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方法文章

基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

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DOI：

10.3791/65257

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2023年5月12日

 ,  , 
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了几种常用的研究质膜受体激酶膜运输事件的方法。文稿中描述了详细的实验方案，包括植物材料准备、药物处理以及共聚焦成像设置。

摘要

在真核细胞中，包括蛋白质和脂质在内的膜组分通过内膜系统在时空上被运输至其目的地。这包括将新合成的蛋白质通过分泌途径运输至细胞表面或细胞外，将胞外货物或质膜组分通过内吞作用运入细胞，以及在亚细胞器之间进行货物的循环或穿梭运输等。膜运输事件对于所有真核细胞的发育、生长及环境适应至关重要，因此受到严格调控。定位于细胞表面的受体激酶可感知来自细胞外空间的配体信号，并经历分泌和内吞运输过程。本文介绍了一种利用定位于质膜的富含亮氨酸重复序列受体激酶ERL1来研究膜运输事件的常用方法。该方法包括植物材料准备、药物处理以及共聚焦显微镜成像设置。为了监测ERL1的时空调控，本研究描述了ERL1与多泡体标记蛋白RFP-Ara7之间的共定位分析、这两种蛋白的时间序列分析，以及用膜运输抑制剂布雷菲德林A（brefeldin A）和渥曼青霉素（wortmannin）处理后的ERL1-YFP的z轴层扫分析。

引言

膜运输是一种保守的细胞过程，可在真核细胞内的不同细胞器之间，或通过质膜在细胞内外空间之间分配膜组分（也称为货物），包括蛋白质、脂质及其他生物产物1。该过程由一组被称为内膜系统的膜结构和细胞器所介导，内膜系统包括核膜、内质网、高尔基体、液泡/溶酶体、质膜以及多种内体1。内膜系统利用在这些细胞器之间穿梭的动态囊泡，实现膜组分的修饰、包装和运输。膜运输事件对细胞发育、生长及环境适应至关重要，因此受到严格而复杂的调控2。目前，分子生物学、化学生物学、显微镜技术和质谱技术等多种方法已被开发并应用于膜运输研究领域，极大地推动了对内膜系统时空调控机制的理解3,4。分子生物学常用于对参与膜运输的潜在因子进行经典的遗传操作，例如改变目标蛋白的基因表达，或用特定标签标记目标蛋白。化学生物学工具则包括使用能够特异性干扰特定运输通路的小分子化合物4,5。质谱技术在鉴定通过生化方法机械分离所得细胞器中的组分方面具有强大优势3,4。然而，膜运输是一个动态、多样且复杂的生物学过程1。为了在各种条件下可视化活细胞中的膜运输过程，光学显微镜是一项不可或缺的工具。近年来，先进的显微镜技术不断进步，以应对测量运输事件效率、动力学特征和多样性的挑战4。本研究聚焦于化学/药理学生物学、分子生物学和显微镜技术中广泛采用的方法，用于在一个天然简化且实验上易于操作的系统——气孔发育过程中研究膜运输事件。

气孔是植物地上表面的微小孔隙，通过开闭调节内部细胞与环境之间的气体交换6,7,8。因此，气孔对光合作用和蒸腾作用至关重要，而这两种过程对植物的生存与生长具有关键作用。气孔的发育会根据环境信号动态调整，以优化植物对周围环境的适应能力9。自2002年的研究以来，受体蛋白“过多气孔”（Too Many Mouths, TMM）的发现开启了研究模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔发育分子机制的新时代10。在短短几十年内，已鉴定出一条经典的信号通路。从上游到下游，该通路包括一组表皮模式形成因子（epidermal patterning factors, EFP）家族的分泌型多肽配体、多个ERECTA（ER）家族的细胞表面富含亮氨酸重复序列（leucine-rich-repeat, LRR）受体激酶、LRR受体蛋白TMM、一条MAPK级联通路，以及包括SPEECHLESS（SPCH）、MUTE、FAMA和SCREAM（SCRM）在内的多个bHLH转录因子11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。先前的研究表明，其中一个受体激酶ER-LIKE 1（ERL1）在感知EPF配体后表现出活跃的亚细胞行为20。ERL2也在质膜与某些细胞内细胞器之间动态转运27。阻断膜转运过程会导致气孔排列异常，从而在叶片表面形成气孔簇28。这些结果表明，膜 trafficking 在气孔发育过程中发挥着重要作用。本研究描述了一种结合蛋白质-蛋白质亚细胞共定位分析与药理学处理（使用若干膜转运抑制剂）的方法，用于在时空维度上研究ERL1的动态变化。

