卵巢组织卵母细胞-体外 用于生育力保存的成熟化

摘要

此处展示的是卵巢组织卵母细胞-体外 成熟（OTO-IVM），一种在辅助生殖医学（MAR）实验室中可实现的技术，为需要卵巢组织冷冻保存的患者提供了切实可行的额外生育力保存选择。

摘要

成熟卵母细胞玻璃化冷冻是保护有不孕风险女性生育力的标准护理措施。然而，对于需要紧急开始性腺毒性治疗的女性或青春期前儿童，卵巢组织冷冻保存（OTC）仍是唯一可选择的生育力保存方法。在进行卵巢皮质冷冻保存前的组织制备过程中，需去除髓质组织。生长中的有腔卵泡位于卵巢皮质与髓质交界处，在此过程中常被破坏，从而释放出其周围的卵丘-卵母细胞复合体（COC）。通过仔细检查培养液及碎片化的髓质组织，可在不干扰OTC操作的前提下识别这些未成熟卵丘-卵母细胞复合体。来源于卵巢组织的未成熟卵母细胞可成功进行体外成熟 体外 为生育力保存创造额外的配子来源。如果在辅助生殖医学实验室内部或附近进行卵巢组织冷冻（OTC），则需具备所有必要的 体外 成熟（IVM）和卵母细胞玻璃化冷冻工具可随时备用。此外，在病情缓解并有生育意愿时，患者可通过多种方式恢复生育能力：卵巢组织移植，或对冷冻/解冻后的卵母细胞进行受精并实施胚胎移植。因此，卵巢组织中的卵母细胞——体外 成熟（OTO-IVM）可作为一种有价值的辅助生育力保存技术。

引言

对于计划接受性腺毒性治疗、性别重置治疗，或存在早发性卵巢功能衰竭遗传倾向的女性，其生育力保存（FP）方案的选择取决于患者的健康状况和年龄、可用时间窗、治疗类型、患者个人意愿以及所选生育中心可提供的生育力保存技术。在促性腺激素刺激卵巢后，于医学辅助生殖（MAR）实验室周期中获取成熟卵母细胞并进行取卵，随后采用玻璃化冷冻技术保存卵母细胞，被认为是生育力保存的首选方案^1,2。然而，对于青春期前女孩、需紧急开始性腺毒性治疗或性腺切除术的女性，或因性腺毒性治疗而存在永久性闭经高风险的女性，无法实施促性腺激素诱导的卵巢刺激周期，此时卵巢组织冷冻保存（OTC）是唯一可行的选择。OTC是一种已被认可且有效的生育力保存技术^1,2,3。OTC的目标是冷冻保存卵巢皮质组织中数千个处于静息状态的原始卵泡，待日后通过代表性组织片段的微小残留病灶仔细筛查后，将冻融的组织移植回残余卵巢或腹膜腔内，使这些卵泡恢复生长。

为了获得适合冷冻保存的1-2 mm厚皮质组织碎片，需要去除柔软的髓质组织。这种髓质组织通常包含处于不同发育阶段的生长卵泡，这些卵泡会从坚硬的卵巢皮质中延伸出来以支持其生长和扩张⁴。多年来，多个实验室一直在研究在卵巢皮质碎片制备后残留在髓质组织中的卵泡所回收的卵母细胞，通过体外成熟（in vitro maturation, IVM）技术进行发育潜能的探索^5,6,7，该技术被称为卵巢组织卵母细胞IVM（OTO-IVM）。腔前卵泡，即使直径小于6 mm，也包含被颗粒细胞包裹的未成熟卵母细胞，这些卵母细胞可通过IVM系统实现成熟、受精，并发育成健康的婴儿^8,9。IVM目前被视为有卵巢过度刺激综合征（OHSS）风险女性的标准治疗方法，例如多囊卵巢综合征（PCOS）患者。然而，在生育力保护（FP）领域，对于存在卵巢刺激禁忌症的患者，IVM的相关数据仍然有限；经阴道采集卵母细胞后的IVM仍被视为创新性技术，而OTO-IVM则被视为实验性技术^2,10。尽管如此，首例通过OTO-IVM成功获得活产的报道^11,12,13凸显了在患者因生育力保护需要进行卵巢组织冷冻（OTC）时，将OTO-IVM作为附加技术应用的潜力¹⁴。

