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使用微尺度屏障组织平台（MicroSiM, µSiM）构建血脑屏障模型

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DOI：

10.3791/65258

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2024年1月12日

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1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology

本文内容

摘要

本报告提供了在 µSiM 平台上组装、细胞培养及进行检测的方案，用于构建血脑屏障模型。

摘要

微尺度硅膜（µSiM）是一种基于膜的培养平台，用于构建血脑屏障（BBB）模型。与传统的基于膜的平台不同， µSiM 为实验人员提供了新的功能，包括活细胞成像、在“血液”和“脑”腔室之间无阻碍的旁分泌信号传递，以及无需提取或重新装片即可直接进行免疫荧光成像的能力。本文展示了该平台的基本使用方法，利用超薄纳米孔氮化硅膜建立血脑屏障的单细胞培养（内皮细胞）和共培养（内皮细胞与周细胞）模型。我们验证了该平台与原代细胞培养和人诱导多能干细胞（hiPSC）培养的兼容性。我们提供了通过免疫荧光染色对血脑屏障模型进行定性分析的方法，并展示了利用 µSiM 平台在小分子通透性实验中定量评估屏障功能的应用。所提供的方法可帮助用户在该平台上成功构建其屏障模型，推动组织芯片技术在人类组织研究中的应用。

引言

活体组织由特化细胞分隔成不同区室，这些细胞形成并维持屏障，调控细胞和分子在各区室间的转运。屏障功能调节异常可能是多种急性病症和慢性疾病的根源。血脑屏障（BBB）是人体中最严格的组织屏障。1血脑屏障功能障碍是多种中枢神经系统（CNS）疾病的基础，包括阿尔茨海默病2，帕金森病3,4，以及多发性硬化症5,6血脑屏障（BBB）损伤也与脓毒症等急性疾病后出现的长期认知功能障碍相关。7，COVID-198，以及术后谵妄9由于难以有目的地突破血脑屏障以将生物活性分子递送至大脑内的靶点，开发具有治疗脑部疾病潜力的药物一直面临令人沮丧的困难。10因此，研究血脑屏障功能的方法 体外 对理解与治疗中枢神经系统疾病至关重要。

测量屏障功能的基本方法 体外 涉及在半透膜上建立单层细胞或共培养体系，并测量细胞对小分子扩散或微小电流的阻抗11,12,13,14尽管微生理系统（MPS）的出现为三维建模血脑屏障（BBB）提供了大量选择15,16，系统几何结构的多样性使得不同微生理系统（MPS）之间的通透性测量结果难以相互比较，也难以与已建立的文献数值进行对照。在血脑屏障（BBB）研究中，由于脑血管内皮细胞对屏障功能具有广泛的调控作用，建立可靠的基准值尤为关键。 体外 通透性数值受到严格审查12,17,18因此，建立在二维膜上的单层细胞通透性测量将在未来数年内继续成为血脑屏障研究中的常规方法。这一方法同样适用于其他组织屏障，包括上皮屏障，其中基础通透性的绝对值被用于验证和比较 体外 模型19,20,21.

旨在为血脑屏障研究领域建立一种有价值的新型工具，我们已引入22 和高级的23,24,25,26 的 微具有以下特征的装置 silicon m过去5年中，用于屏障组织建模的微膜（µSiM）平台。该平台的关键特性在于其超薄（<厚度为100 nm、含有数亿个纳米孔的膜27,28 或纳米孔与微米孔的混合结构29自由-standing 膜芯片是在一片 300 µm 厚的硅“芯片”上制备而成，用于稳定这些超薄结构。30 并可使用镊子进行操作以组装器件。由于其超薄特性，这些膜的通透性比商用膜培养装置中常用的径迹蚀刻膜高出两个数量级。31,32在实际应用中，这意味着膜对小于纳米孔的分子的扩散具有阻碍作用（<60 nm）可忽略不计33因此，对于细胞屏障而言，只有细胞及其分泌的基质决定了小分子通过膜分隔的顶端与基底腔室之间转运的速率。34该装置的设计以及膜的超薄特性还为光学显微镜观察提供了诸多优势，包括：1）可利用相差或明场成像技术对活细胞培养过程进行实时观察；2）可对样品进行荧光染色并成像 原位 无需将膜提取并转移至盖玻片，以及3）膜的厚度薄于共聚焦显微镜的“切片”，因此直接共培养中不同细胞类型之间的间距比使用6-10 µm厚的径迹蚀刻膜更接近自然状态。

最近，我们将该平台改进为模块化形式，以促进快速组装34和定制化35,36。我们利用模块化设计，在我们的生物工程实验室与合作的脑屏障实验室之间分发装置组件，随后共同开发了装置组装、单细胞培养与共培养、免疫荧光染色、小分子通透性等实验方案，并证明这些方法在不同实验室之间具有可重复性。基于这些方案，我们还证实该模块化平台可支持采用扩展内皮细胞培养法（EECM）建立的经验证的血脑屏障模型，该方法可由人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成类脑微血管内皮细胞（BMEC）37。本报告旨在更详细地综述这些方法，并结合随附视频，推动该平台在血脑屏障研究领域更广泛的应用 。

方案

1. µSiM 装置组装

注意：本方法描述了装置的组装过程。膜芯片具有沟槽面和平整面，可将沟槽面朝上或朝下进行组装。在细胞培养中，通常使用沟槽面朝下的装置。

  1. 在无菌环境（即生物安全柜）中，准备好组装所需的所有材料，包括组装夹具、组件、膜芯片和镊子。
  2. 使用芯片镊子将膜芯片放置在夹具A1的中央。对于沟道向下的器件，芯片的平面朝下，沟道区域朝上， 反之亦然 用于沟道向上型器件。
    注：以下组装步骤以沟槽朝下的装置为例进行说明，该装置可在上腔室中提供一个平坦的生长区域。
  3. 将组件1粘接到芯片上。首先，使用直头镊子剥离组件1两侧的蓝色保护层，并将其放入工装A1中，上腔室朝下。轻轻按压组件1，直至其压敏胶（PSA）与芯片接触。
  4. 将夹具 A2 放置到夹具 A1 上，并在不同角落施加牢固压力，以确保芯片与组件紧密贴合。
    注意：切勿移除PSA层。该层相较于蓝色保护层更透明且更坚硬。
  5. 将组件2与芯片连接至组件1。首先，用直头镊子夹住组件2的一个角，将其从片材上剥离。然后，夹住组件2的非PSA“三角形”区域，一并移除组件2的厚透明保护层和蓝色层，露出PSA表面。将组件2放置于工装B1中，PSA面朝上。
  6. 将带有膜芯片的组件1放入夹具B1中，上室朝上。
  7. 将夹具B2放置在组件1上，并在夹具B2的不同角落施加牢固压力。
  8. 从夹具中取出组装好的装置，使用直头镊子按压装置底部，排出任何气泡，并密封通道边缘，注意避免接触膜区域。在用于细胞培养前，将新组装的装置进行紫外线（UV）灭菌20分钟。

