本方案描述了一种用于体外循环（CPB）的新生仔猪模型，通过循环和心脏停搏来研究由体外循环引起的严重脑损伤及其他继发性并发症。
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本文内容
摘要
摘要
先天性心脏病（CHD）是最常见的先天性畸形，全球每年约有100万新生儿受其影响。对该疾病进行全面研究需要合适且经过验证的动物模型。由于猪仔的解剖结构和生理特征与人类相似，常被用于转化医学研究。本研究旨在建立并验证一种用于新生儿猪仔的心肺转流（CPB）联合循环和心脏停搏（CA）模型，以作为研究心脏手术所致严重脑损伤及其他并发症的工具。除了提供详细的材料清单外，本研究还为其他研究人员规划和实施该实验方案提供了路线图。在经验丰富的操作人员完成多次试验后，该模型的代表性结果显示成功率达到92%，失败原因主要为猪仔体型过小及血管解剖结构变异。此外，该模型允许研究者选择多种实验条件，包括不同的心脏停搏时间、温度变化以及药物干预措施。总之，该方法所用材料在大多数医院环境中均易于获取，具有良好的可靠性与可重复性，可广泛应用于接受心脏手术的儿童相关转化医学研究中。
引言
先天性心脏病（CHD）是最常见的先天性畸形，全球每年约有百万例新生儿受此影响 1。尽管心胸外科手术（CTS）和重症监护治疗的现代进展已显著改善了患者的死亡率，但合并症仍极为普遍2,3,4,5。据报道，约25%–50%的此类患者存在神经发育异常，包括认知和运动功能障碍以及学习障碍6,7,8。生命最初数天内进行的手术，尤其是需要循环和心脏停搏（CA）的手术，已被证实会增加发病风险9。手术期间的血流动力学改变可能对发育中新生儿脆弱的大脑产生重要影响。建立实验模型对于深入理解这些异常的起源，并探索改善患者预后的神经保护策略至关重要。
利用动物模型研究这一群体已有大量文献报道5,10,11,12,13,14。值得注意的是，仔猪是一个极佳的选择，因其在心脏解剖结构（图1）、基因组和生理学方面与人类高度相似，且相较于其他动物模型具有相对较大的体型15（图2）。已有研究描述了使用仔猪模型来研究体外循环（CPB）和深低温停循环（CA）的影响。这些实验动物模型有助于研究血流动力学变化及相关终末器官并发症14,16,17,18,19,20。这些模型的建立使研究人员能够在受控环境中研究人类疾病状态，并可根据多种实验条件灵活调整。大多数研究报道采用中心插管技术，该技术需要高超的外科操作技能，资源消耗较高，且难以保证长期存活率。尽管已有研究记录了仔猪在体外循环研究中的应用12,15，但提出外周插管技术的研究仍较少。
与已发表的其他研究相比，这种新的外周插管技术更简便、创伤更小，且可行性更高19。此外，在新生儿和小型动物中验证该技术具有创新性，所有希望利用动物模型研究先天性心脏病（CHD）及其相关共病的研究人员均应考虑采用该方法。该技术特别适用于那些能够使用配备有相应耗材、资源以及具备动物模型实验经验人员的实验室的研究者。
综上所述，本研究的主要目的是描述并验证一种带有心脏停搏的新生仔猪体外循环模型。该方案旨在通过不同的实验条件，在受控环境中研究体外循环手术引起的严重脑损伤及其他可能的并发症。该方法提供了一种具有可推广性、可靠性高且质量优良的模型，可用于多种实验方案。
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方案
本实验程序已获得加泰罗尼亚比较医学与生物影像中心（CEEA-CMCiB）动物实验伦理委员会（CEEA）的批准。加泰罗尼亚政府也授权了本实验方案（编号11652），档案识别号为FUE-2022-02381434，ID号为QBXQ3RY3J。所有实验操作均由经验丰富的专业人员完成，包括持证兽医提供监督与协助。本研究使用了4至6日龄、体重2.5–3.5 kg的仔猪（Sus scrofa domestica）。实验中尽量平衡性别分布，以避免相关偏差。
1. 镇静、插管与通路建立
- 使用肌内注射氯胺酮（20 mg/kg）、右美托咪定（0.02 mg/kg）和咪达唑仑（0.3 mg/kg）开始镇静和镇痛。动物在给予预麻醉药物后5分钟达到深度镇静状态时，以100%氧气供氧2 通过鼻面罩（2 L/min）给氧。随后，静脉注射丙泊酚（0.5 mg/kg）诱导麻醉（参见 材料表).
- 将仔猪置于仰卧位。使用带套囊的2.5 mm气管导管进行经口插管（参见 材料表），通过直接观察气管实现。
- 确认气管插管位置正确 通过 直接听诊肺底。
- 将机械通气设置为呼吸频率30次/分钟，潮气量8-12 mL/kg，呼气末正压4 cmH₂O2O.
