本文展示了一种有效的快速血液灌注方案，用于制备非洲爪蟾组织样本，以进行转录组学和蛋白质组学研究。
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本文内容
摘要
摘要
Xenopus 作为研究脊椎动物发育和疾病的模式生物已有100多年的历史。本文介绍了一种在 Xenopus 中快速进行血液灌注的实验方案，旨在显著且一致地减少所有组织中的血液含量。该灌注操作通过将针头直接插入心脏心室，并将含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS）泵入血管系统来完成。每只动物的操作可在约10分钟内完成。血液中含有少数几种高丰度的蛋白质和细胞类型，这些成分会掩盖大多数其他感兴趣的分子和细胞类型，从而带来诸多分析难题。在器官取样前应用本方案，有助于对成年 Xenopus 组织进行可重复的定量蛋白质组学和单细胞转录组学表征。相关组织取样方案详见配套论文。这些操作旨在实现对不同性别、年龄和健康状况的 Xenopus（特别是 X. laevis 和 X. tropicalis）实验操作的标准化。
引言
两栖动物的全身灌注通常用于保存和固定1,2,3,4,5,6然而，这些操作的进行速度限制了每只动物可采集的新鲜样本数量。本研究的目的是建立一种有效的血液灌注方案 非洲爪蟾， 优先考虑技术的速度。每只动物的操作时间少于10分钟。 X. tropicalis 少于每15分钟 X. laevis 动物。次要优先事项是实验的可重复性以及使用易于获取的设备，以便高质量的样本能够在不同实验室之间广泛共享 非洲爪蟾 实验室
Xenopus 蛙类在生物医学研究中被广泛用于研究跨物种保守的基本生物学和病理学过程。作为一种四足动物，它与其他水生模式生物相比，与哺乳动物具有更近的进化关系，拥有肺、三腔心脏以及具指状结构的四肢。国际科学界有效利用 Xenopus 通过深入的疾病建模和对疾病相关基因功能的分子分析，以更深入地理解人类疾病。作为动物模型，Xenopus 具备多种优势，使其成为....
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方案
所有实验均按照哈佛医学院动物实验管理与使用委员会（IACUC）的规章制度（编号：IS 00001365_3）进行。
注意：尽管本文所述的主要安乐死方法被美国兽医医学协会认为是一种可接受的安乐死技术12，但该方法并未被证实可导致心跳停止13。即使常用于辅助的二次毁髓法也无法防止此现象，取出动物心脏亦不能避免。对麻醉动物进行放血（失血致死）被认为是实现成功安乐死的人道且有效的方法12。由于本方案的目标是通过安乐死过程保持组织的新鲜状态，因此在使用MS-222进行主要安乐死后心脏仍持续跳动是有利的；同时，灌注本身通过放血作用也构成了二次安乐死方法。
1. 准备
- 确保研究机构已批准本方案中所述的安乐死和灌注技术。
- 配制含有5 g/L MS-222（三卡因甲磺酸盐）和5 g/L碳酸氢钠的溶液，溶液体积应大于完全浸没待处死动物所需的体积。检测pH值，确保其≥7。
- 每份制备 500 µL 含 180 U/mL 肝素的磷酸盐缓冲液（PBS） X. laevis，或每份200 µL X. tropicalis
- 通过将动物置于主要安乐死装置中执行初....
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结果
灌注成功后，所有组织（除有色型猪的肝脏外） 非洲爪蟾）将明显颜色更浅，血液饱和度更低。主要血管将变得不那么明显。图10），并且取样后组织（肝脏除外）在缓冲液中可被彻底清洗干净。虽然该方案的成功实施最终需通过放血后组织样本的数据质量来确认，但下表提供了若干常见问题、可能原因及建议的解决措施（表1 和 图11).
图1.......
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讨论
本方案描述了进入体腔的传统解剖技术。其他技术也可接受，前提是其对组织造成的损伤最小，能够暴露心脏，并且可见肺和胃。类似地，所列的大多数解剖工具均可使用功能相近的替代品。
尽管已尝试优化该操作步骤的效率，但实验结果可能因操作者经验以及个体青蛙之间的差异而有所不同。关于血液灌注，一个未在本文中探讨的有趣方面是，该操作与接受手术的动物所采用的其他灌注方式相比效果如何。另一个尚未研究的变量是，在非常年幼或高龄动物中进行血液灌注的效果，因为在这些动物中，血管系统可能极为脆弱。本文提供了一些附加说明，以帮助本方案的实施。文中还列出了若干常见问题、可能的原因及建议的补救措施。 表1.
该方法的一个局限性在于，灌注效率可能受其速度的负面影响。如果灌注效率比快速灌注更为重要，建议采用墨西哥钝口螈的技术1（Saltman 等人使用“aorta”一词指代动脉干）。
操作持续时间和所用培养基体积取决于多种变量。通常.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）OD R24 基金项目 OD031956 和 NICHD R01 基金项目 HD073104 的资助。我们感谢 Darcy Kelly 对本实验方案提供的有益讨论和初步建议。同时，我们还要感谢 Samantha Jalbert、Jill Ralston 和 Wil Ratzan 提供的帮助与支持，以及三位匿名同行评审专家的反馈意见。
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材料
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| 精细尖头镊子 | Fisher Scientific | 08-875 | |
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| 解剖托盘 | Fisher Scientific | 14-370-284 | 泡沫塑料板是可接受的替代品 |
| 安乐死容器 | 美国塑料 | 项目 2860 | 可接受其他不透明容器 |
| 安乐死容器盖 | 美国塑料 | 项目 3047 | |
| 精细解剖针 | 生命系统仪器设备 | PIN-#3 | |
| 通用型皮下注射针头，22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | 用于 X. laevis |
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| 肝素，猪肠黏膜 | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
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参考文献
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B.
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