建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

摘要

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。

摘要

肿瘤模型对于在探索新的、更有效治疗方法方面进行脑肿瘤的临床前测试至关重要。鉴于人们对免疫治疗的高度关注，拥有一个稳定且具有临床相关性的免疫功能健全小鼠模型，以研究脑内肿瘤细胞和免疫细胞群体及其对治疗的反应，显得尤为重要。尽管大多数临床前模型采用既定肿瘤细胞系的原位移植，但本文介绍的建模系统能够通过将DNA构建体注入体内分裂中的神经前体细胞（NPCs），实现从DNA构建体到逐步但有效发育的“个性化”患者特异性肿瘤突变表征。in vivo使用的DNA构建体采用了双重组酶介导的盒式交换（MADR）方法的嵌合体分析技术，可实现单拷贝体细胞驱动突变的诱变。利用出生后至3日龄内的新生小鼠幼崽，通过靶向位于侧脑室壁的分裂中NPCs进行操作。将DNA质粒（例如MADR衍生质粒、转座子、CRISPR导向的sgRNA）微量注射入脑室后，使用环绕头部前部区域的电极板进行电穿孔。在电刺激作用下，DNA被分裂中的细胞摄取，并有可能整合到基因组中。该方法已成功应用于构建儿童及成人脑肿瘤模型，包括最常见的恶性脑肿瘤——胶质母细胞瘤。本文详细讨论并演示了利用该技术构建脑肿瘤模型的各个步骤，包括对幼年小鼠幼崽的麻醉、质粒混合物的微量注射以及后续的电穿孔操作。借助这种同源性、免疫功能健全的小鼠模型，研究人员将能够拓展临床前建模方法，从而推动更有效癌症治疗方案的改进与评估。

引言

小鼠脑肿瘤模型对于理解脑肿瘤的发生机制和治疗方法至关重要。目前的模型通常包括在免疫缺陷小鼠中快速建立的皮下或原位移植模型，这些模型基于少数驱动突变或患者来源的异种移植模型，使用常用的肿瘤细胞系，但免疫缺陷小鼠限制了免疫治疗研究的准确性^1,2,3,4。此外，这些临床前模型可能导致假阳性结果，即这些模型在治疗后可能表现出显著甚至治愈性的效果，但该疗效无法在临床实践中重现^2,5,6,7。因此，迫切需要能够快速构建出更真实反映患者突变特征的基因工程化临床前小鼠模型，以提高临床前研究结果的可靠性。

基于电穿孔（EP）技术递送DNA质粒以诱导功能缺失（LOF）和功能获得（GOF）突变，可实现此类模型的构建。我们开发了一种更为精确地模拟GOF驱动突变的方法，称为双重组酶介导的盒式交换嵌合分析（mosaic analysis with dual-recombinase-mediated....

方案

本研究中的所有操作步骤 方案已获Cedars Sinai医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。纯合子 mTmG 小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，以获得雌雄混合的杂合子后代 mTmG 用于以下实验方案的小鼠。动物购自商业来源（参见 材料清单). 在出生后第0至3天（P0-P3）对小鼠幼崽进行电穿孔。

1. 手术准备

1. 用化学消毒剂（如 Vimoba）喷洒手术台，擦拭干净后，再用 70% 乙醇喷洒，并再次擦拭。
2. 将以下器械/材料放置在手术台上：拉制的玻璃毛细移液管（参见参考文献¹⁰了解如何拉制移液管）、小剪刀、小型生物危害锐器废弃物容器、微量移液器及移液器吸头、两块剪裁成方形的石蜡膜、电极凝胶、电极、微注射仪固定架，以及 DNA 质粒混合液（参见材料表和补充文件 1）。
3. 根据指示，将以下附件安装到手术台上的设备或放置于地面：微注射仪控制面板、固定架及其连接至主机的插头、用于将微注射仪固定架侧向固定的支架（助焊工具）、微注射仪脚踏开关（置于地面）、连接至主机的电极，以及电极脚踏开关（置于地面）（参见材料表）。
   注意：电极脚踏开关置于微....

结果

上述方案已成功用于建立儿童及成人脑肿瘤小鼠模型，其中前者已在Kim等人的研究中得到详尽发表⁸。只要操作技术得当，并对质粒设计进行周密规划，电穿孔（EP）诱导肿瘤的成功率通常可达100%。当使用报告蛋白时，组织学分析是检测DNA质粒成功插入的最快且最简便的方法。本方案详细描述了如何构建具有100%外显率的胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤模型，该结果已通过组织学分析确认。一个MADR供体质粒同时表达一种报告蛋白（smTagBFP2-V5）和SpCas9（补充文件1）。该质粒还包含两个针对Nf1和Trp53的强效驱动型功能缺失（LOF）肿瘤抑制基因单导向RNA（sgRNA）（sgRNA克隆策略见参考文献¹²；本方案所用寡核苷酸序列见补充文件1）。此外，在质粒混合物中还加入了Cre和Flp重组酶质粒，以实现Rosa26位点的重组（图1A；详见补充文件1）。小鼠在电穿孔术后5个月.......

讨论

基于电穿孔的质粒DNA递送技术使得分子生物学方法能够应用于体内研究，其效果类似于基因工程小鼠模型，但具有病毒转导的速度、定位性和高效性^8,13,14。然而，病毒转导也伴随着安全性问题以及免疫反应风险。我们在利用电穿孔递送质粒DNA的建模系统中已证实，免疫反应极小，主要的免疫刺激来源于玻璃毛细移液管初次插入脑室时造成的机械损伤⁸。因此，为了改进现有的用于免疫治疗研究的肿瘤建模系统，上述方案为脑肿瘤提供了一种更加快速且可靠的临床前建模体系。

使用该方法成功构建脑肿瘤模型的第一步关键在于质粒设计。尽管本方案未对此进行描述，但Kim等人⁸以及Rincon Fernandez Pacheco等人¹⁰已针对儿童脑肿瘤模型对此进行了广泛讨论，其他文献也.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1-2.5 µL 单通道移液器	Eppendorf	3123000012
2 µL 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 单通道移液器	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA 降解溶液	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 方波电穿孔仪	BTX	45-0662
电极凝胶	Parker Labs	PLI152CSZ
快绿染料	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands 焊接辅助支架	Pro'sKit	900-015
显微解剖剪刀，4.5" 直刃尖头	Roboz	RS-5916
小鼠品系：C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
小鼠品系：Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm 封口膜	Grainger	16Y894
质粒：pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
铂金镊状电极，直径 7 mm	BTX	45-0488
锐器盒，1 夸脱容量	Uline	S-15307
标准玻璃毛细管，4 英寸，外径 1 mm，内径 0.58 mm	World Precision Instruments	1B100F-4	毛细移液管需拉制——详见参考文献 10。
垂直显微毛细管拉制仪	Sutter Instruments	P-30	加热设置：第一阶段加热值为 880，第二阶段为 680；拉制值为 800。有关拉制的更多细节，请参见参考文献 10。
Vimoba 片剂溶液	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks 数字显微注射仪	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks 显微毛细管固定夹	Sutter Instruments	BR-MH