需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

Xenopus 中有效的快速血液灌注

6.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65287

⸱

2023年5月16日

 , 
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本文展示了一种有效的快速血液灌注方案，用于制备非洲爪蟾组织样本，以进行转录组学和蛋白质组学研究。

摘要

Xenopus 作为研究脊椎动物发育和疾病的模式生物已有100多年的历史。本文介绍了一种在 Xenopus 中快速进行血液灌注的实验方案，旨在显著且一致地减少所有组织中的血液含量。该灌注操作通过将针头直接插入心脏心室，并将含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS）泵入血管系统来完成。每只动物的操作可在约10分钟内完成。血液中含有少数几种高丰度的蛋白质和细胞类型，这些成分会掩盖大多数其他感兴趣的分子和细胞类型，从而带来诸多分析难题。在器官取样前应用本方案，有助于对成年 Xenopus 组织进行可重复的定量蛋白质组学和单细胞转录组学表征。相关组织取样方案详见配套论文。这些操作旨在实现对不同性别、年龄和健康状况的 Xenopus（特别是 X. laevis 和 X. tropicalis）实验操作的标准化。

引言

两栖动物的全身灌注通常用于保存和固定1,2,3,4,5,6然而，这些操作的进行速度限制了每只动物可采集的新鲜样本数量。本研究的目的是建立一种有效的血液灌注方案 非洲爪蟾， 优先考虑技术的速度。每只动物的操作时间少于10分钟。 X. tropicalis 少于每15分钟 X. laevis 动物。次要优先事项是实验的可重复性以及使用易于获取的设备，以便高质量的样本能够在不同实验室之间广泛共享 非洲爪蟾 实验室

Xenopus 蛙类在生物医学研究中被广泛用于研究跨物种保守的基本生物学和病理学过程。作为一种四足动物，它与其他水生模式生物相比，与哺乳动物具有更近的进化关系，拥有肺、三腔心脏以及具指状结构的四肢。国际科学界有效利用 Xenopus 通过深入的疾病建模和对疾病相关基因功能的分子分析，以更深入地理解人类疾病。作为动物模型，Xenopus 具备多种优势，使其成为研究人类发育与疾病分子基础的宝贵工具；这些优势包括：较大的卵母细胞和胚胎尺寸、高繁殖力、易于饲养、快速的体外发育以及易于进行基因组操作。Xenopus 被估计与已鉴定的人类疾病基因约有 80% 的同源性7。

与常用的哺乳动物模型相比， 非洲爪蟾 是一种快速且成本效益高的模型，具有操作简便的吗啉代寡核苷酸敲低技术，以及利用CRISPR实现高效转基因和靶向基因突变的优势8定量质谱分析和单细胞转录组学已成功应用于非洲爪蟾胚胎研究9,10, 但最近的一个细胞图谱来自 Xenopus laevis 表明大多数组织的组成主要由血细胞类型主导11通过开发一种能够快速清除组织血液并使用冷保存液的技术，灌注过程对样本新鲜度的影响被降至最低。这对于旨在分析生理状态下未受干扰的mRNA或蛋白质表达的应用尤为重要。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验均按照哈佛医学院动物实验管理与使用委员会（IACUC）的规章制度（编号：IS 00001365_3）进行。

注意：尽管本文所述的主要安乐死方法被美国兽医医学协会认为是一种可接受的安乐死技术12，但该方法并未被证实可导致心跳停止13。即使常用于辅助的二次毁髓法也无法防止此现象，取出动物心脏亦不能避免。对麻醉动物进行放血（失血致死）被认为是实现成功安乐死的人道且有效的方法12。由于本方案的目标是通过安乐死过程保持组织的新鲜状态，因此在使用MS-222进行主要安乐死后心脏仍持续跳动是有利的；同时，灌注本身通过放血作用也构成了二次安乐死方法。