2. 细胞培养

注意：本方法描述了在该平台上进行原代细胞和人诱导多能干细胞（hiPSC）来源细胞培养的实验方案。这些方法包括在装置上层腔室中进行内皮细胞单层培养，以及在沟槽向下组装的装置中，将周细胞置于下层腔室、内皮细胞置于上层腔室进行周细胞与内皮细胞的共培养。有关腔室的尺寸和体积，请参见表1。以上为最常用的实验模式；然而，用户可根据具体需求采用其他细胞培养布局。

  1. 细胞培养腔室的制备
    1. 按照第1节中详述的方案组装装置。
    2. 将装置置于无菌软管夹中。在进行细胞培养前，通过将夹子浸泡在乙醇中 ≥20 分钟进行灭菌。每次实验后需重新灭菌以重复使用。
    3. 将装置置于大型无菌培养皿中进行培养。为增加湿度，可在其中加入盛有无菌水的小型培养皿或50 mL锥形管盖。
    4. 用100 µL无菌水清洗装置的上腔室两次。若进行下腔室细胞培养，则用20 µL无菌水清洗下腔室。
  2. hCMEC/D3细胞系（血脑屏障）单培养
    1. 根据第2.1节准备细胞培养腔室。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）配制含25 µg/cm2 I型胶原蛋白和5 µg/cm2人纤维连接蛋白的混合液，对上腔室进行包被。37 °C孵育1–2小时，或4 °C过夜。
    3. 吸除包被液，向上腔室加入100 µL预热的去生长因子内皮细胞培养基（检测培养基），下腔室加入20 µL。检测培养基的配制方法：将100 mL内皮基础培养基 + 400 µL人成纤维细胞生长因子 + 40 µL氢化可的松 + 100 µL硫酸庆大霉素 + 2 mL胎牛血清混合。
    4. 根据制造商提供的方案传代hCMEC/D3细胞；在37 °C培养箱中用胰酶消化3–5分钟，然后加入预热的内皮细胞培养基终止消化。将细胞悬液转移至离心管，室温下200 × g离心5分钟。用检测培养基重悬细胞沉淀，并以40,000–60,000个细胞/cm2的密度接种至上腔室。将装置置于37 °C、5%二氧化碳（CO2）环境中孵育2–4小时以促进细胞贴壁。例如，为在0.37 cm2芯片上达到40,000个细胞/cm2的密度，需向上腔室加入100 µL浓度为150,000个细胞/mL的细胞悬液。
      注：我们按照Hudecz等38的方法培养和传代hCMEC/D3细胞，使用改良的内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）进行细胞维持，传代后使用去生长因子的“检测培养基”进行实验。其他培养基配方也可与本装置兼容，但如果用户在hCMEC/D3存活率方面遇到问题，我们建议采用Hudecz等38推荐的培养基配方。
    5. 细胞贴壁2–4小时后，更换上下腔室中的新鲜检测培养基，以去除死细胞或未贴壁细胞。
    6. 将装置维持在37 °C、5% CO2环境中，每2–3天更换一次上下腔室的检测培养基，直至开始实验。通常在培养2周后进行检测。
  3. hiPSC来源的EECM-BMEC样细胞单培养
    1. 根据第2.1节准备细胞培养腔室。
    2. 将5 mg IV型胶原蛋白溶于5 mL浓度为0.5 mg/mL的乙酸中，配制成1 mg/mL的溶液，用于制备人胎盘来源的IV型胶原蛋白溶液。4 °C静置 ≥4 小时以充分复溶。该溶液在4 °C下可稳定保存2周。
    3. 按IV型胶原蛋白:牛纤维连接蛋白:无菌水 = 4:1:5的比例配制混合液，取100 µL包被上腔室。37 °C包被2–4小时。
    4. 吸除包被液，向上腔室加入100 µL室温hECSR培养基，下腔室加入20 µL。
    5. 根据Nishihara等37的方法传代EECM-BMEC样细胞；向细胞中加入细胞解离酶混合液，转移至37 °C培养箱中孵育5–8分钟。用移液器吹打使细胞分散，然后加入4倍体积的内皮细胞培养基至离心管中。室温下200 × g离心5分钟；用hECSR重悬细胞，并以40,000个细胞/cm2的密度接种至上腔室。将装置置于37 °C、5% CO2环境中孵育2–4小时以促进细胞贴壁。例如，为达到40,000个细胞/cm2的密度，加入100 µL浓度为150,000个细胞/mL的细胞悬液。
    6. 细胞贴壁2–4小时后，更换上下腔室中的新鲜hECSR培养基，以去除死细胞或未贴壁细胞。
    7. 将装置维持在37 °C、5% CO2环境中，每1–2天更换一次上下腔室的hECSR培养基，直至开始实验。通常在培养第6天进行检测。
