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碱烧伤诱导角膜新生血管化的小鼠模型

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DOI：

10.3791/65289

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2023年6月30日

 ,  ,  , 
1Cullen Eye Institute, Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

本方案重点研究小鼠角膜碱烧伤诱导的新生血管形成。该方法可建立可重复且可控的角膜疾病模型，用于研究病理性血管生成及其相关分子机制，并评估预防角膜新生血管形成的新药制剂。

摘要

角膜新生血管化（CoNV）是一种病理性血管生成过程，表现为血管和淋巴管从角膜缘向无血管的角膜内生长 ，从而损害角膜透明性与视力 。碱烧伤是导致眼部外伤性CoNV最常见的原因之一。本实验方案采用氢氧化钠溶液以可控方式诱导CoNV，确保实验可重复性。由于角膜本身无血管、透明且易于观察，碱烧伤模型不仅有助于研究CoNV的病理机制，还可推广用于一般性血管生成的研究。在本研究中，通过体视显微镜直接观察以及使用抗CD31单克隆抗体对平铺角膜进行免疫染色来分析CoNV。通过抗LYVE-1单克隆抗体对平铺角膜进行免疫染色以检测淋巴管生成。采用光学相干断层扫描（OCT）对角膜水肿进行可视化观察并定量分析。综上所述，该模型将有助于推动现有新生血管化检测方法的发展，并为病理性眼内及眼外血管生成的治疗策略探索提供支持。

引言

角膜是一种无血管组织，通过建立抗血管生成特权来维持其透明性1,2。角膜受损可导致炎症反应，以及血液和淋巴管的形成，并引发纤维化3。角膜新生血管化（CoNV）会导致视力障碍，是全球范围内仅次于白内障的第二大致盲原因4。 在美国，每年约有140万人受到角膜新生血管化的影响5。多种因素均可诱发角膜新生血管化，包括化学烧伤、感染、炎症和缺氧3,6。化学烧伤是最常见的眼科急症之一，约占眼外伤的13.2%，需要立即评估和治疗7。化学烧伤可分为碱烧伤和酸烧伤，其中碱烧伤造成的损伤更为严重，因为碱性物质可更深地渗透入组织8。

碱烧伤小鼠模型被广泛用于研究角膜新生血管（CoNV）及伤口愈合过程。与角膜袋法血管生成模型9,10相比，碱烧伤模型制备相对简便，还可用于研究角膜炎症、纤维化以及上皮细胞增殖。此外，这些模型相较于角膜缝线诱导的血管生成模型，更接近临床化学烧伤的实际病理情况11。在碱烧伤后，原本无血管的角膜由于炎症反应以及促血管生成因子与抗血管生成因子之间的失衡，出现新生血管1,2。角膜碱烧伤模型的缺点包括难以精确控制烧伤面积和严重程度、角膜新生血管反应存在个体差异，以及过量碱液可能导致邻近组织意外损伤。本研究旨在描述一种使用预先浸有氢氧化钠溶液的滤纸制备的、可控的角膜碱烧伤小鼠模型。该模型可用于研究血管生成相关因子、抗血管生成治疗药物，以及其他可能调节炎症和纤维化的因素与试剂。

方案

所有动物实验，包括实验操作和安乐死程序，均经贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，方案编号为AN-8790。

1. 1 N NaOH 的配制

  1. 向一个15 mL离心管中加入4 mL无菌去离子水。称取400 mg氢氧化钠（NaOH），小心加入离心管中。
  2. 用玻璃棒缓慢搅拌使NaOH溶解。再加入无菌去离子水定容至10 mL，并通过轻轻上下颠倒离心管的方式混匀溶液。盖紧管盖，于室温下储存。
  3. 每月新鲜配制该溶液，因为NaOH溶液可能吸收空气中的二氧化碳而导致浓度降低。
  4. 使用前务必轻轻混匀NaOH溶液。
    ​注意：应在化学通风橱内配制溶液，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

2. 4% 多聚甲醛（PFA）溶液的配制

  1. 向玻璃烧杯中加入 30 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。称取 4 g 多聚甲醛（PFA），并将其加入烧杯中。
  2. 将烧杯置于 60 °C 的加热板上搅拌。逐滴加入 1 N 氢氧化钠（NaOH）溶液，调节 pH 值，直至溶液变澄清。
  3. 使用 1 N 盐酸（HCl）将 pH 值检查并调节至 7.4。用 1× PBS 定容至最终体积 50 mL。
  4. 冷却并过滤溶液。将溶液于 4 °C 保存。
    ​警告：应在通风橱内配制该溶液，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