1. 准备

  1. 确保研究机构已批准本方案中所述的安乐死和灌注技术。
  2. 配制含有5 g/L MS-222（三卡因甲磺酸盐）和5 g/L碳酸氢钠的溶液，溶液体积应大于完全浸没待处死动物所需的体积。检测pH值，确保其≥7。
  3. 每份制备 500 µL 含 180 U/mL 肝素的磷酸盐缓冲液（PBS） X. laevis，或每份200 µL X. tropicalis
  4. 通过将动物置于主要安乐死装置中执行初级安乐死 非洲爪蟾 在此溶液（来自步骤1.2）中完全浸没动物，总时长为1小时。
  5. 确认 非洲爪蟾 在安乐死开始15分钟后，通过捏脚检查动物是否已丧失疼痛反应。若动物仍有反应，应将其放回安乐死溶液中，直至该反应消失。
  6. 称量非洲爪蟾，并在取样前记录所需的其他测量数据。
  7. 使用31 G针头注射 X. laevis 用 250 µL 和 X. tropicalis 用100 µL PBS中的180 U/mL肝素（来自步骤1.3）注射至每侧前肢肌肉。
  8. 配制肝素溶液，每克动物体重使用1 mL含54 U/mL肝素的PBS灌注液。对该实验方案经验较丰富的操作者可能会发现，完成灌注所需的灌注液体积可更少。
  9. 使用22 G的皮下注射针进行灌注 X. laevis，以及25 G的皮下注射针头用于 X. tropicalis用剪线钳剪去灌注针的针尖以使其变钝图1)14.
    注意：如果针头发生移位，此操作可降低其穿透心室的可能性。除了钝化针尖外，还可使用磨石或锉刀将针头略微磨短，但需保持足够的锋利度以刺穿心室。
  10. 通过连接修剪好的针头并循环使用步骤1.8中制备的含肝素磷酸盐缓冲液灌注液（54 U/mL），对泵进行准备。务必从管路中彻底排除所有气泡，以避免发生空气栓塞，否则可能导致灌注效率降低或失败（参见 表1将灌注液在操作过程中保持在冰上。
  11. 如果泵不可编程，则在针头就位的情况下，测量不同设置下泵送的培养基体积，以确定最接近5 mL/min和10 mL/min的设置。这些流速将适用于所有物种。如果灌注泵可编程，则按照制造商的说明，在针头就位的情况下对其进行校准。
  12. 将解剖面（托盘或泡沫板）倾斜放置于次级容器内，或调整其位置以利于血液引流。
  13. 青蛙在溶液中放置1小时后，初步安乐死过程即已完成。取出青蛙，通过脚部夹捏测试重新检查其疼痛反应是否消失。
  14. 将青蛙仰卧放置，并用针固定每个肢体（图2）。若需保存肢体组织，可通过脚趾插入细针，或在肢体周围使用U形钉。
  15. 使用解剖剪沿中线纵向切开皮肤，再横向剪开，形成两个皮瓣。图2)
  16. 用镊子夹住白线并将其从体腔中拉开（图3). 用剪刀小心地穿过肌肉组织进行切割。将体腔壁切成两个瓣状，并将所有瓣状组织剪开或用针固定至一旁。
  17. 使用解剖剪沿喙骨向上剪开，并去除多余组织，以更好地暴露心脏图3).
  18. 心脏应仍处于跳动状态。如果在灌注前心脏已停止跳动，请注意样本的新鲜度已受到影响。

2. 灌注

  1. 辨认胃部，并轻轻将其移至肝脏左叶（观察者的右侧）上方，使血管在整个操作过程中保持可见。辨认一侧肺，并用组织镊夹住其尖端。将肺拉出体腔，并通过尖端将其固定（图4）。操作应轻柔，因破裂的血管无法有效灌注。若观察到肺叶内有血液残留，需予以注意，因其会影响对操作完成程度的判断。
  2. 拍摄体腔图像，以便更准确地评估灌注效率，并为日后可能发现异常组织提供参考。
  3. 辨认薄层心包膜，用组织镊将其拉紧（图5）。使用虹膜剪的尖端小心刺破心包膜，注意避免损伤其下方组织。将心包膜从心脏的三个腔室上剥离。
  4. 用镊子轻轻夹住心室的顶端。施加适度压力，使镊子夹持面之间留有足够空间供灌注针穿过（图6）。
  5. 将针头穿过镊子的闭合处插入心室腔内，注意避免穿透心室壁（图7）。使用持针器通过止血钳将组织镊固定到位。
    注意：该技术可稳定针头位置，而针头仍保持锋利。若将针头直接夹在心室上，会造成不必要的损伤，若需重新夹持将更加困难（见 表1）。
  6. 启动泵，流速设为约 5 mL/min。心脏的三个腔室及动脉干将逐渐充盈扩张（图8；见 表1）。
  7. 用剪刀小心刺破右心耳（观察者的左侧），血液将流出。将流速保持在 5 mL/min 或提高至 10 mL/min。
  8. 持续灌注直至胃部血管变苍白（见 表1），然后刺破左心耳（观察者的右侧）。若当前流速仍为 5 mL/min，应提高至约 10 mL/min。
  9. 使用移液管以灌注液冲洗体腔，以保持视野清晰，并更准确地评估从心耳流出灌注液的颜色。
  10. 保持针头位置不变，直至从心耳流出的灌注液变为澄清（见 表1），且肺组织失去红色色泽（见 表1；图9）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