  4. hCMEC/D3细胞与原代人脑血管周细胞（HBVP）共培养
    1. 在装置组装前，用PBS配制2 µg/cm2的聚-L-赖氨酸（PLL）溶液对膜芯片进行包被。仅将50–80 μL PLL溶液滴加至最终装置组装时朝下的那一面。包被过程可在37 °C下进行1–2小时，或4 °C过夜完成。
    2. 吸除包被液，用无菌超纯水清洗膜芯片，并使其自然干燥。
    3. 按照上述第1节所述方案组装装置，确保PLL包被面朝下，并根据第2.1节准备细胞培养腔室。
    4. 按照第2.2.2节对上腔室进行包被。
    5. 向上腔室加入50 µL预热的周细胞培养基，下通道加入20 µL。
    6. 根据制造商提供的方案传代HBVP细胞；在37 °C培养箱中用胰酶消化3–5分钟，然后加入预热的周细胞培养基终止消化。将细胞悬液转移至离心管，室温下200 × g离心5分钟。用周细胞培养基重悬细胞沉淀，并以14,000–25,000个细胞/cm2的密度接种至下腔室。将装置倒置，但保持上腔室与空气接触，以利于气体交换。
      注：倒置过程中所需的空气界面可通过以下方式实现：先将装置放入软管夹中，翻转前按压所有角落；或将其倒置放置在间距足够宽的平行丙烯酸或硅胶条上，以确保上腔室不被遮挡。接种密度可能需要根据使用者的具体情况进行优化。为达到14,000个细胞/cm2的密度，加入20 µL浓度约为590,000个细胞/mL的细胞悬液。注意：为避免产生气泡，20 µL液体需移入下腔室，但密度计算基于下腔室10 µL的体积。
    7. 将装置倒置，在37 °C、5% CO2环境中孵育2–4小时，以促进细胞贴壁。
    8. 细胞贴壁2–4小时后，将装置正置，并更换上下腔室中的新鲜周细胞培养基，以去除死细胞或未贴壁细胞。
    9. 接种周细胞后，按照第2.2.4–2.2.5步在上腔室接种hCMEC/D3细胞。将上下腔室均更换为检测培养基。
    10. 将装置维持在37 °C、5% CO2环境中，每1–2天更换一次上下腔室的检测培养基，直至开始实验。原代细胞共培养通常在检测前维持6–8天。
      注：若需将HBVP单培养与hCMEC/D3单培养或hCMEC/D3与HBVP共培养进行比较，则在接种HBVP后2–3天将周细胞培养基更换为检测培养基。
  5. hiPSC来源的EECM-BMEC样细胞与脑周细胞样细胞（BPLC）共培养
    1. 根据第2.1节准备细胞培养腔室，并按照第2.3.2–2.3.3步对上腔室进行包被。
    2. 吸除包被液，向上腔室加入50 µL室温Essential 6培养基 + 10%胎牛血清（E6 + 10% FBS）。
    3. 根据Gastfriend等39的方法传代BPLC细胞；向细胞中加入细胞解离酶混合液，转移至37 °C培养箱中孵育5–15分钟，直至约90%的细胞变圆。用移液器吹打使细胞分散，然后加入4倍体积的DMEM/F12至50 mL离心管中，使用40 µm细胞筛过滤以彻底分散细胞。转移至15 mL离心管，室温下200 × g离心5分钟，用E6 + 10% FBS重悬细胞沉淀，并以14,000–25,000个细胞/cm2的密度接种至下腔室。将装置倒置，但保持上腔室与空气接触，以利于气体交换。
      注：倒置过程中所需的空气界面可通过以下方式实现：先将装置放入软管夹中，翻转前按压所有角落；或将其倒置放置在间距足够宽的平行丙烯酸或硅胶条上，以确保上腔室不被遮挡。接种密度可能需要根据使用者的具体情况进行优化。为达到14,000个细胞/cm2的密度，加入20 µL浓度约为590,000个细胞/mL的细胞悬液。注意：为避免产生气泡，20 µL液体需移入下腔室，但密度计算基于下腔室10 µL的体积。
    4. 将装置倒置，在37 °C、5% CO2环境中孵育2–4小时，以促进细胞贴壁。
    5. 细胞贴壁2–4小时后，将装置正置，并更换上下腔室中的新鲜E6 + 10% FBS，以去除死细胞或未贴壁细胞。
    6. 接种周细胞样细胞1天后，按照第2.3.5–2.3.6步在上腔室接种EECM-BMEC样细胞。将上下腔室均更换为hECSR培养基。
    7. 将装置维持在37 °C、5% CO2环境中，每1–2天更换一次上下腔室的检测培养基，直至开始实验。hiPSC来源的共培养通常在检测前维持BPLC培养7天、EECM-BMEC样细胞培养6天。
      注：若需将BPLC单培养与EECM-BMEC单培养或EECM-BMEC与BPLC共培养进行比较，则在接种BPLC后1天将E6 + 10% FBS更换为hECSR。