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方案

1. 溶液的配制

  1. 通过将15 mL次氯酸钠溶液与35 mL蒸馏水和50 µL吐温X-100混合，制备种子消毒溶液。
  2. 通过将BFA粉末溶于乙醇中至终浓度为10 mM（储存液），制备布雷菲尔德菌素A（BFA）溶液。通过将Wm粉末溶于DMSO中至终浓度为10 mM（储存液），制备渥曼青霉素（Wm）溶液。

2. 播种

  1. 从所需的每种转基因植株中取出10-50粒种子，分装至1.5 mL离心管中。每管加入1 mL种子消毒液，在摇床中轻轻倒置混匀10分钟。
  2. 弃去种子消毒液，用1 mL无菌蒸馏水清洗种子，重复洗涤五次。
  3. 每管中加入300 µL无菌蒸馏水，将种子播种于含1%（w/v）蔗糖和0.75%（w/v）琼脂的半倍MS培养基上。根据需要在培养基中添加相应的抗生素。
  4. 将培养皿倒置，于4 °C避光条件下放置2天，以同步萌发。
  5. 2天后，将培养皿转移至培养室中，培养条件为22 °C、16小时光照/8小时黑暗光周期（光照强度80 µmol/m2/s1）。此时间点记为萌发后第一天（1 dpg）。
  6. 在萌发后第10天（10 dpg）将幼苗移栽至土壤中，继续生长。

3. 双色荧光F1转基因植株的制备

  1. 在生长室中，将携带ERL1-YFP的纯合转基因植株（植株A）与携带RFP标记蛋白RFP-Ara7的纯合转基因植株（植株B）20并排培养，培养条件为16小时光照/8小时黑暗循环（光照强度80 µmol/m2/s1），温度22 °C，直至开花。
  2. 从植株A上选择一个幼嫩的花序，保留花序上一朵即将开放的花用于遗传杂交，去除所有较老的花和角果。同时，仔细去除更年轻的花及花分生组织，以避免后续混淆。
  3. 使用一对尖头镊子轻轻解剖未开放的花，去除萼片、花瓣和雄蕊，仅保留花序上的雌蕊。
  4. 取植株B上已开放花朵中的成熟雄蕊，将花粉粒涂抹到植株A中已解剖雌蕊的柱头上。
  5. 对人工杂交的花进行标记，注明父本、母本及遗传杂交日期。让花朵自然发育，待角果变黄/褐色时（约杂交后20天）收获F1代种子。检测获得的F1植株是否同时具有YFP和RFP信号，以确认杂交成功。

4. 药理学治疗

  1. 进行BFA处理时，取7日龄幼苗去除子叶，将剩余幼苗浸入模拟溶液（0.3%乙醇）或30 µM BFA溶液中，施加真空1分钟，并在成像前保持样品浸没30分钟。
  2. 进行渥曼青霉素处理时，取7日龄幼苗去除子叶，将剩余幼苗浸入0.25% DMSO溶液或25 mM渥曼青霉素溶液中，施加真空1分钟，并在成像前保持样品浸没30分钟。
  3. 对样品进行真空处理时，在1.5 mL微量离心管中加入500 µL相应药物溶液，将解剖后的幼苗浸入溶液中。将10 mL注射器紧密连接至微量离心管，施加真空1分钟（图1）。移除注射器，将样品在溶液中静置所需时间。轻柔取出幼苗进行成像前准备。

