建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

摘要

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。

摘要

肿瘤模型对于在探索新的、更有效治疗方法方面进行脑肿瘤的临床前测试至关重要。鉴于人们对免疫治疗的高度关注，拥有一个稳定且具有临床相关性的免疫功能健全小鼠模型，以研究脑内肿瘤细胞和免疫细胞群体及其对治疗的反应，显得尤为重要。尽管大多数临床前模型采用既定肿瘤细胞系的原位移植，但本文介绍的建模系统能够通过将DNA构建体注入体内分裂中的神经前体细胞（NPCs），实现从DNA构建体到逐步但有效发育的“个性化”患者特异性肿瘤突变表征。in vivo使用的DNA构建体采用了双重组酶介导的盒式交换（MADR）方法的嵌合体分析技术，可实现单拷贝体细胞驱动突变的诱变。利用出生后至3日龄内的新生小鼠幼崽，通过靶向位于侧脑室壁的分裂中NPCs进行操作。将DNA质粒（例如MADR衍生质粒、转座子、CRISPR导向的sgRNA）微量注射入脑室后，使用环绕头部前部区域的电极板进行电穿孔。在电刺激作用下，DNA被分裂中的细胞摄取，并有可能整合到基因组中。该方法已成功应用于构建儿童及成人脑肿瘤模型，包括最常见的恶性脑肿瘤——胶质母细胞瘤。本文详细讨论并演示了利用该技术构建脑肿瘤模型的各个步骤，包括对幼年小鼠幼崽的麻醉、质粒混合物的微量注射以及后续的电穿孔操作。借助这种同源性、免疫功能健全的小鼠模型，研究人员将能够拓展临床前建模方法，从而推动更有效癌症治疗方案的改进与评估。

引言

小鼠脑肿瘤模型对于理解脑肿瘤的发生机制和治疗方法至关重要。目前的模型通常包括在免疫缺陷小鼠中快速建立的皮下或原位移植模型，这些模型基于少数驱动突变或患者来源的异种移植模型，使用常用的肿瘤细胞系，但免疫缺陷小鼠限制了免疫治疗研究的准确性^1,2,3,4。此外，这些临床前模型可能导致假阳性结果，即这些模型在治疗后可能表现出显著甚至治愈性的效果，但该疗效无法在临床实践中重现^2,5,6,7。因此，迫切需要能够快速构建出更真实反映患者突变特征的基因工程化临床前小鼠模型，以提高临床前研究结果的可靠性。

基于电穿孔（EP）技术递送DNA质粒以诱导功能缺失（LOF）和功能获得（GOF）突变，可实现此类模型的构建。我们开发了一种更为精确地模拟GOF驱动突变的方法，称为双重组酶介导的盒式交换嵌合分析（mosaic analysis with dual-recombinase-mediated cassette exchange, MADR⁸）。该方法可在体细胞中以受控且位点特异的方式表达目的基因（或多个基因）⁸。结合其他分子工具（如成簇规律间隔短回文重复序列，CRISPR），可组合不同的患者特异性突变，从而建立小鼠脑肿瘤模型。该方法已应用于多种儿童脑肿瘤的研究，包括胶质瘤和室管膜瘤⁸，同时也用于成年型脑肿瘤模型（如胶质母细胞瘤，GBM）的构建。

尽管电穿孔法（EP）在肿瘤建模中的应用不如移植法常见，但以下内容展示了该建模系统迄今为止所具有的简便性和高度可重复性。mTmG小鼠用于插入MADR质粒DNA^8,9。该系统可在Rosa26位点处实现loxP 和Flp重组酶靶点（FRT）的重组，从而便于后续插入供体质粒DNA（即感兴趣的获得功能基因）^8,9。以下方案表明，经过充分练习后，该方法操作简便，能够以原位且稳定的方式建立小鼠脑肿瘤模型。

方案

本研究中的所有操作步骤 方案已获Cedars Sinai医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。纯合子 mTmG 小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，以获得雌雄混合的杂合子后代 mTmG 用于以下实验方案的小鼠。动物购自商业来源（参见 材料清单). 在出生后第0至3天（P0-P3）对小鼠幼崽进行电穿孔。