3. 配制氯胺酮/赛拉嗪混合溶液

  1. 通过将 0.8 mL 的氯胺酮（储备浓度：100 mg/mL）和 0.16 mL 的赛拉嗪（储备浓度：100 mg/mL）加入 9.4 mL 生理盐水中，配制氯胺酮/赛拉嗪混合液。
  2. 将混合液储存于无菌注射瓶中，室温（RT）保存。

4. 小鼠角膜的碱烧伤

  1. 在操作前30分钟，皮下注射美洛昔康（4–6 mg/kg体重）以缓解疼痛。使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮80 mg/kg、赛拉嗪16 mg/kg体重）腹腔注射麻醉小鼠（C57BL/6J，6–8周龄，雄性）。
  2. 通过轻捏小鼠脚趾检查反射反应（足底回缩），并确认反射消失。在一只眼睛的角膜表面滴加一滴局部麻醉剂0.5%丙帕卡因，另一只眼睛滴加一滴人工泪液。
  3. 使用2 mm活检打孔器打下Whatman滤纸片。
  4. 向一个干净的培养皿中加入 2 µL 的 1 N NaOH。将 2 mm 的滤纸片置于 1 N NaOH 液滴上，浸泡 15 秒。
  5. 用镊子夹取滤纸，将其置于经丙美卡因处理的眼睛角膜中央，持续30秒。
    注意：滤纸必须仅接触角膜中央，放置后应避免移动，因为移动滤纸可能导致邻近组织灼伤。
  6. 使用无菌注射器以20 mL无菌生理盐水冲洗眼睛。
    注意：必须注意确保 角膜及结膜囊需彻底冲洗，以确保角膜及周围组织不再受到进一步损伤。冲洗结膜囊可进一步预防睑球粘连。
  7. 用一次性软布轻轻擦拭小鼠眼部及周围区域的多余生理盐水。随后，将小鼠置于铺有温热加热垫的恢复笼中，直至其恢复自主活动能力。
    注意：碱烧伤后，小鼠需每日监测3天。若观察到疼痛或应激症状，可皮下注射美洛昔康（4-6 mg/kg 体重）。

5. 新生血管形成和混浊度的检查与评估

  1. 在烧伤后第10天，对麻醉小鼠在解剖显微镜下检查眼睛，并使用连接至解剖显微镜的相机获取图像，以评估角膜混浊度和新生血管化程度。
    注：配备相机的常规解剖显微镜即可满足要求。
  2. 通过解剖显微镜观察角膜时，根据以下标准对烧伤后的角膜混浊度进行评分12：
    0 = 无混浊；角膜透明
    1 = 轻度混浊；虹膜和瞳孔区域轻微模糊；虹膜和瞳孔清晰可见
    2 = 中度混浊；虹膜和瞳孔勉强可见
    3 = 重度混浊；无法看清虹膜或瞳孔
    4 = 角膜完全不透明；虹膜和瞳孔不可见
  3. 通过解剖显微镜观察角膜时，根据以下标准对角膜新生血管化（CoNV）进行评分12：
    0 = 无新生血管化；自角膜缘无新生血管形成
    1 = 轻度新生血管化；自角膜缘出现新生血管
    2 = 中度新生血管化；血管自角膜缘向角膜中央生长
    3 = 重度新生血管化；血管自角膜缘延伸至角膜中央并/或跨越中央区域
  4. 采用学生t检验对碱烧伤组与健康眼组之间的混浊度和新生血管化评分进行统计学比较。
  5. 在第10天通过暴露于5%异氟烷直至呼吸停止后1分钟，随后行颈椎脱位法处死小鼠，并取角膜组织用于平铺成像。

6. 光学相干断层扫描（OCT）成像

  1. 在烧伤后第10天，对麻醉小鼠的眼睛前段进行OCT成像。使用IR + OCT模式，以30°视野和100%红外光强度进行体积扫描采集OCT图像。
  2. 使用ImageJ软件定量分析角膜厚度。
  3. 测量厚度时，使用ImageJ软件中的线段选择工具，在中央角膜的前表面与后表面之间绘制一条直线。
  4. 在软件工具中点击分析 > 测量，将数值传输至数据窗口。
  5. 将数值复制到电子表格文件中，并使用Student's t检验对碱烧伤组与健康眼组之间的角膜厚度进行统计学比较。
    ​注：角膜厚度是指角膜中心处前角膜表面某一点到后角膜表面最近点之间的距离。