注射器，用于精确液体测量的实验室设备，常用于色谱系统。
图 1：简易真空装置。 将一个 10 mL 注射器连接至一个 1.5 mL 微量离心管，用于真空处理。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 成像样本的制备

  1. 使用锋利的剃须刀片从处理后的样品中分离出真叶。将真叶轻轻放入载玻片上的水滴中，并使叶片的远轴面朝上。缓慢盖上盖玻片，注意避免产生气泡。

6. 共聚焦成像

注意：本研究中使用徕卡 SP8 倒置扫描共聚焦显微镜对样品的荧光信号进行成像。

  1. 光路设置
    1. 选择514 nm激光用于YFP激发。使用高激光功率可增强信号强度，从而获得高质量图像。然而，激光功率超过5%时存在光漂白风险，可能影响样品活性。若样品信号并非过弱，建议从低激光强度开始。
    2. 开启PMT/HyD用于信号检测，并根据YFP荧光团的发射光谱设定发射波段的上下限阈值。设置530–570 nm的检测窗口以采集YFP信号。
    3. 第二通道的顺序成像：点击Seq按钮，添加新通道。默认情况下，先前设计的YFP光路为Seq 1。在Seq 2中，选择561 nm激光用于RFP激发，并设置570–630 nm的检测窗口以采集RFP信号。
  2. 扫描条件设置（图2）
    1. 为观察气孔前体细胞内的亚细胞膜运输活动，选择系统中的63x/1.2 W Corr物镜进行成像。
    2. 格式指图像的像素尺寸。建议从1,024像素 × 1,024像素开始，再根据缩放倍数和物镜设置优化，以达到适合发表的分辨率。
    3. 速度指激光扫描每个像素时扫描头的移动速度。尽管较慢的扫描速度通常能获得更高的信噪比，但可能无法有效捕捉快速变化的膜运输过程。建议从400 Hz开始，再根据样品具体情况优化。
    4. 缩放倍数用于在不更换物镜的情况下放大特定区域。建议从1倍开始，再根据实验具体需求进行优化。
    5. 线平均指对每条X方向扫描线重复扫描的次数，以获得平均结果。较高的线平均可降低图像噪声，但也会增加扫描时间和激光曝光时间。为成像膜运输事件，不宜使用过高的线平均。建议从2倍线平均开始，按需优化。
  3. 采集时间序列
    注意：研究膜运输过程时，通常需要采集时间序列以记录亚细胞内体的快速运动。
    1. 在采集模式中，选择xyt扫描模式以启用时间序列功能。
    2. 在时间间隔下设定各时间点之间的等待时间。也可点击最小化以实现图像的连续快速采集。后续时间序列实验中采用了7秒的时间间隔。
    3. 选择持续时间，并输入实验总时长。也可通过选择帧数来设定需采集的图像帧数（图3）。
  4. 为获取细胞内膜运输事件的三维信息，使用Z-stack扫描模式。Z-stack图像的最大强度投影常用于后续分析。
    1. 在采集模式中选择xyz扫描模式，Z-Stack功能将随之启用。
    2. 选择Z-wide选项。在扫描模式下，使用开始和结束按钮定义Z-stack的顶部与底部图像位置。
    3. 通过点击z-step size设定Z轴步长厚度。也可设定为覆盖整个Z-stack范围所需的图像数量。为确保样品间的一致性，建议设定固定的z-step大小（图4）。
  5. 图像处理
    1. Z-stack图像的最大强度投影由共聚焦软件（http://www.leica-microsystems.com）生成。在主处理选项卡中，首先在最左侧的打开项目选项下选择目标Z-stack文件。随后切换至中间名为处理工具的选项卡，选择投影功能，在方法下拉面板中选择最大值，然后点击应用按钮。生成的Z-stack投影图像将出现在“打开项目”选项卡下。
    2. 时间序列图像的视频由Fiji软件（https://imagej.net/Fiji）生成。在文件选项卡中，使用打开功能按正确顺序导入所有时间序列图像。在图像选项卡中，找到堆栈功能，选择图像合成为堆栈以生成视频。以.avi格式保存文件，并设定所需帧率（视频1采用5帧/秒）。