1. 手术准备

1. 用化学消毒剂（如 Vimoba）喷洒手术台，擦拭干净后，再用 70% 乙醇喷洒，并再次擦拭。
2. 将以下器械/材料放置在手术台上：拉制的玻璃毛细移液管（参见参考文献¹⁰了解如何拉制移液管）、小剪刀、小型生物危害锐器废弃物容器、微量移液器及移液器吸头、两块剪裁成方形的石蜡膜、电极凝胶、电极、微注射仪固定架，以及 DNA 质粒混合液（参见材料表和补充文件 1）。
3. 根据指示，将以下附件安装到手术台上的设备或放置于地面：微注射仪控制面板、固定架及其连接至主机的插头、用于将微注射仪固定架侧向固定的支架（助焊工具）、微注射仪脚踏开关（置于地面）、连接至主机的电极，以及电极脚踏开关（置于地面）（参见材料表）。
   注意：电极脚踏开关置于微注射仪脚踏开关的右侧，以提示操作使用的顺序。
4. 打开微注射仪和电极控制面板。
   1. 检查微注射仪的实验参数设置是否正确：压力应根据质粒混合液的吸取情况设定在 220–450 hPa 之间。
   2. 检查电极控制面板的实验参数设置是否正确。
      ​注意：在本实验（以及我们大多数脑肿瘤模型）中，采用 5 次脉冲，每次 120 V（50 ms，间隔 950 ms）。

2. 术前准备

1. 在显微注射仪中准备质粒混合液。
   1. 取一支拉制好的玻璃毛细移液管，插入显微注射仪的持针器中。确保其尖端已旋紧固定。
   2. 一手握住显微注射仪持针器，另一手持小剪刀；将移液管尖端置于小型锐器生物危害容器上方。闭合剪刀后，轻轻向下按压延长的玻璃毛细移液管，在可见弯曲处剪断，位置距离开口约2 mm。若切割成功，小心将其放置一旁备用。
   3. 将市售的质粒混合液管平放在手术台上并打开。在管底部后方放置移液管尖端盒或其他物品以保持管体稳定，便于吸取质粒混合液。将连接至显微注射仪管路的玻璃移液管平放于台面，轻柔插入质粒混合液管中，确保尖端深入液面并靠近管底。
      注意：由于自然重力产生的吸力，质粒混合液在主动吸取前即会开始进入玻璃移液管。
   4. 当玻璃移液管尖端位于质粒混合液中时，使用显微注射仪面板调节吸入量。从0开始，向负方向旋转右侧旋钮至-60，使质粒混合液进入玻璃移液管。仅需吸入约1英寸长度的混合液。将旋钮转回0，然后将移液管尖端从混合液中取出。
      注意：切勿在负压状态下将移液管尖端从混合液中取出，否则混合液可能喷入显微注射仪甚至管路中。
   5. 通过将混合液注射到一段石蜡膜上来测试单次注射量。使用脚踏开关按压一次，将混合液注入石蜡膜表面。使用设定为1 µL的移液器吸取石蜡膜上的液滴，观察其是否恰好为1 µL。
      注意：若体积略小于1 µL，可适当增加显微注射仪的压力。若压力接近450 hPa但仍不足1 µL，则表明玻璃移液管开口过小，需进一步修剪。建议在修剪前先将质粒混合液重新排回原管。尽管如此，剪刀上仍可能残留混合液，因此必须在操作后使用DNase彻底清洗剪刀以去除所有残留物。若单次注射量超过1 µL，则需更换新的拉制玻璃移液管并进行修剪。当测试体积恰好为1 µL时，表明玻璃移液管尖端尺寸已合适。
   6. 重复步骤2.1.4，为后续操作吸取额外的质粒混合液，总量约为2–3英寸长的液柱进入拉制玻璃移液管中。确保混合液未进入显微注射仪过深，以致无法观察到液柱末端。
      注意：吸取质粒混合液时，必须避免产生气泡。若出现气泡，需将混合液从玻璃移液管中排出，并重新开始此步骤。气泡的存在会对后续向幼鼠脑室注射的操作产生不利影响 。
   7. 当质粒混合液已准备就绪并装入拉制玻璃移液管后，将其放置于焊台辅助支架上并移至一旁，避免意外触碰或碰撞。
2. 准备实验动物。
   1. 准备一个冰桶用于麻醉幼鼠。向冰桶中加入水，使其融化并有助于冷却麻醉装置（例如移液管盒盖）。
   2. 将盒盖放置于融化的冰上进行降温。
   3. 小心地将幼鼠从笼中取出，并放入仍置于冰上的已冷却盒盖内。再将另一个盖子松松地覆盖在底部上方，以促进冷却过程。
   4. 2–3分钟后检查幼鼠状态。在保持俯卧位的同时将幼鼠彼此分开。
      注意：幼鼠会扭动，但随着低温麻醉起效，活动将逐渐减缓。为便于观察，可不加盖子。
   5. 为确认麻醉效果，轻捏幼鼠尾部并观察是否有反应。若有反应，则重复步骤2.2.4。若无尖叫或仅有轻微动作，则表明幼鼠已准备好进行操作。
      ​注意：小鼠不应长时间置于冰上，以免影响术后恢复能力。每次仅将可在麻醉状态下完成注射和电穿孔操作的幼鼠数量置于冰上；随着经验积累，可逐步增加操作数量。