7. 角膜平铺标本中CoNV的免疫染色

  1. 在碱烧伤后第10天处死小鼠，并通过钝性解剖摘除眼球。
  2. 用拇指和食指拉开眼睑，将镊子置于眼球下方。夹紧镊子，轻柔地将眼球从眼眶中拉出。
  3. 将眼球放入1×PBS中。对每个眼球，首先在角膜缘区域下方用30 G针头做一切口，然后从眼球上分离角膜。
  4. 以该切口为起点，使用角膜显微剪沿角膜缘区域环形剪切，缓慢将角膜和角膜缘从眼球上分离。
  5. 用细毛刷轻轻清洗角膜，去除虹膜。将角膜在4%多聚甲醛中固定1小时。
  6. 在室温（RT）下用1×PBS洗涤角膜，每次20分钟，共洗涤三次。
  7. 在封闭缓冲液（含0.1% Triton-X 100和5%牛血清白蛋白[BSA]的1×PBS）中孵育1小时，室温进行。
  8. 将角膜转移至含一抗的抗体溶液中。抗体溶液用含1% BSA、0.1% Triton-X 100的1×PBS配制，并加入Dylight550标记的抗CD31单克隆抗体（1:100）和Alexa Fluor488标记的抗LYVE-1单克隆抗体（1:100）。
  9. 在4 °C孵育3天。用1×PBS洗涤角膜，每次20分钟，共洗涤三次。
  10. 用Hoechst染色液（1:1,000）避光染色5分钟，以标记细胞核。
  11. 通过放射状切口展平角膜，将其置于预先清洁的载玻片上，用封片剂和盖玻片封片。用透明指甲油密封盖玻片，并在避光条件下过夜干燥，随后进行共聚焦显微镜分析。
  12. 使用共聚焦显微镜对展平的角膜进行成像，通过拼接多个Z轴层扫图像获取完整视野；采用10倍物镜，488 nm和561 nm激光，非共振检流计扫描器上每层分辨率为512像素 × 512像素。
  13. 使用ImageJ软件定量分析CD31+ 血管和LYVE-1+ 淋巴管的密度。
  14. 为测定血管密度，将共聚焦图像转换为8位图像。
  15. 从插件中选择血管密度功能。
  16. 在图像上选定感兴趣区域，点击确定。测量结果将在新的数据窗口中显示。
  17. 将数值复制到电子表格文件中，使用Student's t检验对碱烧伤组与健康眼组之间的血管密度进行统计学比较。
    注：CD31，又称血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1），是一种参与血管生成的细胞黏附分子，在早期及成熟血管的内皮细胞中高表达13。LYVE-1（淋巴管内皮透明质酸受体-1）是淋巴管内皮细胞表面标志物，可作为淋巴管生成的标记物14。

结果

本研究描述了一种通过碱烧伤在小鼠眼部诱导角膜血管生成的方法。解剖显微镜下获得的图像（图1A、B）显示，碱烧伤组角膜的新生血管化程度和混浊评分显著升高（P < 0.05；图1C、D）。第10天采集的角膜组织分别使用抗CD31单克隆抗体标记血管、抗LYVE-1单克隆抗体标记淋巴管进行免疫染色（图2A–I）。碱烧伤组在10天后表现出显著更高的血 管和淋巴管密度（P < 0.001 和 P < 0.05，分别对应；图2J、K）。通过OCT成像并定量分析角膜厚度（图3A、B），发现碱烧伤组的角膜厚度显著增加（P < 0.01；图3C）。

角膜新生血管、碱烧伤效应、对比图表、眼健康、显微分析。
图1：碱烧伤诱导的角膜新生血管形成及混浊。 (A,B) 在损伤后第10天，碱烧伤小鼠角膜(B)中可见新生血管从角膜缘血管向角膜中央生长，而健康眼(A)中未见此现象。(C,D) 对图A和B中(C)角膜新生血管化程度和(D)混浊程度的定量分析（± SEM；t检验；*P < 0.05；n = 3只眼，每只小鼠1只眼）。红色箭头表示角膜缘，黄色箭头指示新生血管的出芽方向。 请点击此处查看该图的放大版本。

CD31、LYVE免疫荧光图像及显示血管和淋巴管密度比较的图表。
图2：碱烧伤引起的角膜新生血管化和淋巴管生成。 免疫组织化学染色分别使用抗CD31和抗LYVE-1单克隆抗体检测（A、D、G）血管和（B、E、H）淋巴管。（A-C）健康小鼠角膜。（D-I）碱烧伤后第10天的角膜。（C、F、I）CD31与LYVE-1信号的叠加图像。（G-I）对应于图（D-F）的放大图像。比例尺 = （A-F）200 µm 和（G-I）500 µm。（J、K）根据图（A-F）所示区域对血管和淋巴管密度进行定量分析（± SEM；t检验；*P < 0.05；***P < 0.001；n = 3只眼，每只小鼠1只眼）。请点击此处查看该图的高清版本。

