用于同步评估荧光生物传感器动态与激素分泌谱的人类伪胰岛系统

摘要

本方案描述了一种利用腺病毒递送环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器和cAMP差异检测器，对原代人源拟胰岛中细胞内信号传导事件与胰岛素及胰高血糖素分泌进行同步采集与共定位分析的方法。 原位 （cADDis）和微型灌流系统。

摘要

胰岛朗格汉斯细胞是散布于胰腺中的微小三维内分泌细胞团，由特化的内分泌细胞和支持细胞组成，在通过β细胞分泌胰岛素降低血糖以及α细胞分泌胰高血糖素升高血糖的过程中，对葡萄糖稳态的调控起着核心作用。细胞内信号通路（包括由cAMP介导的通路）对于α细胞和β细胞激素的调控性分泌至关重要。尽管三维胰岛结构对于胰岛功能的协调运作必不可少，但它为研究原代人胰岛细胞中细胞内信号通路的机制带来了实验上的挑战。为克服这些挑战和局限性，本方案描述了一种整合了活细胞成像与微流控技术的平台，该平台使用来自无糖尿病供体的原代人源拟态胰岛（pseudoislets）构建，其形态、细胞组成和功能均类似于天然胰岛。这些拟态胰岛通过原代人胰岛细胞的分散与再聚集过程实现尺寸控制。在细胞分散状态下，可对胰岛细胞的基因表达进行操控；例如，可导入生物传感器，如基因编码的cAMP生物传感器cADDis。一旦形成表达基因编码生物传感器的拟态胰岛，结合共聚焦显微镜与微灌流平台，即可同步评估荧光生物传感器的动态变化以及α细胞和β细胞的激素分泌谱，从而更深入地揭示细胞过程与功能机制。

引言

胰岛是散布在胰腺中的微型器官，其功能对维持葡萄糖稳态至关重要。当葡萄糖被代谢后，可导致ATP/ADP比值升高，ATP敏感性钾通道关闭，细胞膜去极化以及细胞外钙离子内流，从而促使β细胞分泌胰岛素¹。α细胞分泌胰高血糖素的机制尚不完全清楚，但已有研究推测，细胞内信号通路及旁分泌通路可能参与调控胰高血糖素颗粒的胞吐过程^2,3,4。1型和2型糖尿病均与胰岛细胞功能障碍相关^5,6,7。因此，阐明介导胰岛激素分泌的细胞内信号通路，对于理解胰岛生理及病理机制至关重要。

胰岛的球形结构给实验带来了一定的困难，这些挑战包括胰岛大小的差异性以及其三维结构，后者会降低病毒对胰岛核心区域的转导效率^8,9。为克服这些难题，研究人员开发了一种拟胰岛系统，该系统将原代人胰岛分散为单个细胞，通过腺病毒载体将编码目标分子的构建物转导至细胞中，随后重新聚集形成大小可控、类似胰岛结构的聚集体，称为拟胰岛⁷。与来自同一供体并平行培养的天然胰岛相比，这些拟胰岛在形态、内分泌细胞组成及激素分泌功能方面均具有相似性⁷。该方法可实现构建物在整个拟胰岛中的广泛表达，从而克服了以往对原代人胰岛进行均匀基因操作的技术障碍^7,8,9。

在此方案中，将拟胰岛系统与微流控装置相结合，以在原代人胰岛细胞中表达生物传感器，并获得时间分辨率 伪胰岛在动态灌流过程中的激素分泌^10,11,12将伪胰岛置于微芯片中，并暴露于不同促分泌剂的稳定流动环境中。 通过 蠕动泵¹²微芯片具有透明玻璃底部，并安装在共聚焦显微镜上，用于记录细胞内信号动态 通过 生物传感器荧光强度的变化。生物传感器成像与微灌流液的收集同步进行，以便后续分析胰岛素和胰高血糖素的分泌情况⁷与宏观灌流相比，这种微灌流方法由于微流控装置的体积小于宏观灌流腔室，因而可使用更少的伪胰岛。⁷.