- 在实验过程中持续监测麻醉深度 通过 心率（HR）、血压（BP）和血氧饱和度（spO2）。根据需要调整通气和镇静参数。
注意：生命体征的理想值为心率 130-160 次/分钟，血压 75-95/60-70，血氧饱和度 spO2 > 85. - 以1.5%七氟烷和芬太尼（25–200 µg/kg/min）维持麻醉（参见 材料表).
- 使用直接可视化方法将导管置入股动脉（3 Fr）和股静脉（4 Fr）（参见 材料表).
注意：这些导管将用于给药和样本采集，因此保持导管通畅至关重要。
2. 体外循环管路的安装与预充
- 按照以下步骤定制并设置体外循环（CPB）管路（见图3）：
- 在确保管路仍能从机器连接至动物的前提下，尽可能缩短管路长度。
- 制作并连接一段管路桥，将膜式氧合器（见材料表）的流出端与泵的流入端相连。
注意：该管路桥至关重要，可在对动物进行冠状动脉造影（CAs）时维持血液在机器中的持续循环。
- 所有连接点密封后，先用300 mL肝素-生理盐水溶液（1,000 IU肝素溶于1 L生理盐水）和300 mL新鲜供体猪血预充管路 ，随后加入3.5 mEq碳酸氢钠、350 IU肝素和450 mg葡萄糖酸钙（见材料表）。
- "冲洗"管路：以0.3 L/min的流速将血液、肝素-生理盐水、碳酸氢钠和葡萄糖酸钙的混合液在整条管路中循环运行2分钟。
3. 手术与体外循环启动
注意：补充图1展示了套管植入所需的手术材料。
- 暴露左侧颈内静脉和右侧颈总动脉，以备插管图4).
- 对于插管，使用塞丁格（Seldinger）或 "经导丝" 技术21.
- 首先，将针套管插入左侧颈内静脉。一旦观察到回血，小心地将导丝插入血管，然后撤出针头，确保导丝保持在原位。
- 沿导丝将扩张器插入血管，然后撤出扩张器。
- 导丝保持原位，将8 Fr静脉导管套入并缓慢推进约4 cm进入血管。小心拔出导丝，确保导管保持在原位。
- 采用Seldinger导丝技术，经扩张后置入6 Fr小儿动脉导管（参见 材料表通过右侧颈动脉注入。
- 动脉插管时，静脉推注肝素（50 IU/kg） 通过 新放置的动脉导管。
- 穿刺成功后，使用3-0可吸收缝线和胶带将两根导管牢固固定于动物体表，以防意外脱落（图5).
- 将套管连接至体外循环（CPB）管路，确保在连接部位加入含肝素的生理盐水，以防止管路中进入空气。
- 将初始流速设定为80-85 mL/kg/min，并缓慢增加至最终流速150 mL/kg/min。
注意：动物在体外循环（CPB）上的时间可根据实验需求延长。示意图 步骤1-3的示意图如图所示 补充图2.
4. 循环和心脏骤停（CA）
- 为诱导心脏停搏，给予 9 mEq 的 KCl。通过生命体征评估停搏是否完全，并通过超声心动图确认。根据需要追加 KCl。
- 心脏停搏后，将动物与体外循环系统分离，以诱导循环停止。
- 使用先前所述的桥接装置（步骤 3.5），以 1,500 rpm 的转速维持体外循环（CPB）系统的灌注流量。
5. 体外心肺复苏（eCPR）
- 一旦达到适当的CA条件（0分钟、30分钟或60分钟），即开始eCPR复苏。
- 将仔猪重新连接至体外循环（CPB）管路。
- 注射3 mL葡萄糖酸钙（2.25 mmol/10 mL，1:2稀释）和6 mL碳酸氢钠（1 M，1:2稀释） 通过 外周动脉通路，根据需要追加剂量。
注意：必要时可使用心脏复律或正性肌力药物（肾上腺素或多巴胺）。
6. 术后护理
- 复苏后，监测生命体征15分钟以确保稳定。
注：重症监护期间的理想参数为：心率100–150次/分钟，血压75–95/60–70 mmHg，血氧饱和度 spO2 > 85。 - 将动物转移至进行磁共振成像（MRI）。
注：成像结束后，动物未再恢复意识，随后在麻醉状态下通过静脉注射戊巴比妥钠实施安乐死，以获取脑组织样本用于组织学分析。实验流程的时间线，包括样本采集策略，详见补充图3。
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结果
在6个月期间，由儿科重症监护医师、儿科心脏病专家、兽医和技师组成的跨学科团队共实施了12次完整方案补充图2 和 补充图3).
