一种利用顶空气相色谱-串联四极杆质谱法检测动物源性药材中三甲胺的改进技术

摘要

本文介绍了一种适用于测定动物源性药材中三甲胺（TMA）的顶空气相色谱-串联三重四极杆质谱法（HS-GC-MS/MS）。该方案包括样品前处理、顶空处理、分析条件、方法学验证以及动物源性药材中三甲胺的测定。

摘要

动物源性药物具有独特的性质和显著的治疗效果，但大多数此类药物具有明显的腥味，导致临床患者的依从性较差。三甲胺（TMA）是动物源性药物中关键的腥味成分之一。由于加入碱液后酸碱反应迅速，顶空瓶内压力升高，导致TMA逸出，现有检测方法难以准确识别TMA，从而阻碍了动物源性药物腥味研究的进展。本研究提出了一种可控检测方法，通过在酸与碱液之间引入石蜡层作为隔离层，利用恒温炉加热使石蜡层缓慢熔化，从而有效控制TMA的生成速率。该方法具有良好的线性关系、精密度实验结果和回收率，重现性好，灵敏度高，为动物源性药物的脱臭研究提供了技术支撑。

引言

利用动物部位和/或其副产品（本文称为动物源性药物）所制备的产品治疗人类疾病正受到越来越多的关注。动物源性药物在治疗癌症、心血管疾病、肝硬化、乳腺炎及其他疾病方面发挥着重要作用，具有疗效强、剂量小、临床疗效显著且特异性强等优势。然而，动物源性药物通常具有明显的腥味，严重影响患者的依从性，尤其不利于儿童用药^1,2。这种腥味主要来源于药物中所含的蛋白质、氨基酸、脂肪等物质，这些成分通过脂肪酸氧化、氨基酸降解等途径分解，产生多种具有腥味的化合物^2,3,4。其中，三甲胺（TMA）是一种具有腥味的挥发性气体，广泛存在于腐败或变质的动物源性食品中⁵。

迄今为止，气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC）、离子色谱法、分光光度法、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）以及传感器方法常用于检测环境、食品和尿液中的三甲胺（TMA）^6,7,8,9。鉴于气相色谱柱和进样系统的污染程度较低，且具有高灵敏度、良好的重现性以及低检测限（0.1–1 mg/kg），顶空气相色谱-质谱联用法（HS-GC-MS）成为食品和生物样品分析的首选方法⁸。目前，仅有中国建立了食品中TMA的国家标准，而HS-GC-MS是GB5009.179-2016标准中的第一法¹⁰。因此，本研究选用上述HS-GC-MS方法检测动物源性药材中的TMA。前期研究中，本课题组发现食品中TMA的HS-GC-MS检测标准可用于检出多种动物源性药材中的腥味。结合已有研究结果^11,12，可证明TMA是动物源性药材腥味的共性关键物质。然而，实验发现该方法的重现性较差，存在TMA逸失和稳定性不佳等问题，无法通过方法学验证。这可能是由于将碱液注入顶空瓶后，迅速发生的酸碱反应导致瓶内压力升高，从而使TMA从进样孔逸出，影响了TMA的稳定与准确定量。因此，本研究提出一种改进的顶空气相色谱-串联四极杆质谱法（HS-GC-MS/MS）检测方法，以解决上述问题。

该方案通过利用固体石蜡（一种优良的固-液相变材料）在预处理过程中将酸碱反应物分离开来，从而改进了样品前处理。随着恒温炉温度升高，石蜡逐渐熔化，三甲胺（TMA）也在密封的顶空瓶中缓慢释放，避免了剧烈快速的酸碱反应所引起的压力骤增，确保了TMA检测的稳定性和准确性。此外，顶空进样结合气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）中的多反应监测（MRM）模式，有效抑制了基质带来的化学干扰，保证了检测结果的可靠性。方法学验证结果表明，改进后的检测方法在线性关系、精密度试验和回收率等方面均满足要求，具有良好的重现性和高灵敏度。