3. 免疫细胞化学

注意：本方法描述了一种针对培养于膜上侧和/或下侧细胞的免疫细胞化学染色与成像方案。本实验的目的是确定在血脑屏障（BBB）中应存在的关键蛋白的存在及其定位，例如黏附连接蛋白、紧密连接蛋白以及细胞身份标志蛋白。其他染色方法以及活细胞染色方法也适用于该平台。

  1. 装置上的固定与染色
    1. 将一抗置于冰上解冻。
    2. 在室温下配制4%多聚甲醛（PFA）溶液（例如，将16% PFA用3倍体积的PBS稀释），或在-20 °C预冷100%甲醇。
    3. 根据表2配制适当的封闭液，置于冰上保存。
      注意：可能需要涡旋振荡以充分溶解Triton X-100。
    4. 通过移液将20 µL固定液（如PFA或甲醇）加入底部腔室，50 µL加入顶部腔室，对细胞进行固定。室温孵育10分钟（PFA）或2分钟（甲醇）。
    5. 用PBS清洗3次，每次5分钟：向底部腔室加入20 µL PBS，顶部腔室加入100 µL PBS。
    6. 在室温下封闭30分钟：向底部腔室加入20 µL封闭液，顶部腔室加入50 µL封闭液。检查底部腔室是否存在气泡。
    7. 根据表2，用封闭液稀释一抗，配制一抗溶液，置于冰上保存。
    8. 加入20 µL一抗溶液至底部腔室，并用50 µL一抗溶液替换顶部腔室的液体。检查底部腔室是否存在气泡。室温孵育1小时，或4 °C过夜。
    9. 用PBS清洗3次，每次5分钟：向底部腔室加入20 µL PBS，顶部腔室加入100 µL PBS。
    10. 根据表2，用封闭液稀释二抗，配制二抗溶液，置于冰上避光保存。
    11. 加入20 µL二抗溶液至底部腔室，并用50 µL二抗溶液替换顶部腔室的液体。检查底部腔室是否存在气泡。室温避光孵育1小时。
    12. 用PBS清洗3次，每次5分钟：向底部腔室加入20 µL PBS，顶部腔室加入100 µL PBS。
    13. 配制细胞核染色液：将Hoechst用PBS按1:10,000稀释。向底部腔室加入20 µL核染色液，并用50 µL核染色液替换顶部腔室的液体。检查底部腔室是否存在气泡。室温避光孵育3分钟。
    14. 向底部腔室加入20 µL PBS，顶部腔室加入100 µL PBS以去除染色液。立即成像，或用封口膜包裹培养皿后于4 °C避光保存，待成像时取出。
  2. 共聚焦成像
    注意：本节以使用倒置转盘共聚焦显微镜配合长工作距离（LWD）40倍物镜（水镜，工作距离590–610，数值孔径1.15）为例进行说明。有关工作距离和物镜兼容性，请参阅McCloskey等人的补充材料34。同时使用10倍物镜拍摄整个膜区域的图像，以确保40倍图像能代表整个视野。这些图像通常在宽场模式下采集。
    1. 开启显微镜并打开成像软件。
    2. 根据二抗和核染料的特性，在共聚焦成像模式下设置通道。优化激光功率和曝光时间，以确保信号高于背景并减少成像伪影。
      1. 对于Hoechst核染色，使用激发波长405 nm，发射波长450/50带通（BP），曝光时间500 ms，激光功率50%。对于使用偶联Alexa Fluor（AF）488的二抗标记，使用激发波长488 nm，发射波长525/50 BP，曝光时间500 ms，激光功率50%。对于使用偶联AF568的二抗标记，使用激发波长561 nm，发射波长600/50 BP，曝光时间500 ms，激光功率100%。
    3. 将装置放入显微镜载物台的装置 holder 中，顶部腔室朝上，并使用载玻片 holder 固定于显微镜上。开启实时成像功能，选择核染色通道。使用低倍物镜找到膜区域，确保透明的氮化硅膜区域居中，因为光线无法穿透蓝色的实心硅胶区域。当装置正确居中且细胞层被定位后，切换至40倍物镜，润湿物镜，并以核染色为参考对膜区域进行聚焦。
    4. 开启z轴层扫成像，将扫描模式设为起始/终止。设置步长或层数。使用显微镜的粗调旋钮，以核染色为参考，将扫描起始位置设为内皮细胞层顶部，扫描终止位置设为周细胞层底部。检查所有通道，确保所有目标结构均位于成像视野内。
      ​注意：我们通常使用自动步长，约为0.2 µm每层。
    5. 设置图像名称后点击采集开始成像。根据需要在不同区域重复此操作。
    6. 使用ImageJ40或Imaris处理共聚焦图像。
      1. 在Imaris中处理时，将图像文件拖入程序中打开。在顶部菜单栏选择切片，可查看x-y平面的二维图像及对应的x-z和y-z平面视图。选择3D视图可查看三维图像。点击图像并拖动可旋转视角。选择快照可截取图像。