OCT中角膜厚度比较。柱状图显示健康眼与碱烧伤眼的结果对比。
图3碱烧伤引起的角膜增厚 (A健康小鼠眼睛的OCT图像。B小鼠角膜碱烧伤后10天的OCT图像。C) 角膜厚度的定量分析 A 和 B，以角膜中心测量值为准（± 标准误；t 检验；**P < 0.01；n = 3 只眼，每只小鼠1只眼。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

角膜是研究血管生成和炎症的理想组织，因为它易于接触且无血管，这意味着新生血管化可以方便地被检测和记录。在兔子、大鼠和小鼠中已采用角膜烧伤模型来研究角膜血管生成、炎症和混浊、溃疡、角膜穿孔以及纤维化15,16,17。此外，小鼠角膜烧伤模型对于测试多种针对血管生成和炎症的治疗策略具有重要价值，因为小鼠的免疫系统与人类的免疫系统密切相关18。此外，小鼠基因组可进行遗传操作的技术已十分成熟，这使得该物种成为此类研究的理想选择19。该领域研究的挑战在于开发一种能够产生稳定且可重复病理生理变化的角膜烧伤方法。

碱烧伤模型在筛选调节血管生成、炎症和纤维化的药物方面具有重要价值。该方法对试剂和资源的需求极少，操作简便，且实验周期短，可直接观察结果，因此小鼠角膜碱烧伤成为药理学药物筛选的首选模型。然而，在实施该操作时需注意若干事项，以确保实验的一致性和可重复性。首先，滤纸必须准确放置于角膜中央，以避免损伤眼部其他区域，尤其是角膜缘、眼睑和结膜；其次，氢氧化钠（NaOH）的体积和浓度应适当，以确保角膜碱烧伤结果的一致性。滤纸不应滴水，但需充分浸透于NaOH溶液中。本方法所采用的滤纸尺寸、类型以及溶液的当量和体积均已优化，以防止NaOH溢出。若使用不同尺寸的滤纸或NaOH体积过高或过低，均可能导致新生血管化结果不一致。第三，使用后应立即盖紧溶液管盖，并尽量减少溶液与空气的接触比例，以防止NaOH溶液吸收空气中CO2。必须使用新鲜配制的碱溶液，以避免新生血管化结果异常及角膜溃疡的发生。最后，必须用生理盐水彻底冲洗眼表及结膜上的所有NaOH溶液，以防止对角膜及周围眼组织造成进一步损伤。对角膜及其邻近组织的充分冲洗还有助于预防睑球粘连。

本文所述方案是一种研究角膜血管生成病理生理学的高效且可靠的方法。该方案还可进一步用于研究角膜炎症、纤维化以及伤口愈合。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由SRB慈善公司、美国国立卫生研究院（NIH）P30EY002520项目以及防止失明研究组织（RPB）向贝勒医学院眼科系提供的无限制机构资助支持。W.L. 由眼科骑士圣殿基金会捐赠基金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠注射液HospiraKL-7302
30 G 针头McKesson16-N3005
A1R 共聚焦显微镜Nikon Instruments
抗 CD31 抗体Novus BiologicalsNB100-1642R
抗 LYVE-1 抗体Life technologies53-0443-82
ASM 模块Heidelberg Engineering前节物镜
活检打孔器McKesson16-1309
BSAThermoscientific9048-46-8
盖玻片VWR International22X22-1-601640G
解剖显微镜AmScopeSM-4TZ-30WY-10M3
Fluoromount-GElectron Microscopy Sciences17984-25
镊子Fine Science Tools15000-02
镊子Fine Science Tools11049-10
镊子Fisherbrand12-000-157
镊子 RobozRS-4905
Gonak Hypromellose Akorn17478006412
GraphPad Prism 9GraphPad Sotware, Inc
加热垫K&H Pet Products100213018
HoechstLife Technologies62249
HRA + OCT SpectralisHeidelberg Engineering
胰岛素注射器Mckesson102-SN310C31516P
Kimwipe 擦镜纸Kimberly Clark Professional34155
微型盖玻片VWR48366-067
显微剪刀RobozRS-5110
显微镜载玻片Fisherbrand12-550-15
NaOHSigma Aldrich55881-500G
新霉素和多粘菌素B硫酸盐及地塞米松 Bausch & Lomb24208-0795-35
正常血清Jackson Immuno008-000-121
多聚甲醛Sigma Aldrich158127-500G
PBSGibco20012-027
丙帕他卡因 HClBausch & Lomb24208073006
生理盐水Henry Schein1531042
SMZ125Nikon Instruments
10 mL 注射器McKesson16-S10C
Triton X-100Sigma AldrichTX1568-1
Whatman 滤纸CytivaWHA1003323

参考文献

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