区域特异性脱细胞肺组织的解剖与分离

摘要

本文介绍了一种分离区域性脱细胞肺组织的实验方案。该方案为研究细胞外基质的复杂性以及细胞与基质间的相互作用提供了有力的工具。

摘要

对于处于严重肺部疾病晚期的患者而言，肺移植往往是唯一的治疗选择，但这一方法受限于合适供体肺源的短缺以及移植后可能出现的急性和慢性排斥反应。确定用于替代病变肺组织的新型生物工程方法，对于提高患者生存率并避免当前移植技术相关并发症至关重要。一种替代性方法是使用去细胞化的完整肺脏，其细胞成分已被去除，而这些成分通常是引发急性和慢性排斥反应的原因。由于肺是一个结构极为复杂的器官，因此有必要研究其特定区域的细胞外基质成分，包括血管系统、气道和肺泡组织。本方法旨在建立简单且可重复的技术流程，使研究人员能够从完全去细胞化的肺组织中分离和获取特定区域的组织样本。该实验方案目前主要针对猪和人肺组织设计，但也可适用于其他物种。在本方案中，将肺组织划分为四个区域：气道、血管系统、肺泡以及整体肺组织。该操作流程使得所获取的组织样本能更准确地反映去细胞化肺组织各区域的真实组成，相较于传统的整体组织分析方法更具代表性。

引言

肺部疾病，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、特发性肺纤维化（IPF）和囊性纤维化（CF），目前仍无治愈手段^1,2,3,4。对于疾病晚期患者，肺移植往往是唯一选择，但该方法受限于合适供体肺源的短缺以及移植后急性和慢性排斥反应的发生^3,5,6。因此，亟需开发新的治疗策略。呼吸系统生物工程中的一个有前景的方向是应用由去细胞化天然肺组织制备的组织来源支架。由于无细胞的全肺支架保留了天然细胞外基质（ECM）组成和生物活性的大部分复杂性，其已被广泛研究用于全器官工程，并作为研究肺部疾病机制的更优模型^7,8,9,10。与此同时，人们日益关注将来自不同器官（包括肺）的去细胞化组织用作水凝胶及其他基质，以在类器官及其他组织培养模型中研究细胞-细胞和细胞-ECM相互作用^{11,12,13,14,15,16,17}。这些基质相较于来源于肿瘤组织的商用基质（如Matrigel）提供了更具生理相关性的模型。然而，目前关于人源肺组织来源水凝胶的信息仍相对有限。我们此前已描述了来源于去细胞化猪肺的水凝胶，并对其力学性能和材料特性进行了表征，同时证明了其作为细胞培养模型的应用价值^18,19。 最近一项研究报告了来源于去细胞化正常及病变（COPD、IPF）人肺的水凝胶的初步力学和黏弹性表征结果²⁰。我们还展示了初步数据，表征了去细胞化正常人肺和COPD人肺中的糖胺聚糖含量及其在研究细胞-细胞和细胞-ECM相互作用中的适用性¹¹。

这些实例展示了利用去细胞化人肺细胞外基质（ECM）进行研究的强大潜力。然而，肺是一个结构复杂的器官，其结构和功能在肺内不同区域存在差异，包括细胞外基质的组成以及其他特性（如刚度）^21,22。因此，研究肺内各个独立区域的细胞外基质具有重要意义，这些区域包括气管和大气道、中等及小气道、肺泡，以及大、中、小血管。为此，我们建立了一种可靠且可重复的方法，用于解剖去细胞化的人肺和猪肺，并随后分离出上述各个解剖区域。该方法使得对正常和病变肺组织中不同区域的蛋白质含量进行详细的差异分析成为可能²¹。

方案

所有动物实验均按照佛蒙特大学（UVM）机构动物照护与使用委员会（IACUC）的规定进行。所有人肺组织均来自佛蒙特大学（UVM）尸检服务中心，相关研究均依照佛蒙特大学（UVM）机构审查委员会（IRB）的指南开展。

注意：本课题组此前已报道过猪和人肺的脱细胞方法^{7,8,9,10, 21}简而言之，通过蠕动泵对肺叶的气道和血管系统依次灌注一系列共2 L的去垢剂和酶溶液，实现全肺叶的脱细胞：0.1% Triton-X 100、2% 脱氧胆酸钠、1 M 氯化钠、30 µg/mL DNase/1.3 mM MgSO₄。₄/2 mM CaCl₂₂，0.1% 过氧乙酸/4% 乙醇，以及去离子水洗涤。确认去细胞化效率的标准方法包括测定 <50 ng/mg 的残留双链DNA存在于脱细胞肺组织中，琼脂糖凝胶电泳未检测到DNA片段，苏木精-伊红（H&E）染色未见细胞核&E) 染色^9,21.