4. 小分子通透性取样检测

注意：本节描述了一种用于定量测量细胞培养物屏障特性的方法。该实验的目的是检测穿过细胞层并进入平台底部腔室的荧光小分子的浓度。随后利用这些数据计算细胞通透性。

  1. 采样技术
    1. 按照第1节中详述的方案组装设备，并按第2节所述培养所需的细胞系。另设一个不含细胞的包被对照装置，用于测量系统的通透性。
      注意：建议每种条件至少进行三次技术重复；但包被对照仅需一次重复即可。
    2. 在开始采样检测之前，将下室中的培养基更换为新鲜培养基。在显微镜下检查每个装置中内皮单层细胞的汇合度。注意观察细胞单层中是否存在间隙，因为这会影响染料向下室的扩散。
      注意：健康的内皮细胞培养应达到100%汇合度。
    3. 制备荧光小分子溶液（例如， 150 µg/mL 荧光黄（Lucifer Yellow，457 Da）的细胞培养基溶液。配制足量的荧光小分子溶液，用于制备标准溶液，作为计算从底部通道取样所得荧光小分子浓度的参考。
      注意：我们建议制备 400 µL 过量溶液将用作荧光小分子最高浓度的标准溶液。
    4. 更换上层小室中的培养基 100 µL 荧光小分子溶液的
      注意：建议使用疏水笔在取样口周围画圈，并等待疏水性墨水完全干燥后再加入荧光染料溶液。这可以防止在步骤4.1.7中，下层通道的培养基从取样口底部扩散。建议错开向顶部孔中加入荧光小分子溶液的时间——每向一个装置加样后等待2分钟，再向下一个装置加样；或者以3个装置为一组同时加样，然后等待5分钟再对下一组三个装置加样。
    5. 将设备在指定条件下孵育 37 °C，5% CO2 1 小时。
    6. 在上一步骤的1小时孵育期间，通过将步骤4.1.3中制备的荧光小分子溶液进行2倍系列稀释，配制标准溶液。用移液器吸取 50 µL 将每种溶液以三个复孔分别加入平底黑色96孔板中。以空白细胞培养基作为基线标准溶液。
      注意：配制标准溶液时，我们建议在最终体积为 200 µL 使用细胞培养基作为空白对照，以测定基础荧光强度。
      1. 转移 200 µL 的 400 µL 步骤4.1.3中制备的过量荧光小分子溶液加入至含有 200 µL 加入适量培养基，充分混匀，然后转移 200 µL 将该溶液加入下一个含有 200 µL 的培养基。继续进行1:2稀释，直至共得到10支试管。移液 50 µL 将最浓的标准溶液分别三份加入96孔板的第1列（B1、C1、D1），2nd 最浓的溶液加入第2列（B2, C2, D2），依此类推。对于12th 板上的列，用移液器 50 µL 空白培养基，设三个重复（B12、C12、D12）。
    7. 执行以下步骤，从底部通道采集荧光小分子溶液样品。
      1. 从孔中移除荧光小分子溶液以终止扩散过程。
      2. 放置一个含有尖端的 50 µL 向顶端端口加入培养基以作为储液 reservoir，操作时插入移液器尖头 50 µL 将移液器插入端口，提起装置，同时握住顶部以保持稳定，轻柔弹出吸头。将装置放回原位。确保移液器吸头内无气泡，吸头尖端无空气残留，以避免在取样过程中向底部腔室引入气泡。
      3. 添加 50 µL 向顶部小室中加入适量培养基，以防止取样过程中细胞单层受到破坏。
      4. 从底部通道取样溶液时，将移液器装上空的吸头并按至第一档阻力位，将吸头插入取样口，反向移液取出溶液 50 µL 从底部通道吸取溶液，直接转移至含有标准溶液的平底黑色96孔板中。 
        注意：建议在取样后立即在显微镜下检查细胞单层。从底部通道吸取培养基时，偶尔会导致上层小室中的细胞层受损，从而可能引起通透性测量结果不一致。快速完成4.1.7步骤中的各项操作有助于避免此问题。
    8. 使用微孔板读板机，根据所用荧光小分子的适当激发和发射波长参数测量荧光强度。对于 Lucifer Yellow，采用 428 nm 激发波长和 536 nm 发射波长，并设置为最佳增益。从微孔板上方读取荧光信号。将微孔板放入读板机中，选中包含样品（包括标准曲线）的孔，并选择 开始 读取酶标板。
  2. 渗透性值的计算（参见 补充文件 1 用于模板）
    1. 从所有测得的荧光强度值中减去空白培养基的平均荧光强度值。
    2. 使用公式（1) 以计算系统的渗透性 Ps:
      通透性系数方程，PS = ([A]A × V) / ([A]L × t × S)，公式示意图。     (1)
      何处 [A]A 是从小分子荧光物从底部通道收集的浓度，V 是取样并加入板中的体积（0.050 mL）， [A]L 是加入上层小室的荧光小分子的浓度（例如 0.15 mg/mL）， t 是孵育时间（单位为 s 或 min，取决于所需的单位），以及 S 是膜的表面积（0.014 cm2).
      1. 计算 [A]A 利用标准溶液的已知浓度与其荧光强度输出值绘制标准曲线所得方程，将实验样品的荧光强度值（y）代入该方程，计算其浓度（x）。
        注意：使用标准曲线的线性部分。我们建议通过显微镜下拍摄的膜图像来测量膜的表面积，因为膜的表面积可能因批号不同而有所差异，若与涂覆对照组存在差异，可能会显著影响计算得到的通透性值。
    3. 使用公式（2) 以计算细胞单层的通透性 Pe:
      拉乌尔定律概念，蒸气压方程 1/Pe=1/Ps−1/Pc，化学公式     (2)
      其中 PS 为在步骤 4.2.2 中计算得到的系统渗透性，且 PC 是无细胞、带涂层对照装置的系统渗透率值。

结果

图1展示了沟槽向下装置的组装过程。图1中，固定装置用于引导各组件和膜芯片的组装。组件1主要由丙烯酸材料制成，具有用于与芯片键合的压敏胶（PSA）表面，以及通向底部腔室的开口和用于移液管进入底部腔室的端口。组件2为通道层，其右上角设有非粘性、无压敏胶的“三角”区域，便于抓握。沟槽向下装置在顶部腔室提供平坦的细胞培养生长区域，而沟槽向上装置则在底部腔室提供细胞培养的平坦表面。

我们进行了内皮细胞单培养以及hCMEC/D3与HBVPs的共培养，以及hiPSC IMR90-4来源的EECM-BMEC样细胞与BPLCs的共培养，并使用尼康Eclipse Ts2相差显微镜配合10倍物镜获取相差图像（图2）。图中展示了原代细胞培养的最佳接种密度（接种后1天拍摄的图像），以及HBVPs接种密度过低的情况（图2A）。最终的共培养与单培养相差图像（内皮细胞培养6天后）可能难以区分（图2C），因此确认原代细胞共培养是否成功可能需要通过免疫荧光染色来验证（参见方案第3节）。图中还展示了hiPSC来源BPLCs的低、高及最佳接种密度（图2B）。与原代共培养相比，hiPSC来源的共培养在相差显微成像中更易于区分（图2D）。BPLCs接种密度过低会导致周细胞覆盖不全和细胞聚团，而接种过多则会导致周细胞层从膜上剥离。此外，下室培养基更换过快可能导致周细胞丢失，因为这些细胞对剪切力极为敏感。构建血脑屏障模型时，周细胞的覆盖率达到约90%为最佳，且内皮细胞层应无间隙。

代表性免疫染色 hiPSC 来源共培养图像如图所示 图3 （6天内皮细胞培养）。对IMR90-4来源的BPLC进行周细胞标志物PDGFRβ染色，对IMR90-4来源的EECM-BMEC样细胞进行黏附连接标志物VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）染色。使用Hoechst染色细胞核。图像采用配备40倍长工作距离物镜的转盘共聚焦显微镜获取。 0.2 µm 切片并用 Imaris 进行处理。尽管超薄纳米膜未被显示，但两个细胞层均可被可视化。

我们在瑞士伯尔尼大学和美国纽约罗切斯特大学两个地理位置相距较远的实验室中，采用相同的实验条件进行了基于取样的小分子通透性检测，以验证结果的实验室间可重复性（图4）34。将来源于hiPSC IMR90-4的EECM-BMEC样细胞在µSiM装置中培养2、4或6天，或在transwell小室中培养6天。两个实验室均使用150 µg/mL的鲁米诺黄（Lucifer Yellow，457 Da）进行通透性实验。装置中培养2天的内皮细胞通透性表现出高度变异性，表明培养2天不足以实现屏障的成熟。从培养4天起，在屏障成熟后，各实验室之间的通透性无显著差异。我们还证明，在µSiM装置和transwell小室中培养6天的内皮细胞通透性与先前已发表的结果一致40。