为了利用该系统的功能，环磷酸腺苷（cAMP）差异检测器 原位 (cADDis) 生物传感器在人源拟胰岛中表达，用于评估cAMP动态变化及激素分泌情况。cADDis生物传感器由一个环状排列的绿色荧光蛋白（cpGFP）构成，该蛋白位于cAMP激活的交换蛋白2（EPAC2）的铰链区，连接其调节区与催化区。当cAMP结合至EPAC2的调节区时，会引发铰链区发生构象改变，从而增强cpGFP的荧光信号。¹³细胞内信使（如cAMP）在上游激活G蛋白偶联受体后，可促进胰岛素和胰高血糖素的分泌¹⁴活细胞成像结合微灌流技术有助于将细胞内cAMP动态变化与胰岛激素分泌关联起来。具体而言，在本方案中，通过生成表达cADDis的伪胰岛，以监测α细胞和β细胞在不同刺激条件下cAMP的响应：低葡萄糖（2 mM葡萄糖；G 2）、高葡萄糖联合异丁基甲基黄嘌呤（IBMX；20 mM葡萄糖 + 100 µM IBMX；G 20 + IBMX），以及低葡萄糖联合肾上腺素（Epi；2 mM葡萄糖 + 1 µM Epi；G 2 + Epi）。该处理流程可实现对细胞内cAMP动态变化的直接评估 通过 1）IBMX介导的磷酸二酯酶抑制作用，通过阻止cAMP降解从而提高细胞内cAMP水平；2）肾上腺素，一种已知的依赖cAMP的刺激剂，可通过激活β-肾上腺素能受体促进α细胞分泌胰高血糖素。以下详细说明用于活细胞成像实验的微灌流装置的建立、伪胰岛在微芯片中的装载、同步活细胞成像与微灌流操作，以及通过基于微孔板的激素检测对生物传感器信号和激素分泌进行分析的步骤。

方案

人胰岛（N = 4 批次）通过与综合胰岛分配计划、人类胰腺分析计划、Prodo Laboratories, Inc. 和 Imagine Pharma 合作获得。范德堡大学机构审查委员会认为，去标识化的人胰腺标本不属于涉及人的研究。本研究离不开器官捐献者、其家属以及器官获取组织的支持。捐赠者的人口统计学信息见表1。来自无糖尿病胰腺捐献者的胰岛在冷缺血时间少于15小时的条件下被分离获得。