方案

有关Pheretima、Periplaneta americana和Hirudo药材的信息见表1。这些药材由成都中医药大学徐润春教授鉴定，分别为参环毛蚓（Pheretima aspergillum (E.Perrier)）、美洲大蠊（Periplaneta americana L.）和宽体金线蛭（Whitmania pigra Whitman）的干燥体。

1. 标本提取

1. 使用中药粉碎机（参见材料表）粉碎Pheretima、Periplaneta americana和Hirudo，依次通过2号（筛孔直径：0.8 mm）和4号（筛孔直径：0.25 mm）标准药筛进行过筛，收集两筛之间的粉末，得到所需样品粉末。
   注：Pheretima粉碎后质地疏松，其粉末无需过筛。
2. 取1 g粉末（精确至0.001 g）置于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 5%三氯乙酸（TCA）溶液（参见材料表），使用高速分散均质机在1,000 rmin^-1条件下均质1 min。
3. 均质后，在室温下以1,717 × g离心5 min，在玻璃漏斗中放入少量脱脂棉，将上清液过滤至50 mL容量瓶中。
4. 用15 mL和10 mL的5% TCA溶液分别重复上述提取过程两次，合并滤液，并用5% TCA溶液定容至50 mL。

2. 试剂准备

1. 配制20%氢氧化钠溶液：称取20 g氢氧化钠，用去离子水定容至100 mL容量瓶中。
2. 配制5%三氯乙酸（TCA）溶液：称取25 g三氯乙酸（TCA），用去离子水定容至500 mL容量瓶中。

3. TMA 标准储备液的配制

1. 配制TMA标准储备液：称取0.0162 g氯化三甲胺标准品，用5%三氯乙酸（TCA）溶液溶解，并定容至100 mL，得到浓度为100 µg/mL的TMA标准储备液。于4 °C保存。
2. 配制TMA标准使用液：取适量体积的TMA标准储备液，用5% TCA溶液逐级稀释，配制成浓度分别为0.1 µg/mL、0.5 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、5 µg/mL和10 µg/mL的TMA标准使用液。

4. 样品顶空处理

1. 在20 mL顶空瓶中准确称取2 mL氢氧化钠溶液和0.5 g固体石蜡（熔点：58-60 °C）（参见材料表）。
2. 将顶空瓶置于70 °C烘箱中加热约30分钟，使固体石蜡完全熔化。
3. 取出后冷却至室温，使石蜡重新凝固。凝固后的石蜡将密封氢氧化钠。
4. 取2 mL各样品提取液，加至石蜡层上方，拧紧瓶盖并密封。
5. 将密封好的顶空瓶放入仪器中（参见材料表）进行测定。

5. HS-GC-MS/MS 分析条件的设置

1. 头空条件和气相色谱-质谱条件见表2。
2. 离子信息见表3。

6. 标准曲线绘制

1. 参照步骤 4.1-4.3 中的样品顶空处理方法，制备含有碱液和石蜡密封层的顶空瓶。
2. 分别吸取 2 mL 浓度为 0.1 µg/mL、0.5 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、5 µg/mL 和 10 µg/mL 的三甲胺标准溶液至 20 mL 顶空瓶中，密封瓶盖后上机测定。

7. 精密度测试

1. 参照步骤 4.1-4.3 中的样品顶空处理方法，制备含有碱液和石蜡密封层的顶空瓶。
2. 用移液器吸取 2 mL 浓度为 0.1 µg/mL 的三甲胺（TMA）标准溶液至 20 mL 顶空瓶中，并密封瓶盖。按照仪器制造商的说明进行六次平行测试（见材料表）。

8. 回收率实验

1. 取Pheretima、Periplaneta americana和Hirudo（S02、S05、S07；表1）的批次作为回收率实验的代表性药材。
2. 取若干批次的样品粉末（S02、S05、S07），于50 °C烘箱中烘烤72小时，直至未检出TMA。
3. 参照第4–6节中的样品制备方法，检测烘烤后药粉中TMA的含量。
4. 称取1 g烘烤后的粉末（精确至0.001 g），置于50 mL塑料离心管中，加入50 µL TMA标准溶液。
   注：TMA标准溶液浓度分别为100 μg/mL、1000 μg/mL和10000 μg/mL。
5. 加入20 mL 5% TCA溶液，在1000 rmin^-1条件下均质1分钟。
6. 均质后，在1717 × g条件下离心5分钟，在玻璃漏斗中放入少量脱脂棉，将上清液过滤至50 mL容量瓶中。
7. 用15 mL和10 mL的5% TCA溶液分别重复上述提取过程两次，合并滤液，并用5% TCA溶液定容至50 mL。