3. 将DNA质粒混合物显微注射至脑室

1. 将幼鼠腹侧朝上置于桌面上 位置。
2. 轻轻向后牵拉头部后方，透过皮肤观察颅骨缝。在颅骨上找到人字缝点（lambda）。脑室/注射位点位于人字缝点与眼睛连线的中点处。
   注意：Lambda 是矢状缝与人字缝相交的位置。参见参考文献¹¹ 用于小鼠头骨上 lambda 点的鉴定。
3. 以垂直角度（移液管笔直朝向天花板）用玻璃移液管尖端刺穿皮肤。按压颅骨时可观察到轻微的凹陷及初始阻力。一旦刺穿，玻璃移液管尖端穿过该凹陷处，即达到适当的注射深度。
4. 固定玻璃移液管尖端，踩下显微注射仪脚踏开关一次，注入1 µL质粒混合物。
   注意：有两种方法可以明确判断注射是否成功。首先，可由另一位实验室成员观察质粒混合物在玻璃移液管中的下降情况以确认注射。此外，如果在质粒混合物中加入了快绿或其他染料，注射后染料会在皮肤下的脑室内明显扩散，将其置于手术灯下可清晰观察到。

4. 电穿孔

1. 将一块石蜡膜（一格）放在桌面上，在膜上挤出适量电极胶。用刷子将足量的电极胶均匀涂抹在每个电极板上。若有胶体滴落，可用纸巾轻轻擦去。
   注意：首次电穿孔后，切勿让两个电极板上的胶体相互接触，否则会导致电荷转移，当施加到幼鼠头部时可能听到嘶嘶声。若幼鼠头部一个电极的胶体与另一个电极的胶体接触，也会发生此现象。
   警告：电穿孔过程中必须小心，确保手指远离电极板。
2. 用一只手（通常为非惯用手）握住幼鼠身体，手指应位于头部后方较远处。
   注意：若为右利手，用左手持幼鼠、右手持电极较为方便；若为左利手，则相反。
3. 将电极靠近幼鼠头部，确保其位置正确，正极电极应置于头部外侧，对准目标脑室（例如，若目标为左侧脑室，则将正极置于幼鼠左侧，负极置于右侧）。在放置电极时，可轻轻用手指（通常为拇指）从头部后方的背部或颈部背侧推动，帮助抬起头部至合适位置。
4. 通过轻捏尾部检查麻醉深度，仅当幼鼠处于适当麻醉平面时方可进行电穿孔。轻轻将电极板压在小鼠头部前端，覆盖双眼位置。踩下一次电极脚踏开关以启动电穿孔。本方案采用5次脉冲，每次120 V（50 ms，间隔950 ms）；每次脉冲均可听见。
   1. 每次脉冲时，将电极板轻微逆时针旋转，使正极电极逐渐移向头部顶端。
      注意：在正确电穿孔过程中，可感觉到或观察到幼鼠身体随每次脉冲发生抽动。
5. 最后一次脉冲结束后，移开电极板并置于一旁。将幼鼠转移至干净的纸巾上，由另一位实验室成员清理其头部的电极胶，并将其放置于纸巾上的"boat"中，并置于加热灯下。
   注意：确保加热灯与幼鼠距离不过近。建议由另一位实验室成员协助此步骤，并持续观察幼鼠状态。通常用手握住幼鼠置于加热灯下有助于提高保暖效果。轻柔按摩幼鼠腹部也有助于其恢复。
6. 当幼鼠身体恢复健康粉红色，且对轻捏尾部有吱叫反应时，将其放回原笼。
   ​注意：放回笼前，取少量原笼垫料，轻轻擦拭幼鼠体表以沾染笼内气味。将幼鼠放回垫料下方，送回饲养室。