微流控装置组装示意图：丙烯酸层、压力敏感胶、移液口、沟槽结构。
图 1：µSiM 装置的组装步骤。（A）通过将芯片放置在夹具 A1 上来准备芯片。若要制备最终沟槽向下的装置，则将芯片沟槽面向上放置；若要制备最终沟槽向上的装置，则将芯片沟槽面向下放置。（B）通过从组件 1 上移除保护膜，并将其正面朝下放入夹具 FA1 中，将组件 1 键合到芯片上。使用夹具 A2 施加压力完成键合。（C）通过将组件 2 从其基板上取下并剥离顶部保护层，将组件 2 与组件 1 键合。将组件 2 的通道面向上放入夹具 B1 中，并将组件 1 正面朝上放置在组件 2 的上方。使用夹具 B2 施加压力完成键合。缩写：FAn = 夹具 An；FBn = 夹具 Bn。请点击此处查看本图的高清版本。

脑细胞培养示意图；接种密度图像；内皮细胞、周细胞、共培养分析。
图 2：微流控装置中细胞共培养的示意图及代表性相差显微图像。（A）周细胞与内皮细胞接种位置示意图。（B）膜芯片沟槽横截面中细胞位置的侧视示意图。（C）人脑血管周细胞（HBVP）和人脑微血管内皮细胞系 hCMEC/D3 在低接种密度与最佳接种密度下的代表性图像。图像分别在 HBVP 接种后 1 天和 hCMEC/D3 接种后 2 小时采集。（D）由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的类脑周细胞（BPLC）在低、高及最佳接种密度下的代表性图像。图像在接种后 1 天采集。（E）HBVP 与 hCMEC/D3 共培养以及 hCMEC/D3 单独培养的最终状态代表性图像。图像分别在 HBVP 接种后第 8 天和 hCMEC/D3 接种后第 7 天采集。（F）BPLC 与 EECM-BMEC 样细胞共培养失败与成功案例，以及 EECM-BMEC 样细胞单培养的代表性图像。图像分别在 BPLC 接种后第 7 天和 EECM-BMEC 样细胞接种后第 6 天采集。接种密度过低的 BPLC 培养物无法形成充分覆盖，而接种过多的 BPLC 培养物则会过度融合，出现聚团或退缩现象。比例尺 = 100 µm（C-F）。缩写：HBVPs = 人脑血管周细胞；hiPSC = 人诱导多能干细胞；BPLCs = hiPSC 来源的类脑周细胞。 请点击此处查看该图的高清版本。

显示VE-cadherin、PDGFRβ和Hoechst染色细胞的纳米膜荧光显微图像。
图3：设备中hiPSC来源的细胞共培养免疫染色代表性图像。 细胞经内皮细胞标志物VE-cadherin（绿色）、周细胞标志物PDGFRβ（红色）以及细胞核染色（蓝色）处理。可见两层细胞紧密相邻，仅由一层薄的氮化硅纳米膜隔开（左图中白色箭头指示膜的位置）。比例尺 = 50 µm。缩写：hiPSC = 人诱导性多能干细胞；PDGFRβ = 血小板源性生长因子受体β。请点击此处查看该图的放大版本。

通透性检测示意图；细胞单层、荧光法、通透性曲线、科学研究。
图4：基于取样的小分子通透性检测。（A）实验流程示意图。（B）瑞士伯尔尼大学（UniBe）与中国美国纽约罗切斯特大学（UR）两个地理位置相距较远的实验室之间实验结果的可重复性验证：将hiPSC来源的内皮细胞在µSiM装置中培养2、4或6天，或在transwell滤膜上培养6天，随后使用150 µg/mL的荧光黄（457 Da）进行通透性检测。红色条形表示先前发表的、相同hiPSC来源内皮细胞在transwell滤膜中培养6天后对荧光素钠（376 Da）的通透性数据40。每组N = 4–16。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）与Tukey事后检验，仅显示具有显著差异的比较结果（p < 0.05）。（C）使用在µSiM中培养2天的hiPSC来源EECM-BMEC样细胞检测细胞因子反应；在通透性检测前20小时，向顶部腔室加入0.1 ng/mL TNFα + 2 IU/mL IFNγ或培养基对照（未刺激，NS），随后使用150 µg/mL荧光黄进行检测。每组N = 3。采用Student’s t-检验，p < 0.05。请点击此处查看该图的放大版本。

上室接种表面积上孔体积下室接种表面积下通道体积
~37 mm2100 µL（可容纳 ≥115 µL）~42 mm210 µL（移液 20 µL 以避免气泡）

表1：关键的µSiM表面积与体积。

靶标固定剂封闭液稀释比例
VE-cadherin4% PFA 或 100% MeOH5% GS + 0.4% Tx-100 或 10% GS + 0.3% Triton X-1001:50
CD314% PFA 或 100% MeOH5% GS + 0.3-0.4% Triton X-1001:100
Claudin-5100% MeOH5-10% GS + 0.3% Triton X-1001:200
ZO-1100% MeOH5-10% GS + 0.3% Triton X-1001:200
Occludin100% MeOH5-10% GS + 0.3% Triton X-1001:50
PDGFRβ4% PFA5% GS + 0.4% Triton X-1001:100
NG24% PFA5% GS + 0.4% Triton X-1001:100
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 4881:200
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 5681:200

表2：在µSiM装置中共培养免疫细胞化学验证的抗体及染色方法。 缩写：PFA = 甲醛；MeOH = 甲醇；GS = 羊血清。

补充文件 1：通透性值计算模板。 请点击此处下载该文件。

讨论

尽管膜芯片在设计上具有稳定性，但在组装过程中若操作不当，仍可能发生开裂或破损。因此，必须使用芯片镊子夹住芯片的凹槽部位，并轻柔地将其放入夹具中。在一般情况下操作这些装置时，必须格外小心，避免碰撞或跌落。在将膜芯片与夹具A1进行键合时，必须将芯片平整且居中地放置在夹具A1的支柱上，以防止在与组件1键合过程中膜发生开裂。此外，在移除保护膜后，必须避免任何与暴露的PSA层接触的情况。在移除保护膜后操作组件2时，建议沿组件边缘持握，并使用镊子夹取无PSA的三角形角落部位。