1. 伪胰岛形成（详见 Walker 等人⁷）

1. 使用 P200 移液器和台式显微镜获取并手工挑选原代人胰岛，注意避免移液器吸头接触胰岛培养基（10% FBS，100 µg/mL 链霉素，100 U/mL 青霉素，2 mM L-谷氨酰胺的 CMRL 1066 培养基
2. 将原代胰岛转移至15 mL离心管中，后续所有拟胰岛形成步骤均在组织培养罩内进行，以防止污染。使用P1000移液器在室温下用0.025%胰蛋白酶消化原代胰岛7分钟，使其缓慢解离。随着胰岛开始解聚，溶液将变得浑浊。
   1. 在这些研究中，选取200–300个手工挑选的原代胰岛，其直径约为200 µm 分散于 500 µ0.025% 胰蛋白酶处理可获得一至两块96孔板的拟胰岛；具体数量可能因平均胰岛大小和活性而异。对于 >500个原代胰岛，按1:1比例放大所用0.025%胰蛋白酶的体积（例如，600） µ0.025% 胰蛋白酶处理 600 个手工挑选的胰岛
3. 通过加入与所用胰蛋白酶体积相等的范德堡伪胰岛培养基（VPM）来终止消化。随后，用1 mL VPM洗涤两次。每次洗涤时，将分散的细胞在485 × g 4℃下持续2-3分钟 °在台式离心机中离心。用确定体积的 VPM（通常为 1 mL）重悬细胞，用于计数。
   ​注：伪胰岛生成及VPM组成的详细信息见先前发表的文章⁷。简而言之，VPM 包含等体积的富集CMRL培养基（20% FBS，100 µg/mL 链霉素，100 U/mL 青霉素，1 mM 丙酮酸钠，2 mM Glutamax，2 mM HEPES 溶于 CMRL 1066 培养基），以及内皮细胞培养基（iEC-培养基，VEGF 完全培养基试剂盒不含 FBS + 1 瓶内皮细胞培养基补充剂）。伪胰岛生成的概要示意图见于 图 1A.
4. 使用自动细胞计数仪，通过将10 µL 的台盼蓝与 10 µ细胞悬液的 L。充分混匀细胞悬液以确保细胞计数准确。
5. 计算细胞悬液、病毒和 VPM 的体积 根据所需伪胰岛的数量确定细胞用量。所有计算均基于步骤1.4中获得的活细胞计数。
   1. 在这些研究中，将分散的人类胰岛细胞以 MOI 500（N = 1）或 1,000（N = 2）转导 Ad-CMV-cADDis，总体积为 500 μL µL. 一个转导的拟态胰岛板（2,000 个细胞/拟态胰岛）可为每位供体提供三个技术重复（每次实验 32 个拟态胰岛）。本研究中所用的腺病毒为商业来源。
6. 将计算好的细胞悬液、病毒和 VPM 体积加入 1.5 mL 离心管中。用移液器轻轻吹打混匀。
7. 转导期间，将离心管管盖打开，并用无菌培养皿覆盖，在37℃细胞培养孵箱中孵育2 h。 °C 和 5% CO₂₂/95% 空气
8. 加入 500 µ将 VPM 的 L 加入每支试管中，通过在 500 x g 4 ℃下离心3分钟 °C. 再完成两次洗涤，共计三次洗涤。吸除上清液，并将细胞重悬于1 mL VPM中。
9. 计算总细胞接种体积（200 µL/伪胰岛）。将VPM（计算的细胞接种体积减去2 mL）加入适当大小的锥形管中。将步骤1.7中获得的转导细胞悬液加入该锥形管中。保持锥形管略微开启，但不要完全密闭，以允许细胞进行气体交换。
10. 用1 mL VPM冲洗1.5 mL离心管（来自步骤1.7），并将内容物转移至锥形管中，此时锥形管应含有总的细胞接种体积。
11. 用电动移液器反复吹打锥形管中的溶液以充分混匀，然后将内容物转移至无菌试剂储液槽中。如果储液槽无法容纳全部的细胞接种体积，则分次进行转移，并确保每次转移前细胞悬液均充分混匀。
12. 使用多通道P200移液器，将试剂储液槽中的细胞悬液上下吹打3至4次以确保均匀，然后移取200 µ将细胞悬液各 1 L 加入微孔板的每个孔中。
13. 将伪胰岛置于37℃的组织培养孵育箱中孵育 °C 和 5% CO₂₂/95% 空气中培养 6 天，期间不更换培养基。至第 6 天，伪胰岛应已完全形成，可进行后续实验（图1B-D).

2. 活细胞成像与微灌流实验的准备工作（实验前一天）

注意：微灌注培养基制备的相关信息可通过 protocols.io 资源获取（https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html）。

1. 使用多通道移液器从96孔板中转移伪胰岛至无菌培养皿中，以收获伪胰岛。随后手动挑选伪胰岛，并将其转移至另一含有新鲜VPM的无菌培养皿中。将伪胰岛置于37 °C、5% CO₂/95%空气的组织培养孵育箱中过夜孵育。
2. 通过向1 L超纯水中加入1 g牛血清白蛋白（放射免疫分析级）、0.11 g丙酮酸钠、0.58 g L-谷氨酰胺、3.2 g碳酸氢钠、1.11 g HEPES以及1瓶DMEM，配制1 L DMEM培养基。在DMEM中配制1 M葡萄糖储备液。将上述两种溶液于4 °C下保存过夜。
3. 在实验前一天检查微灌流系统的流速。按照图2A-B所示，将所有管路连接至含有空微流控芯片的芯片支架。使用超纯水作为流出液，确认在组分收集器处的流速为100 µL/min。

3. 在实验当天向 DMEM 中添加促分泌剂

1. 在 DMEM 中加入 0.07 mg/mL 抗坏血酸，并使用 1 M 葡萄糖储备液将促分泌物配制于含抗坏血酸的 DMEM 缓冲液中。
   注：抗坏血酸用于通过防止肾上腺素氧化而使其保持稳定。若不使用肾上腺素，可从DMEM中省略抗坏血酸。
2. 将促分泌剂通过 0.22 μm 滤膜过滤两次 µm孔滤膜，每次使用新的滤膜。将溶液加热至37 °C，并测量葡萄糖 通过 使用血糖仪确认所需浓度。

