本方案描述了一种利用腺病毒递送环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器和cAMP差异检测器，对原代人源拟胰岛中细胞内信号传导事件与胰岛素及胰高血糖素分泌进行同步采集与共定位分析的方法。 原位 （cADDis）和微型灌流系统。
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方法文章
用于同步评估荧光生物传感器动态与激素分泌谱的人类伪胰岛系统
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
胰岛朗格汉斯细胞是散布于胰腺中的微小三维内分泌细胞团，由特化的内分泌细胞和支持细胞组成，在通过β细胞分泌胰岛素降低血糖以及α细胞分泌胰高血糖素升高血糖的过程中，对葡萄糖稳态的调控起着核心作用。细胞内信号通路（包括由cAMP介导的通路）对于α细胞和β细胞激素的调控性分泌至关重要。尽管三维胰岛结构对于胰岛功能的协调运作必不可少，但它为研究原代人胰岛细胞中细胞内信号通路的机制带来了实验上的挑战。为克服这些挑战和局限性，本方案描述了一种整合了活细胞成像与微流控技术的平台，该平台使用来自无糖尿病供体的原代人源拟态胰岛（pseudoislets）构建，其形态、细胞组成和功能均类似于天然胰岛。这些拟态胰岛通过原代人胰岛细胞的分散与再聚集过程实现尺寸控制。在细胞分散状态下，可对胰岛细胞的基因表达进行操控；例如，可导入生物传感器，如基因编码的cAMP生物传感器cADDis。一旦形成表达基因编码生物传感器的拟态胰岛，结合共聚焦显微镜与微灌流平台，即可同步评估荧光生物传感器的动态变化以及α细胞和β细胞的激素分泌谱，从而更深入地揭示细胞过程与功能机制。
引言
胰岛是散布在胰腺中的微型器官，其功能对维持葡萄糖稳态至关重要。当葡萄糖被代谢后，可导致ATP/ADP比值升高，ATP敏感性钾通道关闭，细胞膜去极化以及细胞外钙离子内流，从而促使β细胞分泌胰岛素1。α细胞分泌胰高血糖素的机制尚不完全清楚，但已有研究推测，细胞内信号通路及旁分泌通路可能参与调控胰高血糖素颗粒的胞吐过程2,3,4。1型和2型糖尿病均与胰岛细胞功能障碍相关5,6,7。因此，阐明介导胰岛激素分泌的细胞内信号通路，对于理解胰岛生理及病理机制至关重要。
胰岛的球形结构给实验带来了一定的困难，这些挑战包括胰岛大小的差异性以及其三维结构，后者会降低病毒对胰岛核心区域的转导效率8,9。为克服这些难题，研究人员开发了一种拟胰岛系统，该系统将原代人胰岛分散为单个细胞，通过腺病毒载体将编码目标分子的构建物转导至细胞中，随后重新聚集形成大小可控、类似胰岛结....
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方案
人胰岛（N = 4 批次）通过与综合胰岛分配计划、人类胰腺分析计划、Prodo Laboratories, Inc. 和 Imagine Pharma 合作获得。范德堡大学机构审查委员会认为，去标识化的人胰腺标本不属于涉及人的研究。本研究离不开器官捐献者、其家属以及器官获取组织的支持。捐赠者的人口统计学信息见表1。来自无糖尿病胰腺捐献者的胰岛在冷缺血时间少于15小时的条件下被分离获得。
1. 伪胰岛形成（详见 Walker 等人7）
- 使用 P200 移液器和台式显微镜获取并手工挑选原代人胰岛，注意避免移液器吸头接触胰岛培养基（10% FBS，100 µg/mL 链霉素，100 U/mL 青霉素，2 mM L-谷氨酰胺的 CMRL 1066 培养基
- 将原代胰岛转移至15 mL离心管中，后续所有拟胰岛形成步骤均在组织培养罩内进行，以防止污染。使用P1000移液器在室温下用0.025%胰蛋白酶消化原代胰岛7分钟，使其缓慢解离。随着胰岛开始解聚，溶液将变得浑浊。
- 在这些研究中，选取200–300个手工挑选的原代胰岛，其直径约为200 µm 分散于 500 µ0.025% 胰蛋白酶处理可获得一至两块96孔板的拟胰岛；具体数量可能因平均胰岛大小....
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结果
表达生物传感器的人源假胰岛被构建 通过 腺病毒递送编码cAMP生物传感器cADDis的构建体（图1A). 图1B 显示了转导的人类胰岛细胞随时间推移的再聚集过程，培养6天后可观察到完全形成的拟胰岛。转导细胞在48小时内开始出现明显的cADDis荧光信号，至培养结束时，转导细胞中生物传感器的表达水平较高。采用本方案，拟胰岛中α细胞的平均转导效率为60%，β细胞为95%图1C-D).
集成的微流控与活细胞成像平台在 图2收获表达cADDis的假胰岛并将其在新鲜培养基中过夜孵育后，将假胰岛加载至微流控芯片预润湿孔的中央。随后将芯片固定于夹具中，并置于显微镜载物台上。显微镜所连接的环境培养室维持在 37 °C，将含有α和β细胞促分泌剂的培养基对类胰岛进行灌流，培养基经除泡器泵入系统，以防止气泡进入。微芯.......