1. 设置

1. 准备解剖操作所需的所有必要器械，包括玻璃培养皿、两把手术镊子、一把镊子和一把手术剪，并在使用前进行高压灭菌。
2. 取一段肺组织，将其置于玻璃培养皿中，并调整方向，使气道的上端清晰可见。
3. 辨认血管系统的近端，并在后续步骤之前保持其完整。血管末端应清晰可见，且呈完全不透明的白色。
4. 使用一把镊子和手术剪，去除可能覆盖在肺组织外表面的胸膜，并丢弃。

2. 暴露气道

1. 使用手术剪采用分离技术，轻柔地暴露额外的气道。
   1. 找到最大的气道，其直径通常约为 2-4 cm。识别气道的另一种方法是观察软骨环，可通过视觉或触觉检测到 通过 组织触诊。
   2. 使用一对镊子，沿气道长度方向触诊，以确定不可见气道的位置，深度约为1英寸。
      注意：由于气道内衬有软骨环，其质地通常比其他肺组织更坚硬。因此，寻找并触诊难以直接观察的气道应相对简单。
   3. 将手术剪刀与气道平行，将闭合的尖端插入看不见的气道周围组织中。
   4. 缓慢打开手术剪，轻轻分开周围的膜组织。随后取出手术剪，避免切割任何组织。
   5. 在解剖过程中间歇性地重复此步骤，以持续暴露气道。
2. 使用手术剪在气道分叉处剪开，并分别沿任一分支独立解剖。
   注：分叉点是指一条气道分裂为两条独立气道的位置。
3. 在确定完整的末端仍可识别并易于找到以进行后续解剖后，切断气道的若干区段。
4. 将气道的离断部分放入相应的试管中。离断部分的大小因样本而异，但通常长度在1-5 cm之间。宽度则根据在气道树中的相对位置而变化，远端区域的宽度较近端区域更小。

3. 暴露并切除血管系统的特定区域

1. 对血管施加轻柔压力，并缓慢将其从气道分离。让血管轻微拉伸，然后使用手术剪进一步将血管与气道分开。
   注意：压力过大可能导致血管撕裂。若发生血管撕裂，只需将该段血管放入相应标记的试管中，并识别其完整末端。
2. 当暴露血管树的分支点时，使用手术剪和镊子暴露血管更下方的区域。
   1. 首先将闭合的手术剪尖端插入分支点下方，并置于对应的两个血管区域之间。
   2. 缓慢打开手术剪，以撑开下方组织。
   3. 间歇性使用一对镊子，移除被手术剪撑开的组织，以及直接环绕在血管周围的其他组织。
3. 当血管覆盖气道区域或妨碍解剖操作的任何步骤时，可在分支点处切断血管，随后分别沿任一分支独立进行进一步解剖。
4. 当确认完整末端仍可识别且易于定位以进行后续解剖时，即可切断血管的相应区域。

4. 鉴别并切除肺泡组织

1. 使用一对镊子轻轻夹住肺泡组织，并小心撕去小块组织。
   1. 选择一个不直接靠近气道或血管系统的组织区域。
   2. 用镊子夹住一小块看似无血管或气道结构的组织。
   3. 将夹住的组织从肺部撕下。
2. 观察所移除的组织区域，确认其是否为肺泡组织。
   注意：肺泡组织遍布整个肺部，因此在解剖过程中可随时取材。任何难以明确归类为主要为肺泡、血管系统或气道的组织，应归为整体组织（bulk tissue），并放入相应标记的试管中。

结果

该实验方案的整体示意图见图1。一旦掌握，脱细胞肺组织的区域性解剖可轻松实现重复操作。准确判断每一份切断组织样本的类别对于解剖过程的成功至关重要。血管组织的弹性明显强于气道组织，因此使用镊子拉伸组织通常是判断样本为血管还是气道的有力依据。通常情况下，血管组织与气道组织平行分布（图2A）。此外，血管组织的颜色通常比气道组织更白、更不透明（图2B），而气道组织则相对透明（图2C）。本方案中所述的手术剪扩张技术如图3所示。较大的气道样本周围被软骨环包围，软骨环的颜色略白于气道本身，因此观察到软骨环即可立即确认该样本为气道组织（图4）。判断样本是否主要为肺泡组织则较为复杂，因为肺泡遍布整个肺部且体积过小，无法用肉眼直接观察。组织取出后，肺泡组织通常会回缩成灯泡状，外观相对均一（

讨论

来自人类及其他物种的脱细胞组织常被用作生物材料，以研究细胞外基质（ECM）的组成以及细胞与细胞外基质之间的相互作用 离体 培养模型，包括三维水凝胶^12,13与其他器官类似，脱细胞肺组织此前已被用于确定健康肺与病变肺（如肺气肿和特发性肺纤维化肺）之间细胞外基质（ECM）组成的差异，并正 increasingly 被用作水凝胶以研究 ECM 动态变化及细胞-ECM 相互作用。^{7,8,9,10,11,14,15,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
邦氏剪刀	Fine Science Tools	14184-09
杜蒙特 #5 精细镊子	Fine Science Tools	11254-02
弯头不锈钢钝头带齿镊子 - 130毫米	CellPath	N/A
硬化精细剪刀	Fine Science Tools	14090-11
莫里亚虹膜镊	Fine Science Tools	11373-22
派热克斯玻璃烤盘	Cole-Parmer	3175-10