4. 微灌流装置的设置

1. 将共聚焦激光扫描显微镜的环境室预热至 37 °C，确保所有门均已关闭，且环境室内温度保持稳定。将装有微芯片的芯片架放入环境室中预热。使用红外测温枪验证芯片的温度。
   注意：本实验中，环境室设定为 38.5 °C，以确保芯片温度达到 37 °C。
2. 将所有管路连接至芯片架（如图 2A-B所示）。用基础分泌刺激剂冲洗管路 5 分钟。本研究中，使用 2 mM 葡萄糖（G 2）进行冲洗。每进行 8–10 次实验后更换去泡器中的气泡捕获膜。

5. 将类胰岛载入微流控芯片

1. 在加载微流控芯片之前，对实验中将使用的拟胰岛拍摄明场和暗场图像（10倍放大），用于后续胰岛当量（IEQ）的定量。
   注意：IEQ用于将激素分泌数据归一化，以消除不同实验间胰岛数量差异的影响。此步骤也可在实验前一天完成。
2. 吸除微流控芯片上下两部分的多余液体。芯片上半部分含有垫圈，可确保每个孔的密封性；下半部分含有带玻璃盖玻片的孔。用5 µL DMEM预润湿芯片中的一个孔，移液时应沿孔的外缘操作，以润湿缝隙。
3. 使用预润湿的移液枪吸取23 µL体积中的30–32个拟胰岛，并缓慢将拟胰岛注入芯片底部组件的孔中心。检查移液枪头是否有残留的拟胰岛。
4. 使用加样枪头轻轻将拟胰岛移至孔的中心位置，以确保在成像视野中捕获尽可能多的拟胰岛。
5. 在体视显微镜下拍摄芯片中拟胰岛的图像。此计数结果将用于校正该过程中可能发生的拟胰岛损失，从而调整计算所得的IEQ。
   1. 若步骤5.3中的所有拟胰岛未全部加载至芯片中，需相应调整IEQ。例如，若当前观察到30个拟胰岛，而步骤5.1中观察到32个，则基于步骤5.1的图像计算IEQ，再乘以30/32。
6. 将芯片的底部放入芯片支架中。小心地将芯片上半部分盖上，确保绿色垫圈一侧朝下。
7. 在固定芯片位置的同时，轻轻合上芯片支架，以夹紧芯片。此过程中避免施加过大压力，否则可能导致孔内液体移位，造成拟胰岛损失。同时应避免将气泡引入孔中。

6. 同步活细胞成像与微灌流

1. 将促分泌剂、泵和装在支架中的微流控芯片转移至安装在共聚焦显微镜上的环境培养室中。将流出管路从培养室引出，连接至组分收集器。
   1. 将缓冲液放入带有钻孔瓶盖的15 mL圆锥形试管中。这些孔可防止收集管从试管中滑出。
   2. 将管路拧入脱气装置时，先将螺母和卡套分开，然后再拧入脱气装置。这样可防止管路扭曲。
2. 将组分收集器设置为每2分钟旋转一次。根据洗涤步骤和实验所需组分的数量，向组分收集器中装入相应数量的收集管。本实验使用了15个洗涤管（总计30分钟洗涤）和28个用于收集组分的试管。
3. 启动泵，以100 μL/min的流速输送含有基础葡萄糖浓度的基线培养基 µ升/分钟（以100升/分钟流速收集2分钟） µL/min 流速导致 200 µ每根收集管收集流出液的体积为 L。选择该流速是为了限制对伪胰岛的剪切应力，并防止活体成像过程中伪胰岛发生明显移动。
   1. 当液体流经装置时，请注意观察以下事项：
      1. 观察馏分收集器喷嘴末端的液滴，这表明系统中有液体流过。
      2. 注意观察系统流出量的减少；如果出现 <200 µL 出现在收集管中，表明系统可能存在堵塞或泄漏。参见 表 2 有关灌流液体积减少的可能原因、解决方案及预防建议的列表。
4. 当流出管路中的培养基流速稳定后，旋转组分收集器头部以将液体分配至各收集管中，并启动组分收集器。收集前15个组分（30分钟）作为洗涤液，使伪胰岛达到平衡状态。利用这前15个组分确认系统内培养基流动的持续性与准确性。随后弃去这些组分。
5. 在30分钟洗涤期间，根据以下参数设置显微镜以进行活细胞成像：物镜：U Plan Fluorite 20×，放大倍数1×；荧光通道：EGFP（发射波长＝510 nm，激光波长＝488，检测波长＝500–600 nm）；时间序列：整个实验期间（即56分钟）每2秒采集一次图像；采样速度：2 µs/像素
   1. 在视野中确定伪胰岛的底部，并将焦平面调整至15 µm 高于此位置。该位置将作为整个成像实验的参考帧。
6. 30分钟洗涤结束后，开始收集洗脱组分并进行成像采集。
   注意：应尽一切努力在执行此步骤前识别并纠正所有问题。一旦开始数据采集，实验中的任何中断或对促分泌剂的过度暴露均可能对结果产生不利影响。
7. 用基础培养基持续灌流伪胰岛，维持第一阶段基础值采集的整个过程，并将流出液收集至1.5 mL离心管中。根据实验设计的时间点，手动将管路从基础缓冲液切换至新的刺激缓冲液管路。
   1. 标准的微灌流序列如图所示 表3.
   2. 收集约10个组分后，将所有组分转移至一个4 °C冰箱中，直至实验结束，以防止激素（尤其是胰高血糖素）降解。
   3. 在整个实验过程中，通过检查每根管子中的流出液体积，持续监测系统的流速。
8. 实验结束后，切换回基础培养基，并让泵继续运行5分钟，以用基础培养基（此处为2 mM葡萄糖）冲洗掉刺激物。
9. 停止泵运行，断开去泡器和组分收集器处的微流控芯片支架管路，将微流控芯片支架从环境培养室中取出。取出微流控芯片后立即关闭所有门，以维持温度。
10. 将灌流液储存在 −80 °用于后续激素分析。