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讨论
将微灌流系统、表达生物传感器的伪胰岛和激光扫描共聚焦显微镜相结合，可实现对细胞内信号传导事件与动态激素分泌谱的同步评估。该动态微灌流系统能够向伪胰岛递送一系列明确定义的刺激，并允许收集流出液，其中胰岛素和胰高血糖素浓度可通过市售的ELISA试剂盒进行测定。与此同时，利用共聚焦显微镜平台对表达生物传感器的伪胰岛进行活细胞成像，可捕捉生物传感器荧光活性的实时变化，从而反映细胞内信号传导事件。对生物传感器信号与激素分泌谱进行随时间的同步测量，为直接比较细胞内信号传导事件对胰岛激素分泌的影响提供了可能。
成功实施本方案需考虑多个关键因素，包括生成表达生物传感器的伪胰岛，并在每次实验过程中保持恒定流速且避免伪胰岛移动。当流速为100 µL/min、每2分钟收集一次组分时，每份灌流液的体积应为200 µL，波动不应超过10 µL/份。此外，尽管成像软件可对视野内XY平面的轻微伪胰岛移动进行校正，但在微灌流实验过程中若伪胰岛移出视野，则无法进行后续分析。因此，实验早期及时发现任何泄漏或移动至关重要，以便及时采取措施解决问题。潜在挑战及其常见原因、解决方案和预防建议汇总如下 表2<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢器官捐献者及其家属所作出的宝贵捐献，同时感谢国际器官获取组织研究所（International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine，IIAM）和国家疾病研究交换中心（National Disease Research Exchange，NDRI）在推动人类胰腺组织用于科研方面所开展的合作。本研究工作得到了人类胰岛研究网络（Human Islet Research Network，RRID:SCR_014393）、人类胰腺分析项目（Human Pancreas Analysis Program，RRID:SCR_016202）、DK106755、DK123716、DK123743、DK120456、DK104211、DK108120、DK112232、DK117147、DK112217、EY032442以及DK20593（范德比尔特糖尿病研究与培训中心）、Leona M. 和 Harry B. Helmsley 慈善信托基金、JDRF、美国退伍军人事务部（BX000666）、美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（NIGMS，T32GM007347）、F30DK134041、F30DK118830以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金（1937963）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | 不适用 | |
| 0.01” FEP 管 | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | 富集型CMRL培养基组分 |
| 1.5 mL 离心管和锥形管 | 任何 | 任何 | |
| 10 μm PTFE 滤膜 | Cole-Parmer | SK-21940-41 | 每8-10次运行后更换 |
| 100 mM 丙酮酸钠 | 赛默飞世尔科技 | 11360070 | 富集型CMRL培养基组分 |
| 190 proof 乙醇 | Decon 实验室 | 2816 | 酸性乙醇组分 |
| 200 mM GlutaMAX-I 补充剂 | Gibco | 35050061 | 富集型CMRL培养基组分 |
| 抗坏血酸 | Sigma | A5960 | DMEM 灌流缓冲液组分 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7888 | DMEM 灌流缓冲液组分 |
| 气泡捕集器 | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96孔微孔板 | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens 分析软件 | Olympus | v3.1 | 用于数据分析的软件 |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | 富集型CMRL培养基组分 |
| 锥形接头（IDEX，P-794） | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7528 | 葡萄糖缓冲液组分 |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM 灌流缓冲液组分 |
| 环境舱 | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | 刺激缓冲液组分 |
| 胎牛血清（FBS），热灭活 | Sigma | 12306C | 富集型CMRL培养基组分 |
| 胰高血糖素ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| 胰高血糖素检测试剂盒 HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl（12 N） | 任何 | 任何 | 酸性乙醇组分 |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM 灌流缓冲液组分 |
| iCell 内皮细胞培养基添加剂 | 细胞动态 | M1019 | iEC 媒体组件 |
| Idex Derlin 螺母 && 卡套 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| 胰岛素ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| 异丁基甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma | I5879 | 刺激缓冲液组分 |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Olympus | FV3000 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | G8540 | DMEM 灌流缓冲液组分 |
| 微流控芯片（迈阿密大学，FP-3W） | 迈阿密大学 | FP-3W | |
| 微芯片支架 | Micronit 微流控 | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 馏分收集器 | 伯乐（Bio-Rad） | 7318122 | |
| P10、P200 和 P1000 移液器及吸头 | 任何 | 任何 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | 富集型CMRL培养基组分 |
| 蠕动泵 | Instech | P720 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14190-144 | 洗涤胰岛 |
| Sarstedt 培养皿 | Sarstedt | 取决于培养皿直径 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S6014 | DMEM 灌流缓冲液组分 |
| 丙酮酸钠 | Sigma | P2256 | DMEM 灌流缓冲液组分 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip 滤器（0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | 将所有缓冲液过滤两次 |
| VascuLife VEGF 培养基完全套装 | LifeLine 细胞科技 | LL-0003 | iEC 媒体组分 |
参考文献
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alph....
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重印与许可