图1 和 图2 展示了本实验方案所用动物的预期解剖结构。纳入的仔猪平均日龄为4.8天（4–6天），平均体重为2,814 g（2,400–3,140 g），其中雌性占42%。所有仔猪均成功完成镇静和气管插管。从镇静到插管的平均时间为3.2小时（1.75–3.72小时）。在92%的实验中成功实现了血管插管及体外循环（CPB）联合深低温停循环（CA）。唯一一次失败发生在插管过程中，可能与仔猪体型较小及血管解剖结构变异有关（表1）。从给予氯化钾（KCl）至心脏停搏的平均时间为2分钟（1–6分钟），从体外心肺复苏（eCPR）开始至心跳恢复的平均时间为12分钟（3–28分钟）。这些结果为选择适合本方案的动物提供了理想特征参考，并为操作者提供了实验成功率的预估依据。同时，也明确了心脏停搏...
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讨论
体外循环在成人、儿童和新生儿的心脏手术中常用。它依赖于由电机驱动的体外循环管路和膜式氧合器，二者协同作用以氧合血液，并提供肺和心脏的稳定。既往研究表明，体外循环可能对多个器官系统（如肾脏、脑、肺、心脏、胃肠道）产生不利影响，无论是在病情已存在的患者还是既往健康的患者中均如此22,23,24。这种影响可能由多种因素引起，包括动脉脉压的丧失、血细胞接触异物材料，以及/或插管引起的局部低灌注25。
已提出多种CPB的动物模型，包括大鼠、小鼠、兔、山羊、狗和猪26,27,28,29。由于猪在解剖结构和生理...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号101017113）、卡洛斯三世健康研究所（PI20/00298）、Fundació Sant Joan de Déu卡门·德·托雷斯奖学金以及范德堡医学学者项目的资助。我们感谢CMCiB的所有工作人员，包括Jordi Grifols、María del Mar Arevalo、Juan Ricardo Gonzalez、Sara Capdevila、Josep Puig和Gemma Cristina Monte Rubi。我们还特别感谢Abril Culell Camprubí和Sergi Cesar Díaz博士在解剖图绘制方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5% 七氟烷 | Zoetis | 20070289 | |
| 2.5 mm 气管插管导管 | Henry Schein | 988-1782 | |
| 3 Fr 外周动脉通路导管 | Prodimed | 3872.1 | |
| 4 Fr 外周静脉通路导管 | Prodimed | 3872.13 | |
| 6 French ECMO 儿科动脉插管 | Medtronic | 77206 | |
| 8 French ECMO 儿科静脉插管 | Medtronic | 68112 | |
| 肾上腺素 | B Braun | 469801-1119 | |
| Adson 镊子 | Allgaier instruments | 08-030-130 | 可使用任意品牌替代 |
| 血压袖带 | Mindray | ||
| 布托啡诺（0.01 mg/kg） | Richter Pharma | #9004114000537 | |
| 葡萄糖酸钙（2.25 mmol/10 mL） | B Braun | 570-12606194-1119 | |
| 右美托咪定（0.5–2.0 µg/kg/min） | Orion farma | GTN 064321000017253 | |
| Dolethol | vetoquinol | #3605870004904 | |
| 多巴胺 | hikma | A044098010 | |
| 芬太尼（25–200 µg/kg/min） | Kern Pharma | 756650.2H | |
| O 型新鲜供体猪血 | 任意 | ||
| 热交换器 | Maquet Gmbh & Co | MCP70107.2130 | |
| 肝素（1350 UI） | ROVI | 641641.1 | |
| Irwin 拉钩 | Aesculap | BV104R | 可使用任意品牌替代 |
| 氯胺酮（20 mg/kg） | Richter Pharma | #9004114000452 | |
| 润滑剂 | 任意口喉润滑剂 | ||
| 咪达唑仑（0.3 mg/kg） | Serra Pamies | 619627.4 | |
| 蚊式止血钳 | Aesculap | BH109R | 可使用任意品牌替代 |
| 持针钳 | Aesculap | BM016R | 可使用任意品牌替代 |
| 生理 盐水（0.9%） | B Braun Fisiovet | 5/469827/0610 | 可使用任意品牌替代 |
| 管路用塑料夹 | Achim Schulz-Lauterbach | DBGM | 可使用任意品牌替代 |
| 氯化钾（9 mEq） | B Braun | 3545156 | |
| 丙泊酚（0.5 mg/kg） | Zoetis | 579742.7 | |
| Quadrox 膜式氧合器 | Maquet Gmbh & Co | BE-HMOSD 300000 | |
| 直肠体温计 | 任意 | ||
| RotaFlow Console ECMO 系统 | Maquet Gmbh & Co | MCP00703177 | 新生儿 ECMO 系统 |
| 手术刀 | Aesculap | BB074R | 可使用任意品牌替代 |
| 碳酸氢钠（1 M） | Fresenius Kabi | 634477.4 OH | |
| 手术剪 | Talmed Inox | 112 | 可使用任意品牌替代 |
| 缝线（3/0 聚可吸收缝线） | B Braun Novosyn (R) | 0068030N1 | 可使用任意品牌替代 |
参考文献
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