7. 伪胰岛酸性乙醇提取

1. 小心打开微流控芯片 holder，并取下芯片顶部。使用移液器和台式显微镜从孔中挑选伪胰岛并转移至一个 1.5 mL 离心管中。如有需要，使用台式显微镜确认所有伪胰岛均已收集。
   1. 在从孔中取出伪胰岛之前，先对微流控芯片中的伪胰岛拍摄最终图像，以调整胰岛当量（IEQ），方法类似于步骤 5.5。
2. 用 500 µL PBS 洗涤两次。每次洗涤后，在 94 x g 条件下离心 1 分钟，并吸除上清液。
3. 最后一次洗涤去除后，加入 200 µL 酸性乙醇（5.5 mL 95% 乙醇 + 50 µL 12 N HCl）。于 4 °C 下过夜保存。
4. 次日，在 15,989 x g 及 4 °C 条件下离心提取物 10 分钟，将提取物分装为每管 45 µL 至三个新离心管中。于 −80 °C 保存，用于激素含量分析。作为将激素分泌量归一化至 IEQ 的替代方法，也可根据提取物测得的伪胰岛激素含量对激素分泌量进行归一化。

8. 附加实验与清理工作

1. 重复步骤5-7，对后续各组伪胰岛进行操作，以获得额外的技术重复样本。
2. 完成所有微灌流实验后，将10%次氯酸钠溶液以5分钟流经微芯片和管路，随后用超纯水冲洗30分钟，以对管路进行消毒。

9. 数据分析

注意：活细胞成像使用激光扫描共聚焦显微镜进行。图像采用显微镜配套的成像软件包进行分析。以下为一般性操作指南，具体步骤可能因显微镜制造商和图像采集软件的不同而有所差异。