本研究提供了在 MAR 实验室采用 OTO-IVM 的技术细节，并展示了单中心获得的结果。

方案

本项关于 OTO-IVM 的研究已获得布鲁塞尔大学医院（UZ-Brussels）当地伦理委员会的批准（项目 2008/068 及项目 2022/303 的补充文件）。所有患者均签署书面知情同意书。每位患者均由生殖医学专科医生、导航护士及转诊肿瘤科医生 individually 进行评估，以制定最佳的生育力保护（FP）治疗方案，并充分考虑患者的个人意愿¹⁴。简言之，符合卵巢组织冷冻（OTC）条件的患者需处于生育力保护的紧急需求状态，且年龄小于 36 岁¹⁴。若需将 OTC 与 OTO-IVM 联用，则在 OTC 前 6 个月内不得接受过化疗或放疗。

1. 实验室环境与人员

1. 在A级层流柜中进行卵巢组织处理（OTC）。
2. 由两名操作人员共同完成OTC操作：一名在层流柜内进行无菌操作，另一名使用具有杀菌和杀孢子作用的去污喷雾对所有非无菌物品进行清洁，并以无菌方式将材料和用品传递给第一位操作人员。卵巢皮质组织应在台面冷却盖（± 4 °C）上进行处理。
3. 在MAR实验室的另一台层流柜内，使用体视显微镜并在加热载物台（37 °C）上进行卵丘-卵母细胞复合体（COC）的搜寻。
4. 由第三名操作人员从髓质残留组织（第3和第4部分）中回收COC，并启动体外成熟（IVM）过程（第5部分）。

2. 培养基制备

注意：本实验步骤中使用五种培养基（详见下文）：OTC 处理液、OTC 冷冻液、Search 培养基、LAG 培养基和 IVM 培养基。配制培养基时，须在超净工作台内无菌操作，具体步骤见第 1 部分。每次实验均应使用全新未开封的试剂，并确保所有一次性耗材的无菌状态，以保证所配制培养基的无菌性。

1. 卵巢组织处理液
   1. 在Leibovitz's L15培养基中添加4 mg/mL人血清白蛋白（HSA）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（参见材料表）。
   2. 将卵巢组织处理液冷藏保存至使用前（最多保存2天）。
      注意：使用卵巢组织处理液冲洗和处理卵巢组织时，应保持低温（0–4 °C）。
2. 卵巢组织冷冻保存液
   1. 在Leibovitz's L15培养基中添加1.5 M二甲基亚砜（DMSO）和4 mg/mL HSA。
   2. 将卵巢组织冷冻保存液冷藏保存至使用前（最多保存2天）。
3. 搜寻液
   注意：搜寻液（一种用于卵母细胞操作的HEPES缓冲液）为市售产品（参见材料表），可直接使用。在从髓质碎片中搜寻卵丘-卵母细胞复合体（COC）的过程中，使用搜寻液冲洗滤膜并收集COC。
   1. 将6 mL搜寻液分别加入6个14 mL无菌圆底试管中。
   2. 在4孔培养皿中每孔加入500 µL搜寻液，并覆盖350 µL油相（参见材料表）。
   3. 在卵巢组织送达前至少1小时，将试管和4孔培养皿置于37 °C环境中预热。HEPES缓冲液无需CO₂培养环境。
4. LAG培养基
   注意：市售的体外成熟（IVM）系统（参见材料表）包含两种不同的培养基：LAG培养基和IVM培养基，其中IVM培养基需按以下说明进行添加。LAG培养基用于冲洗COC，也可根据IVM系统说明书建议，在转入IVM培养基前对COC进行2–3小时的预孵育。
   1. 使用市售的即用型LAG培养基（参见材料表）。
5. IVM培养基
   1. 在市售的IVM培养基中添加10 mg/mL HSA、75 mIU/mL卵泡刺激素（FSH）和100 mIU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
   2. 准备一个4孔培养皿，其中1孔加入LAG培养基，其余3孔加入添加成分后的IVM培养基：每孔500 µL培养基，并覆盖350 µL油相。
   3. 将培养皿置于37 °C、6% CO₂和20% O₂的培养箱中过夜平衡， 此为IVM培养的最佳环境。