共聚焦显微镜设置面板；XYZ采集，1024x1024格式，18.646 μm光学切片。
图2：XY维度的扫描模式面板。 扫描模式面板用于设置图像扫描条件。 请点击此处查看该图的放大版本。

延时记录设置，视频采集软件中的时间间隔配置界面。
图3：在xyt扫描模式下的时间序列功能。 时间序列功能用于设置成像条件，以连续采集一系列图像。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜的Z层扫描界面，展示Z轴位置控制和优化设置。
图 4：在xyz扫描模式下的z层扫描功能。 z层扫描功能用于设置成像条件，以在z轴上采集一系列图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

先前的研究表明，ERL1 是一种具有活性的受体激酶，可发生动态的膜运输事件20。ERL1 是定位于质膜上的跨膜LRR受体激酶。在内质网中新合成的 ERL1 会在高尔基体中进行加工，随后被进一步转运至质膜。质膜上的 ERL1 分子可通过其胞外 LRR 结构域感知 EPF 配体18。当被抑制性 EPF（包括 EPF1）激活后，ERL1 会从质膜内化进入内体，转运至多泡体（MVB），再进入液泡中降解，从而终止信号20。相反，具有拮抗作用的 EPFL9 配体可促进气孔形成14，并使 ERL1 滞留在内质网中。此外，定位于质膜的 ERL1 也可在内体与质膜之间循环往返20。

在此实验中，将携带ERL1启动子::ERL1-YFP的转基因植株按照上述方案培养7天。当真叶刚刚开始发育时，将其分离用于成像观察，因为ERL1仅在幼...

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讨论

内膜系统将真核细胞的细胞质分隔成不同的区室，从而使这些细胞器能够执行特化的生物学功能。为了在正确的时间将货物蛋白和大分子运送到其最终目的地，大量囊泡被引导在这些细胞器之间穿梭运输。高度调控的膜 trafficking 事件在细胞的存活、发育和生长过程中发挥着基础性作用。然而，调控这一关键而复杂过程的机制目前仍知之甚少。

本文介绍了多种用于观察膜蛋白亚细胞定位的方法，分析用不同荧光蛋白标记的两种膜蛋白之间的共定位，利用时间序列图像监测膜蛋白的动态移动，以及通过覆盖整个细胞的z轴层扫描成像获取膜蛋白的三维信息。除了文中所述的膜运输事件外，这些方法还可轻松应用于其他生物学过程。例如，可通过长时间（数天）的时间序列成像来监测发育过程30；通过z轴层扫描成像定量细胞内蛋白质的丰度30。此外，这些成像方法可与药理学手段完美结合，包括各种药物、激素甚至环境信号，表明这些成像技术易于应用于活体生物样本。除了样本处理具有灵活性外，本文所述方法仅需经济实惠的设备（共聚焦显微镜除外），并对操作人员的技术培训要...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国家科学基金会（IOS-2217757）（X.Q.）和阿肯色大学医学科学分校（UAMS）Bronson基金会奖（H.Z.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 注射器VWRBD309695真空样品
布雷菲德菌素A（BFA）SigmaB7651膜运输药物
共聚焦显微镜LeicaLeica SP8 TCS 激光共聚焦显微镜系统，配备 LAS X 软件包成像
解剖镊VWR82027-402遗传杂交
Fiji美国国立卫生研究院https://imagej.net/Fiji图像处理
Leica LAS AF 软件Leicahttp://www.leica-microsystems.com图像处理
ERL1-YFP 转基因种子Qi, X. 等信号肽对受体亚细胞动态的多重作用决定了气孔细胞的命运。Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020)。
RFP-Ara7 转基因种子Ebine, K. 等. 由植物特异性 RAB GTPase ARA6 调控的膜运输途径. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
渥曼青霉素（Wm）SigmaW1628膜运输药物

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