1. 确定用于数据标准化的总胰岛当量（IEQ）
   1. 打开软件程序，点击窗口右上角的采集选项卡。在宏管理器（查看 > 工具窗口 > 宏管理器）中选择批量烧录功能，对所有暗场图像进行批量烧录。
      1. 若要一次性烧录多张图像，请在点击宏管理器中的运行按钮之前，先点击切换批量模式按钮。根据屏幕提示选择源图像位置和烧录后图像的保存位置。图像文件类型请选择标记图像文件格式 (*.tif)。
   2. 进行IEQ测量时，打开步骤5.1中获取的10倍暗场图像的烧录版本。点击顶部的计数与测量选项卡，然后在左侧选择手动HSV阈值按钮。
      1. 使用吸管工具添加或删除阳性区域（红色），直到每个伪胰岛均被红色高亮显示，且不超出伪胰岛边界。然后点击计数与测量。
   3. 使用自动分割或手动分割功能，将粘连在一起的伪胰岛分开。
      1. 若需手动分割伪胰岛，请选择手动分割功能，左键点击绘制分割线，再右键点击完成线条绘制。若使用自动分割，请选择自动分割功能，然后点击需要分割的成组伪胰岛。分割完成后需确认分割结果正确。
   4. 在批量烧录的图像中，比例尺和放大倍数文字可能被标记为阳性区域。为确保计数准确，请使用鼠标选中这些文字和比例尺，然后按键盘上的删除键将其删除。
   5. 切换滤波功能的开启与关闭状态，确认所有伪胰岛均已被正确计数。也可将文件在程序外打开以进行交叉核对。完成后，点击导出至Excel。
   6. 打开电子表格，并按以下方式修改。
      1. 删除底部的计数、均值和排序信息。根据平均直径对对象进行排序。在平均直径列后插入一列，并将该列命名为“伪胰岛计数”。
      2. 胰岛计数由各索引范围内具有相应平均直径的伪胰岛数量决定。将每个索引对应的伪胰岛数量乘以相应的IEQ换算系数，然后将这些值相加，得到总IEQ。应在每次实验前获取的图像上进行IEQ计算。使用以下索引及IEQ换算系数：
         1–49 µm：× 0.167
         50–100 µm：× 0.667
         101–150 µm：× 1.685
         151–200 µm：× 3.500
         201–300 µm：× 6.315
         301–350 µm：× 10.352
      3. 有关IEQ计数的示例电子表格，请参见补充文件1。
2. 在软件中进行活细胞成像定量分析
   1. 在cellSens中打开目标文件（.oir）。
   2. 按以下方式指定感兴趣区域（ROI）。
      1. 使用绘图工具指定ROI（即每个伪胰岛）。若使用手绘工具，右键点击以闭合图形。
      2. 使用箭头工具拖动选中图像中所有ROI。在所有ROI被选中后，右键点击并选择转换为随时间变化的动态ROI。
      3. 播放XYT文件，确认ROI在时间序列中的准确性。若在某一时间段ROI不准确，请在该时间段调整其大小或位置。软件将随时间逐渐调整ROI的大小和位置以匹配这些变化。重复上述步骤，直至ROI在整个成像实验过程中均保持准确。
   3. 对每个ROI进行强度测量，步骤如下。
      1. 在工具栏中点击测量强度分布。选中需要分析的ROI；按住Shift键并点击可选择多个ROI。
         注：虽然软件中可同时打开多个文件，但每次仅分析一个文件中的ROI。
      2. 为消除背景噪声影响，选择一个恒定值从每个强度值中减去，或指定一个ROI作为背景区域。点击执行。
      3. 在强度分布工具栏中，点击导出至Excel以导出数据。
      4. 将所有数据点归一化至7–8分钟期间测得强度的平均值（即第一次基础灌流介质灌流的最后1分钟）。每个时间点的这些归一化值定义为相对cADDis强度。有关成像数据分析与归一化的示例电子表格，请参见补充文件2。
3. 测定各组分及胰岛提取物中的激素分泌量。在本实验中，胰岛素和胰高血糖素浓度通过ELISA测定。使用步骤9.1中确定的IEQ测量值或提取物激素含量，将各组分中的激素分泌量归一化至伪胰岛体积。

结果

表达生物传感器的人源伪胰岛被构建 通过 腺病毒递送编码cAMP生物传感器cADDis的构建体（图1A). 图1B 显示了转导的人胰岛细胞随时间推移的再聚集过程，培养6天后可观察到完全形成的拟胰岛。转导细胞在48小时内开始出现明显的cADDis荧光信号，至培养结束时，转导细胞中生物传感器表达水平较高。采用本方案，拟胰岛中α细胞的平均转导效率为60%，β细胞为95%（图1C-D).

集成的微流控与活细胞成像平台在 图2收获表达cADDis的拟胰岛并将其在新鲜培养基中孵育过夜后，将拟胰岛加载至微流控芯片预润湿孔的中央。将芯片固定于夹具中并置于显微镜载物台上。在连接于显微镜的环境培养室中（温度维持在37 °C），通过去气泡装置向芯片内泵入含有α细胞和β细胞促分泌剂的培养基，以对拟胰岛进行灌流，防止气泡进...