灌注成功后，所有组织（除有色型猪的肝脏外） 非洲爪蟾）将明显颜色更浅，血液饱和度更低。主要血管将变得不那么明显。图10），并且取样后组织（肝脏除外）在缓冲液中可被彻底清洗干净。虽然该方案的成功实施最终需通过放血后组织样本的数据质量来确认，但下表提供了若干常见问题、可能原因及建议的解决措施（表1 和 图11).

微量移液器吸头分析；吸头结构对比A和B的示意图，显微镜方法。
图1...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案描述了进入体腔的传统解剖技术。其他技术也可接受，前提是其对组织造成的损伤最小，能够暴露心脏，并且可见肺和胃。类似地，所列的大多数解剖工具均可使用功能相近的替代品。

尽管已尝试优化该操作步骤的效率，但实验结果可能因操作者经验以及个体青蛙之间的差异而有所不同。关于血液灌注，一个未在本文中探讨的有趣方面是，该操作与接受手术的动物所采用的其他灌注方式相比效果如何。另一个尚未研究的变量是，在非常年幼或高龄动物中进行血液灌注的效果，因为在这些动物中，血管系统可能极为脆弱。本文提供了一些附加说明，以帮助本方案的实施。文中还列出了若干常见问题、可能的原因及建议的补救措施。 表1.

该方法的一个局限性在于，灌注效率可能受其速度的负面影响。如果灌注效率比快速灌注更为重要，建议采用墨西哥钝口螈的技术1（Saltman 等人使用“aorta”一词指代动脉干）。

操作持续时间和所用培养基体积取决于多种变量。通常...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）OD R24 基金项目 OD031956 和 NICHD R01 基金项目 HD073104 的资助。我们感谢 Darcy Kelly 对本实验方案提供的有益讨论和初步建议。同时，我们还要感谢 Samantha Jalbert、Jill Ralston 和 Wil Ratzan 提供的帮助与支持，以及三位匿名同行评审专家的反馈意见。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带LED灯和支架的5倍放大镜amazon.comB08QJ6J8P1光不得产生热量
一次性移液管VWR414004-036
精细尖头镊子Fisher Scientific08-875
解剖剪，尖头，直剪，6.5"VWR76457-374
解剖托盘Fisher Scientific14-370-284泡沫塑料板是可接受的替代品
安乐死容器美国塑料项目 2860可接受其他不透明容器
安乐死容器盖美国塑料项目 3047
精细解剖针生命系统仪器设备PIN-#3
通用型皮下注射针头，22 GFisher Scientific14-826-5A用于 X. laevis
通用型皮下注射针头，25 GFisher Scientific14-826AA用于 X. tropicalis
肝素，猪肠黏膜MilliporeSigma37-505-410MG
虹膜剪 6"vwr470018-938虹膜剪是一种可接受的替代工具
鲁尔接头转接头，公头鲁尔带锁环amazon.comB09PTX6M2Z尺寸将取决于所用泵的软管规格
Mayo-Hegar持针器Fisher Scientific08-966蚊式钳是一种可接受的替代工具
MS-222：安眠酮（曾用名：三卡因）Pentair AESTRS1
PBS 1×康宁21-040-CV
蠕动液体泵加样泵 5–100 mL/minamazon.comB07PWY4SM6任何能够以5-10 mL/min流速泵送液体的蠕动泵均可使用
磨刀石VWR470150-112可选；用于钝化针头
碳酸氢钠，粉末，USPFisher Scientific18-606-333
带齿镊子VWR82027-442
解剖用T形针Fisher ScientificS99385
超细短型胰岛素注射器，31 GVWRBD328438
6英寸超锐利剪线钳 &强力侧切剪钳amazon.comB087P191LP

参考文献

  1. Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
  2. Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
  3. Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
  4. Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
  5. Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
  6. Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
  7. Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).
  8. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  9. Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
  10. Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
  11. Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).
  12. AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).
  13. Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).
  14. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
  15. Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
  16. Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
  17. Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

非洲爪蟾血液灌注快速灌注方案肝素化PBS组织取样蛋白质组学分析转录组学分析血管系统两栖动物模型器官标准化心脏灌注
Xenopus 中有效的快速血液灌注
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。