3. 卵巢皮质制备

注意：腹腔镜全卵巢切除术的操作步骤参照 Jadoul 等人¹⁵所述方法进行。

1. 卵巢到达实验室后，将卵巢转移至含有OTC处理液（步骤2.1）的100 mm培养皿中，用OTC处理液清洗两次。
2. 使用手术刀沿纵向将卵巢切成两半（图1A）。
3. 用新的手术刀在髓质组织上垂直和水平方向进行多次切口，避免损伤皮质。轻轻刺破髓质中不同大小的坚实腔状卵泡，使卵泡液释放到OTC处理液中。
4. 使用手术剪修剪软化的髓质组织（图1B）。此操作可能需要数分钟。
5. 在修整过程中，将卵巢外壳置于盛有新鲜OTC处理液的新培养皿中。
6. 将含有髓质碎片和释放出的卵泡液的培养皿（图1C）转移至第二个生物安全柜，开始搜寻卵冠丘复合体（COCs）。
7. 重复步骤3.4至3.6，直至获得所需厚度（1–2 mm）的皮质组织。
8. 将皮质组织切成约8 mm × 5 mm的小片。
9. 将组织片在约25 mL OTC冷冻液（步骤2.2）中，于100 mm培养皿内连续孵育3次，每次10分钟。
10. 将一片组织放入含有800 µL OTC冷冻液的冻存管中。
11. 使用程序性慢速冷冻法在由温度控制器调控的冷冻室中进行卵巢组织冷冻保存（见材料表）：从4 °C以-2 °C/min降温至-7 °C，在-7 °C时手动植冰，再以-0.3 °C/min从-7 °C降温至-40 °C，随后以-10 °C/min从-40 °C降温至-100 °C，达到-100 °C后即将冻存管投入液氮中长期保存。

4. 搜索卵丘-卵母细胞复合体（COCs）

1. 准备层流柜以进行卵母细胞-卵丘复合体（COC）的搜寻。
   1. 在层流柜内的体视显微镜加热台上预热60 mm培养皿。
   2. 将装有6 mL预热搜寻培养基（步骤2.3.1）的14 mL离心管放入加热块中，并将预热的含搜寻培养基的4孔培养皿置于层流柜内显微镜下的加热台上。
   3. 将无菌滤膜（细胞筛，70 µm孔径；见材料表）底部朝下放置于培养皿中。
   4. 取一根290–310 µm的玻璃毛细管备用：切勿使用小于290–310 µm的毛细管，以免损伤卵母细胞与卵丘细胞之间的连接。
   5. 确保已备好1 mL带滤芯吸头和1 mL移液器。
2. 从OTC层流柜（4 °C）中取出第一皿髓质碎片，并尽快将其转移至IVM层流柜的加热台（37 °C）上。
   注：第一皿髓质碎片及卵泡液可能被排卵后充血卵泡或卵巢自身血管中的血液污染。红细胞会模糊视野，增加COC搜寻难度。必须去除受污染的培养基以清除红细胞（见步骤4.3）。
3. 按以下步骤去除红细胞污染。
   1. 用移液器将2 mL搜寻培养基缓慢加至滤膜（70 µm细胞筛）上以润湿膜面，将收集到培养基的培养皿暂置于加热台上。
   2. 将滤膜翻转倒置，使其手柄紧贴新培养皿边缘，使滤膜底部形成倾斜坡面。
   3. 用1 mL吸头吸取髓质碎片间的含血细胞污染培养基，轻柔吹过滤膜（图1D），以截留其中可能存在的COC。
   4. 重复步骤4.3.3，直至大部分含血污染培养基被清除。
   5. 立即向髓质碎片中加入新鲜搜寻培养基，确保COC始终悬浮于培养液中。
   6. 用2 mL搜寻培养基轻轻冲洗倾斜的滤膜，去除附着在膜上的红细胞。
   7. 将滤膜底部朝下放入新的培养皿中，加入3–4 mL搜寻培养基，使滞留在滤膜上的COC被冲入培养皿液体中。随后移除滤膜。为防止滤膜干燥（以及尚未完全释放的COC受损），立即将该滤膜底部朝下浸入最初用于润湿滤膜的培养皿中。
   8. 立即在体视显微镜（放大倍数10x–50x）下肉眼检查冲出的液体中是否存在COC。寻找具有清晰透明卵母细胞及周围一圈深色致密卵丘细胞的结构（图1E）。轻轻旋转培养皿中的液体，再次检查。
   9. 在另一新培养皿中对滤膜进行第二次冲洗，并检查冲出液中是否有COC。
   10. 检查滤膜所浸泡的培养皿中的液体，查找残留的COC。
   11. 使用玻璃毛细管将COC转移至含有搜寻培养基的4孔培养皿中（图1E）。所有操作过程中，培养皿应始终置于加热台上。
4. 在去除髓质碎片培养皿中的血液污染物并更换为澄清搜寻培养基后，仔细搜寻髓质碎片间是否存在COC。使用玻璃毛细管移动碎片并搅动培养液以助发现COC。若怀疑大块髓质碎片内含有卵母细胞，可用1 mL注射器连接结核菌针头将其小心分离。
5. 将所有完整COC收集至含搜寻培养基的4孔培养皿中。
   ​注：在典型的OTC操作中，皮质组织通过连续三个100 mm培养皿从髓质剥离，每次将卵巢外壳转移至含新鲜培养基的新皿中，残留物则送入IVM层流柜进行COC搜寻。通常仅第一皿需要去除红细胞；第二和第三皿中髓质碎片较少，可直接在碎片间及培养基中进行COC搜寻。