讨论

将微灌流系统、表达生物传感器的伪胰岛和激光扫描共聚焦显微镜相结合，可实现对细胞内信号传导事件与动态激素分泌谱的同步评估。该动态微灌流系统能够向伪胰岛递送一系列明确定义的刺激，并允许收集流出液，其中胰岛素和胰高血糖素浓度可通过市售的ELISA试剂盒进行测定。与此同时，利用共聚焦显微镜平台对表达生物传感器的伪胰岛进行活细胞成像，可捕捉生物传感器荧光活性的实时变化，从而反映细胞内信号传导事件。对生物传感器信号与激素分泌谱进行随时间的同步测量，为直接比较细胞内信号传导事件对胰岛激素分泌的影响提供了可能。

成功实施本方案需考虑多个关键因素，包括生成表达生物传感器的伪胰岛，并在每次实验过程中保持恒定流速且避免伪胰岛移动。当流速为100 µL/min、每2分钟收集一次组分时，每份灌流液的体积应为200 µL，波动不应超过10 µL/份。此外，尽管成像软件可对视野内XY平面的轻微伪胰岛移动进行校正，但在微灌流实验过程中若伪胰岛移出视野，则无法进行后续分析。因此，实验早期及时发现任何泄漏或移动至关重要，以便及时采取措施解决问题。潜在挑战及其常见原因、解决方案和预防建议汇总如下 表2<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ad-CMV-cADDis	Welgen	不适用
0.01” FEP 管	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	富集型CMRL培养基组分
1.5 mL 离心管和锥形管	任何	任何
10 μm PTFE 滤膜	Cole-Parmer	SK-21940-41	每8-10次运行后更换
100 mM 丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	11360070	富集型CMRL培养基组分
190 proof 乙醇	Decon 实验室	2816	酸性乙醇组分
200 mM GlutaMAX-I 补充剂	Gibco	35050061	富集型CMRL培养基组分
抗坏血酸	Sigma	A5960	DMEM 灌流缓冲液组分
牛血清白蛋白	Sigma	A7888	DMEM 灌流缓冲液组分
气泡捕集器	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96孔微孔板	Perkin Elmer	6055330
cellSens 分析软件	Olympus	v3.1	用于数据分析的软件
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	富集型CMRL培养基组分
锥形接头（IDEX，P-794）	IDEX	P-794
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7528	葡萄糖缓冲液组分
DMEM	Sigma	D5030	DMEM 灌流缓冲液组分
环境舱	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	刺激缓冲液组分
胎牛血清（FBS），热灭活	Sigma	12306C	富集型CMRL培养基组分
胰高血糖素ELISA	Mercodia	10-1281-01
胰高血糖素检测试剂盒 HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl（12 N）	任何	任何	酸性乙醇组分
HEPES	Sigma	H7523	DMEM 灌流缓冲液组分
iCell 内皮细胞培养基添加剂	细胞动态	M1019	iEC 媒体组件
Idex Derlin 螺母 && 卡套 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
胰岛素ELISA	Mercodia	10-1113-01
异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）	Sigma	I5879	刺激缓冲液组分
激光扫描共聚焦显微镜	Olympus	FV3000
L-谷氨酰胺	Sigma	G8540	DMEM 灌流缓冲液组分
微流控芯片（迈阿密大学，FP-3W）	迈阿密大学	FP-3W
微芯片支架	Micronit 微流控	FC_PRO_CH4525
Model 2110 馏分收集器	伯乐（Bio-Rad）	7318122
P10、P200 和 P1000 移液器及吸头	任何	任何
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122	富集型CMRL培养基组分
蠕动泵	Instech	P720
磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144	洗涤胰岛
Sarstedt 培养皿	Sarstedt	取决于培养皿直径
碳酸氢钠	Sigma	S6014	DMEM 灌流缓冲液组分
丙酮酸钠	Sigma	P2256	DMEM 灌流缓冲液组分
体视显微镜	Olympus	SZX12
Steriflip 滤器（0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	将所有缓冲液过滤两次
VascuLife VEGF 培养基完全套装	LifeLine 细胞科技	LL-0003	iEC 媒体组分