尽管已有文献描述了可能的血脑屏障（BBB）细胞培养方案，但本文所述的脑微血管内皮细胞（BMEC）/周细胞共培养BBB模型是否充分，取决于具体的生理背景和研究问题。例如，免疫细胞的迁移主要发生在脑部的后微静脉中41,42。在这些区域，血管周围间隙将BMEC/周细胞屏障与星形胶质细胞形成的胶质界膜分隔开来。因此，在后微静脉中，神经血管单元（NVU）由两个在空间上分离且串联的屏障组成，而星形胶质细胞终足并不直接接触BMEC/周细胞构成的血屏障，当前模型能够很好地模拟这一结构。如果目标是构建一个能够反映星形胶质细胞分泌因子对血屏障影响的NVU模型，则可在装置中增加一个星形胶质细胞区室，使可溶性因子通过血管周围间隙进行交换。这一设计此前已有示例34，并可进一步扩展，以在三维“脑”区室中纳入小胶质细胞和神经元等其他细胞类型。该平台的模块化架构支持采用简单的组装策略实现上述重构，使平台 可根据待验证的科学假设灵活调整为所需复杂程度。然而，每种细胞培养配置 都必须针对新的细胞系和多细胞共培养体系进行优化。例如，由于氮化硅膜的特性，与传统组织培养板相比，可能需要调整包被溶液。通常添加纤连蛋白有助于细胞的贴附和存活。此外，用户也可在相对方向上培养内皮细胞和周细胞。在此情况下，可能需要修改例如通透性测量的方法及其结果解读方式。然而，本文不涉及此类培养的具体操作步骤。

细胞培养过程中可能遇到的另一个挑战是培养基的快速蒸发，因为这些装置相比标准的组织培养板和培养瓶对环境变化更为敏感。若观察到过度蒸发或细胞生长减缓，必须检测所有关键的培养箱参数，以确保设置准确。可向组织培养瓶的瓶帽中添加更多无菌水 将小培养皿置于细胞培养腔内，或更频繁地更换培养基。此外，气泡可能进入底部通道，并在沟槽朝下装置的沟槽处滞留。虽然气泡可以被清除，但最简便的方法是从一开始就避免引入气泡。为此，在向底部腔室加样前，必须检查移液枪尖端内部及尖端末端是否存在气泡或空气。此外，通道中的培养基蒸发可能导致液面与加样口顶部之间形成间隙。此时可向一个加样口加入少量培养基，直至液体到达对侧加样口表面，随后可在对侧加样口进行培养基更换。hECSR和E6 + 10% FBS培养基不应在水浴中预热，但其他培养基可预先温育以减少气泡形成。若气泡已进入底部腔室，可通过快速在通道中移取100 µL液体将其排出。然而，该方法可能导致腔室间污染或培养基溢出至装置表面，还可能破坏细胞层。另一种方法是先将通道内的培养基完全移除，再以50 µL体积重新加入。但先移除培养基的操作可能引发更多气泡产生。若气泡未位于膜区域正下方，则可保留在通道内，对细胞培养无影响。

如图2所示，周细胞的贴壁与生长可能具有挑战性。使用优化的接种密度对于形成具有生理相关周细胞-内皮细胞比例的细胞层至关重要。此外，由于周细胞对剪切力敏感，通道内的所有换液操作均应缓慢进行，以保护细胞。对于BPLC培养，可通过在下层腔室中包被800 µg/mL IV型胶原或100 µg/mL纤连蛋白来改善细胞贴壁。

本文所述装置中的免疫细胞化学技术可实现对细胞健康状况和功能的定性分析。在组织培养板或其他平台上的染色方法可直接适用于该装置。若仅在上层腔室中进行细胞培养，在固定后，可向底层腔室中加入磷酸盐缓冲液（PBS），并在后续步骤中保留该液体，仅在上层腔室中进行封闭和染色操作。此方法可最大限度降低膜破损或向底层腔室引入气泡的风险。对于共培养染色，我们建议在所有步骤中同时使用上下两个腔室。需要注意的是，固定液和PBS的黏度与培养基不同，因此更容易在底层腔室中引入气泡。在向底层腔室加样前，应格外小心，检查移液器吸头尖端是否存在空气。

本文所述的小分子通透性检测方案可用于对在 µSiM 装置中培养的内皮细胞屏障功能进行功能性与定量评估。在执行步骤 4.1.7.4 从底部通道采集样本时，可能会遇到的一个问题是吸入气泡。为避免此问题，必须确保在开始采样前移液枪头已完全密封插入端口，且采样速度不宜过快。若此方法仍无法解决问题，则可能是所用枪头尺寸过小或过大，无法与端口良好贴合；应使用 材料表 中列出的枪头。若在单层细胞形态健康、融合良好的情况下仍测得异常高的通透性值，则必须检查采样过程中单层结构是否受损。我们建议每次采样后立即在显微镜下检查单层完整性。若单层仍显示完整且状态良好，则可对样本进行固定，并通过例如连接蛋白的免疫染色等方式评估屏障功能的生物学标志物。相反，若测得的通透性值异常偏低，则必须确保从底部通道准确采集 50 µL 培养基，且无气泡混入。若在将储液枪头放置到位后立即有培养基流出，则必须先收集这部分液体，因为从底部通道最初采集的约前 10 µL 体积中通常含有大部分荧光小分子。使用疏水笔在端口周围画圈，或在端口周围贴带孔的疏水胶带，可防止被动泵送的培养基扩散。 被动泵送 的培养基。若采样过程中吸入气泡或未能完全移取 50 µL 样本，则该样本不得使用。或者，也可准确测定实际采集体积并用于通透性计算；但此方法仅适用于采集体积 ≥40 µL 的情况，此时染料回收率约为 98–99%34。