5. COCs 的体外成熟

1. 用洗涤培养基将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在洁净的孔中冲洗。
2. 将预平衡的体外成熟（IVM）培养皿（含一孔LAG培养基和三孔IVM培养基的4孔板）从培养箱转移至IVM操作柜内的加热载物台上。
3. 在含有COCs的IVM培养皿上标记患者信息。
4. 将COCs在LAG培养基中冲洗（2–3秒），然后放入三个加有补充成分的IVM培养基孔之一。每孔约10个COCs为一组进行培养。请剔除裸卵母细胞（即无附着卵丘细胞的卵母细胞），因其发育潜能显著受损。
5. 将培养皿置于37 °C、6% CO₂ 和20% O₂ 的培养箱中培养30小时。

6. 成熟卵母细胞的处理

1. 在体外成熟（IVM）30小时后，通过短时间暴露于80 IU透明质酸酶（见材料表）并辅以轻柔的机械吹打，去除卵母细胞周围的卵丘细胞。
2. 通过观察第一极体的排出情况来鉴定成熟的卵母细胞。
3. 根据患者的意愿，对成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻或受精。
   注意：若IVM 30小时后的成熟度检查时间超出正常工作时间范围，可将IVM时间缩短至28小时或延长至42小时。若在30小时后仅获得少量成熟卵母细胞，可将未成熟卵母细胞在去除卵丘细胞后的原IVM孔中继续培养过夜，并于次日早晨对已成熟的卵母细胞进行玻璃化冷冻或卵胞浆内单精子注射（ICSI）。

结果

在过去十年中，98名因卵巢组织冻存（OTC）而接受卵巢切除术或卵巢活检的患者同时接受了体外成熟卵母细胞冷冻（OTO-IVM）。本文所呈现的结果是对此前已发表的临床项目的更新。^7,13在卵巢组织处理过程中获得的未成熟卵母细胞进行了体外成熟 体外 主要培养30小时。然而，出于实际考虑或因成熟率较低，允许更灵活的成熟时间，范围为28至42小时。患者主要选择卵母细胞玻璃化冷冻（85/98）；或应患者特别要求，将成熟卵母细胞受精后形成胚胎并进行胚胎玻璃化冷冻（13/98）。在98例年龄介于1至38岁的患者中，共收集到1,417枚卵母细胞，这些患者均接受了OTC联合OTO-IVM治疗。卵母细胞平均成熟率为40% ± 22%（均值 ± 标准差）。青春期前女孩的平均成熟率低于青春期后女性（分别为26% vs. 42%）； 表1对于94/98例患者发现了未成熟卵母细胞，其中86/94例患者在体外成熟（OTO-IVM）后至少获得一枚减数分裂中期II（MII）卵母细胞，表明在88%的卵巢组织...