5. 术后步骤

1. 将微量注射器玻璃移液管中未使用的质粒混合物倒回离心管中。如果剩余足够量，可用于后续实验。置于 -20 °C 保存。
2. 用纸巾将电极板上的凝胶擦拭干净。
3. 将所有设备部件归还原位。
   注意：如果在吸取质粒混合物之后使用剪刀剪切了玻璃移液管的尖端，请将剪刀留在外面，以便用 DNase 溶液彻底清洗。
4. 先用化学消毒剂喷洒工作台面，然后擦拭干净，再喷洒 70% 乙醇，再次擦拭。

结果

上述方案已成功用于建立儿童及成人脑肿瘤小鼠模型，其中儿童脑肿瘤模型已在Kim等人的研究中得到详尽发表⁸。若采用适当的技术并精心设计质粒，电穿孔（EP）诱导肿瘤的成功率通常可达100%。当使用报告蛋白时，组织学分析是检测DNA质粒成功插入的最快且最简便的方法。本方案详细描述了如何构建具有100%外显率的胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤模型，并通过组织学分析予以确认。MADR供体质粒同时表达一种报告蛋白（smTagBFP2-V5）和SpCas9（补充文件1）。该质粒系统还包含两个针对Nf1和Trp53基因的强效功能缺失型（LOF）肿瘤抑制基因单导向RNA（sgRNA）（sgRNA克隆策略见参考文献¹²；本方案所用寡核苷酸序列见补充文件1）。此外，在质粒混合物中加入Cre和Flp重组酶质粒，以实现Rosa26位点的重组（图1A；详见补充文件1）。小鼠在电穿孔术后5个月内进入濒...

讨论

基于电穿孔的质粒DNA递送技术使得分子生物学方法能够应用于体内研究，其效果类似于基因工程小鼠模型，但具有病毒转导的速度、定位性和高效性^8,13,14。然而，病毒转导也伴随着安全性问题以及免疫反应风险。我们在利用电穿孔递送质粒DNA的建模系统中已证实，免疫反应极小，主要的免疫刺激来源于玻璃毛细移液管初次插入脑室时造成的机械损伤⁸。因此，为了改进现有的用于免疫治疗研究的肿瘤建模系统，上述方案为脑肿瘤提供了一种更加快速且可靠的临床前建模体系。

使用该方法成功构建脑肿瘤模型的第一步关键在于质粒设计。尽管本方案未对此进行描述，但Kim等人⁸以及Rincon Fernandez Pacheco等人¹⁰已针对儿童脑肿瘤模型对此进行了广泛讨论，其他文献也...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1-2.5 µL 单通道移液器	Eppendorf	3123000012
2 µL 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 单通道移液器	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA 降解溶液	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 方波电穿孔仪	BTX	45-0662
电极凝胶	Parker Labs	PLI152CSZ
快绿染料	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands 焊接辅助支架	Pro'sKit	900-015
显微解剖剪刀，4.5" 直刃尖头	Roboz	RS-5916
小鼠品系：C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
小鼠品系：Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm 封口膜	Grainger	16Y894
质粒：pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
铂金镊状电极，直径 7 mm	BTX	45-0488
锐器盒，1 夸脱容量	Uline	S-15307
标准玻璃毛细管，4 英寸，外径 1 mm，内径 0.58 mm	World Precision Instruments	1B100F-4	毛细移液管需拉制——详见参考文献 10。
垂直显微毛细管拉制仪	Sutter Instruments	P-30	加热设置：第一阶段加热值为 880，第二阶段为 680；拉制值为 800。有关拉制的更多细节，请参见参考文献 10。
Vimoba 片剂溶液	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks 数字显微注射仪	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks 显微毛细管固定夹	Sutter Instruments	BR-MH