9. 检出限（LOD）与定量限（LOQ）的确定

1. 当信噪比（S/N）= 3 时，根据对应的浓度确定检测限（LOD）。
2. 当信噪比（S/N）= 10 时，根据对应的浓度确定定量限（LOQ）。

10. 样品三甲胺含量的测定

1. 分别取约1 g的Pheretima、Periplaneta americana和Hirudo细粉，按上述方法提取样品，并上机测定。

结果

本方案预处理原理及操作的示意图如下所示 图1 和 图2分别为。TMA 的峰时间为 2.3 分钟，峰形尖锐，且无其他杂质干扰（图3）。测定0.1–10 µg/mL TMA标准溶液的线性范围，以TMA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程y = 2522482x + 24255，相关系数（R²) = 0.9998，表明具有良好的线性关系。检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别根据信噪比（S/N）为3和10计算得出，LOD为0.03 mg/kg，LOQ为0.11 mg/kg。为考察该方法的精密度，对含有三甲胺（TMA，0.1 µg/mL）的样品进行6次平行测定，相对标准偏差（RSD）为5.84%，证明该方法精密度良好。一组来自 Pheretima, Periplaneta americana，以及 医蛭属 分别选取S02、S05、S07作为回收率实验的代...

讨论

动物源性药物来源于动物的全身、器官或组织、生理或病理产物、排泄物或分泌物，以及动物的加工制品。三甲胺（TMA）是动物源性药物中腥味的重要来源，是一种具有极低嗅觉阈值（0.000032 × 10^-6 V/V）和强烈鱼腥味的典型恶臭物质¹³。目前，常用的顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）方法无法对动物源性药物中的TMA进行稳定、准确的检测。

本方案在多个方面进行了改进：（1）三甲胺（TMA）具有更强的极性和碱性。本方案选用专用于挥发性胺类气相色谱分析的色谱柱来检测TMA，确保了TMA检测的准确性和灵敏度。（2）在GB5009.179-2016标准中采用的HC-GC-MS方法的样品制备过程中，需向密封的顶空瓶中注入高浓度氢氧化钠溶液¹⁰。此时发生的酸碱反应会导致顶空瓶内压力升高，可能引起TMA逸出，从而导致TMA检测结果不准确。本方案参考了中药中二氧化硫残留的检测方法¹⁴，在样品前处理过程中采用固体石蜡作为介质，隔离酸...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	贝克曼库尔特贸易（中国）有限公司	SSC-2-0213
中药粉碎机	浙江永康西岸五金制药厂	HX-200K
鼓风干燥箱	三洋电机株式会社	MOV-112F
20 mm 铝盖脱盖器	安谱实验科技股份有限公司（上海）	V1750004
电子天平	岛津企业管理（中国）有限公司	AUW220D
气相色谱-质谱联用仪	岛津企业管理（中国）有限公司	TQ-8050 NX
顶空瓶	安谱实验科技股份有限公司（上海）	25760200
匀浆机	上海标默工厂	FJ200-SH
预组装瓶盖	安谱实验科技股份有限公司（上海）	L4150050
样品筛	振兴筛具厂	/
SH-挥发性胺检测仪	成都美美乐特科技有限公司	227-3626-01
氢氧化钠	成都 chrono 化学品有限公司	2022101401
固体石蜡	上海华陵康福仪器厂	20221112
三氯乙酸	成都 chrono 化学品有限公司	2022102001
盐酸三甲胺	成都艾法生物科技有限公司	AF22022108
超纯水系统	四川优普超纯科技有限公司	UPR-11-5T