披露

J.L.M. 是 SiMPore 的联合创始人，并持有该公司股权。SiMPore 正在将包括本研究中所用膜在内的超薄硅基技术进行商业化。

致谢

J.L.M.、B.E.、T.R.G.、M.C.M.、P.K.、M.T.、K.C. 和 L.W. 由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R33 HL154249 支持。J.L.M. 由 R44 GM137651 项目资助。M.M. 由罗切斯特大学德鲁·梅尔·德尔蒙特神经科学研究所的施密特项目奖资助。M.T. 由 RF1 AG079138 项目资助。K.C. 由国际伦理研究基金会资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
CD31 多克隆抗体Thermo Fisher ScientificPA5-32321
Claudin-5 小鼠 IgG 抗体，4C3C2Thermo Fisher Scientific35-2500
山羊 α-小鼠 IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001
山羊 α-兔 IgG Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11011
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
NG2，小鼠 IgG2a，9.2.27Millipore MAB2029
Occludin 小鼠 IgG 抗体，OC-3F10Thermo Fisher Scientific33-1500
PDGFRβ，兔 IgG 抗体，28E1Cell Signaling Technology3169
VE-cadherin 小鼠 IgG2B 克隆 # 123413R&D SystemsMAB9381
ZO-1 兔 IgG 抗体，多克隆Thermo Fisher Scientific40-2200
化学品、多肽和重组蛋白
100% 甲醇VWR101443-718可用类似产品替代
16% 多聚甲醛Thermo Fisher Scientific28908可用类似产品替代
AccutaseThermo Fisher ScientificA1110501
乙酸Sigma-Aldrich695092
B27 添加剂Thermo Fischer Scientific17504044
bFGFR&D Systems233-FB-025
人胎盘来源 IV 型胶原蛋白Sigma-AldrichC5533
大鼠尾来源 I 型胶原蛋白溶液Sigma-AldrichC3867-1VL可用类似产品替代
DMEM/Ham’s F12Thermo Fisher Scientific11320033
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKitLonzaCC-3162
Essential 6 培养基Thermo Fisher ScientificA1516401
胎牛血清 (FBS)Peak SerumPS-FB1
牛血浆来源纤连蛋白Sigma-AldrichF1141
人源纤连蛋白，血浆来源ThermoFisher Scientific33016015可用类似产品替代
hESFMThermo Fisher Scientific11111044
荧光黄 CH 二锂盐Sigma-Aldrich861502
正常山羊血清Thermo Fisher Scientific500627可用类似产品替代
不含钙、镁的 PBSCytivaSH30256.01可用类似产品替代
周细胞培养基ScienCell1201使用完整试剂盒（包含添加剂）
聚-L-赖氨酸，10 mg/mLScienCell0413
Triton X-100JT BakerX198-05可用类似产品替代
UltraPure DNase/RNase-Free 去离子水Invitrogen™10977015可用类似产品替代
实验模型：细胞系
血脑屏障 hCMEC/D3 细胞系Sigma-AldrichSCC066
人脑血管周细胞ScienCell1200
iPS(IMR90)-4 人诱导多能干细胞WiCellRRID:CVCL_C437
玻璃器皿与塑料器皿
150 mm TC 处理带 20 mm 网格的细胞培养皿Falcon353025
夹具VWRMFLX06832-10
Corning 细胞培养板（6 孔）Corning3506
平底 96 孔非结合微孔板Greiner Bio-One655900
显微镜载玻片装置支架 SiMPoreUSIM-SB尺寸需与显微镜载玻片支架兼容
Nunc 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Fischer Scientific339651
Nunc 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Fischer Scientific339653管盖可注水用于细胞培养
P20-200 移液器吸头VWR76322-516其他品牌可能无法有效密封接口
Transwell 小室（12 孔，12 mm，0.4 μm 孔径，PC）CoStar3401
仪器
10X 物镜（适用于 Andor）Nikon Instruments Inc.MRD00105空气；工作距离：4 mm；数值孔径 0.45
10X 物镜（适用于 Nikon）Nikon Instruments Inc.MRP40102空气；工作距离：6.2 mm；数值孔径 0.25
40X 物镜（长工作距离）（适用于 Andor）Nikon Instruments Inc.MRD77410水浸；工作距离：590-610 mm；数值孔径 1.15
Andor 转盘共聚焦显微镜Oxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 相差显微镜Nikon Instruments Inc.可用类似产品替代
TECAN Infinite M200TECAN可用类似产品替代
其他
Advanced PAP 笔Millipore SigmaZ672548推荐使用 2 mm 笔尖
带固定装置的组装套件SiMPoreUSIM-JIGSET包括固定装置 A1、A2、B1 和 B2
显微镜相机适配器AmScopeCA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLRΦ23.2 - Φ30 适配器适用于 Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR 相机CanonEOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001可用类似产品替代
细胞滤器，40 µmMillipore Sigma (Corning)CLS431750
组件 1SiMPoreUSIM-C1
组件 2SiMPoreUSIM-C2
膜芯片SiMPoreNPSN100-1L其他芯片规格也可提供
SMD 操作双角镊子Techni-Tool758TW003"芯片镊子"
不锈钢精密型 GG 镊子Techni-Tool758TW534"直头镊子"
软件
FijiImageJ用于图像处理
FusionOxford Instruments, Andor版本 2.3.0.44 的使用说明
i-controlTECAN版本 2.0 的使用说明
ImarisOxford Instruments用于图像处理。版本 9.9.0 的使用说明

参考文献

  1. Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405(2019).
  2. Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
  3. Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813(2011).
  4. Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451(2022).
  5. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
  6. Ortiz, G. G., et al. Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis. Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).
  7. Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
  8. Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222(2022).
  9. Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
  10. Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
  11. Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
  12. Abbott, N. J., et al. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).
  13. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  14. Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671(2016).
  15. van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493(2016).
  16. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  17. Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770(2023).
  18. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685(2021).
  19. Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
  20. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  21. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  22. Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
  23. Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880(2021).
  24. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  25. Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
  26. Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
  27. DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
  28. Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750(2020).
  29. Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111(2019).
  30. Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
  31. Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
  32. Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
  33. Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
  34. McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804(2022).
  35. Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802(2022).
  36. Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030(2023).
  37. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).
  38. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  39. Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21(2021).
  40. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  41. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  42. Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. What is the blood-brain barrier (not). Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).

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