讨论

FP 操作的首要原则始终是依据已在临床验证的标准操作规程对卵巢皮质进行处理和冷冻。FP 的一个不足之处在于，目前发表的文献中尚无关于 OTC 和 OTO-IVM 的标准化操作流程。由于在临床实践中，冷冻/玻璃化与解冻/复温之间存在较长的时间间隔，因此很难评估这些技术及其改进方法的效率与有效性。若对 OTC 操作流程进行修改以提高 OTO-IVM 的效率，则必须对修改后的 OTC 流程在组织冷冻保存及解冻后的组织健康状况方面进行验证。本报告所述的 OTC 操作流程为布鲁塞尔 VUB 大学医院布鲁塞尔 IVF 中心常规使用的方法，该流程规定使用剪刀去除卵巢皮质中的髓质组织。在此过程中，髓质组织被系统性地剪切成小片段，从而释放出 COCs。其他实验室则使用手术刀处理卵巢皮质，将大部分髓质组织从皮质壳中刮除。在此类方法中，需进一步切割较大的髓质组织块以释放 COCs。当卵巢送抵实验室后，禁止用针头穿刺肉眼可见的大型窦状卵泡，因为此类穿刺会损伤卵巢皮质。其次，从卵巢的大型窦状卵泡中抽吸 COCs 的收获率 离体 较低。

如果将卵巢组织从当地医院转运至专业中心进行组织冷冻保存...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1000 µL 滤芯吸头	Eppendorf/VWR International	613-6780	用于寻找卵丘-卵母细胞复合体（COC）
台式冷却器	Fisher Scientific	15-350-54	台式冷却器盖用于组织制备，台式冷却器管架用于保持含冷冻液的冻存管处于低温状态
Corning 细胞培养皿，未处理，100 mm	Corning/VWR International	430591	用于卵巢组织制备的培养皿
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	卵巢组织冷冻保存用冷冻保护剂
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	重组人透明质酸酶，用于体外成熟（IVM）后去除卵丘细胞
去污喷雾剂：Suprox	Medipure LTD	MP016	用于无菌操作的消毒液，具有杀菌和杀孢子作用
一次性手术刀片	Swann-Morton	0511	用于卵巢组织制备
Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖，无菌	Falcon/VWR International	BDAA352057	中等容量容器
Falcon 细胞筛，70 µm	Falcon/VWR International	352350	用于去除红细胞污染及寻找卵丘-卵母细胞复合体（COC）
冻存控制安瓿瓶冷冻室及温度控制器	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	程序降温冷冻仪
FSH：Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	卵泡刺激素：体外成熟（IVM）培养基的添加成分
操作移液管，290–310 µm	Vitrolife	15538	用于寻找卵丘-卵母细胞复合体（COC）：轻柔转移COC，避免损伤卵母细胞与卵丘细胞之间的连接
hCG：Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	人绒毛膜促性腺激素：体外成熟（IVM）培养基的添加成分
高安全性冻存管	CryoBioSystem	022252	热封式冻存管，用于安全的低温保存
HSA溶液	Vitrolife	10064	人血清白蛋白：体外成熟（IVM）培养基的添加成分
Leibovitz's L-15 培养基	Life Technologies Europe	31415-029	用于卵巢组织制备的操作培养基
MediCult IVM 系统	Origio/CooperSurgical	82214010	包含LAG和IVM培养基的体外成熟培养系统。IVM培养基需按方案说明进行补充
METZENBAUM 细尖剪刀，140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	中号剪刀，用于初步去除髓质
Nunc 4孔IVF培养皿	Nunc/VWR International	144444	用于卵丘-卵母细胞复合体（COC）搜寻及体外成熟（IVM）培养过程中的收集
Nunc 体外受精培养皿，带通气盖，60 mm，无热原，无菌	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	用于卵丘-卵母细胞复合体（COC）搜寻的培养皿
卵母细胞操作培养基：含肝素的冲洗液	Origio/CooperSurgical	10765060	用于卵丘-卵母细胞复合体（COC）搜寻的搜索培养基
Ovoil	Vitrolife	10029	用于体外成熟（IVM）培养的油相覆盖液
青霉素/链霉素混合液	Life Technologies Europe	15140-148	卵巢组织操作培养基的添加成分
弯头剪刀，150 mm长，刀刃20 mm	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	小型剪刀，用于去除残余髓质