析32。在此基础上，可分别鉴定出边缘细胞、中间细胞、基底细胞以及梭形细胞的单细胞核转录组30。这使得研究人员能够探究螺旋韧带（SV）不同细胞类型之间的转录异质性，并可用于未来进一步研究这些细胞类型在SV功能中的作用，包括内电位（EP）的产生与维持。通过sNuc-Seq生成的数据集可通过降维方式呈现，以帮助理解整体转录差异，并利用UMAP图对不同细胞群体进行比较 图4。对sNuc-Seq数据集的生物信息学分析有多种方法，包括但不限于：差异表达分析、单细胞调控网络推断与聚类（SCENIC）、热图或网格小提琴图构建，以及调控子分析18。针对单细胞RNA测序的其他计算分析技术与sNuc-Seq类似，更多细节可参见Hwang等

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD）的院内研究计划资助，项目编号 DC000088，资助对象为 M.H.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10-µm 滤膜（聚对苯二甲酸乙二醇酯）PluriSelect#43-50010-01在 sNuc-Seq 过程中过滤组织
18 x 18 mm 盖玻片Fisher Scientific12-541A用于封片 SV 样本
30-µm 滤膜（聚对苯二甲酸乙二醇酯）PluriSelect#43-50030-03在 sNuc-Seq 过程中过滤组织
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorfrost Plus 显微载玻片DaiggerEF15978Z用于承载 SV 样本的载玻片
C57BL/6J 小鼠The Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664通用型小鼠品系，其色素在 SV 中间细胞中更易观察。
细胞计数仪Logos BiosystemsL20001用于细胞计数
Chalizon 刮匙 5''，3 号，2.5 mmBiomedical Research Instruments15-1020用于转移 SV
Chromium Next GEM 单细胞 3' GEM 试剂盒 v3.1ChromiumPN-1000141用于构建单细胞 3' 基因表达文库
透明指甲油Fisher ScientificNC1849418用于密封 SV 封片
Corning Falcon 标准组织培养皿，24 孔Corning08-772B解剖过程中用于盛放样本的培养皿
DAPIInvitrogenD1306, RRID: AB_2629482用于细胞核标记的染料
Dounce 匀浆器Sigma-AldrichD8938用于 sNuc-Seq 前组织匀浆
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11252-30通用解剖镊
Dumont #55 镊子Fine Science Tools11255-20尖端精细的镊子，便于操作 SV
胎牛血清ThermoFisher16000044用于 sNuc-Seq 的若干步骤
胶棒Fisher ScientificNC0691392用于固定 SV
GS-IB4 抗体Molecular ProbesI21411, RRID: AB-2314662用于毛细血管标记的抗体
KCNJ10-ZsGreen 转基因小鼠n/an/a表达 KCNJ10-ZsGreen 的转基因小鼠，尤其在 SV 的中间细胞中表达。
MgCl₂ThermoFisherAM9530G用于 sNuc-Seq 的若干步骤
封片剂ThermoFisher#S36940用于 SV 封片的试剂
24 孔多孔板Corning#353047用于免疫染色的板
NaClThermoFisherAAJ216183用于 sNuc-Seq 的若干步骤
Nonidet P40Sigma-Aldrich9-16-45-9用于 sNuc-Seq 的若干步骤
无核酸酶水ThermoFisher4387936用于 sNuc-Seq 的若干步骤
轨道摇床Silent ShakeSYC-2102A用于免疫染色步骤
PBSThermoFisherJ61196.AP用于免疫染色和解剖步骤
RNA LaterInvitrogenAM7021用于保存 SV 以进行 sNuc-Seq
剪刀Fine Science Tools14058-09用于剪开小鼠颅骨
Tris-HClSigma-Aldrich15506017用于 sNuc-Seq 的若干步骤
台盼蓝染液Gibco15250061用于细胞计数
Tween20ThermoFisherAAJ20605AP 用于 sNuc-Seq 的若干步骤
Zeiss STEMI SV 11 Apo 体视显微镜Zeissn/a用于解剖的显微镜

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成年小鼠血管纹组织的解剖用于单核测序或免疫染色
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