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用于流式细胞术补偿对照的卟啉修饰微珠

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DOI：

10.3791/65294

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2023年3月24日

 ,  ,  ,  , 
1bioAffinity Technologies

本文内容

摘要

本方案描述了如何通过氨基功能化的聚苯乙烯微球与卟啉化合物TCPP及酰胺偶联试剂EDC反应，制备用于流式细胞术的卟啉基补偿微球。采用过滤步骤以减少颗粒状副产物。

摘要

流式细胞术可根据荧光测量结果快速表征和定量不同的细胞群体。首先用一种或多种荧光试剂对细胞进行染色，每种试剂连接有不同的荧光分子（荧光素），可依据细胞的表型特征（如细胞表面抗原表达）选择性地结合细胞。流式细胞仪可通过检测特定波长范围的通道，测量每种试剂结合到细胞后产生的荧光强度。当使用多种荧光素时，单个荧光素发出的光常会溢出至非目标检测通道，因此需要对荧光强度数据进行校正，该过程称为补偿。

在细胞标记实验中，每种使用的荧光染料均需要相应的补偿对照颗粒，通常为结合单一荧光染料的聚合物微球。流式细胞仪采集的补偿颗粒数据可用于校正荧光强度测量值。本方案描述了共价修饰有荧光试剂 meso-四(4-羧基苯基)卟啉（TCPP）的聚苯乙烯补偿微球的制备与纯化方法，及其在流式细胞术补偿中的应用。本研究中，将氨基功能化的聚苯乙烯微球在 pH 6、室温条件下，与 TCPP 及酰胺偶联试剂 EDC（N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐）共同孵育 16 小时，并持续振荡。通过离心收集 TCPP 微球，并重悬于 pH 7 的缓冲液中保存。实验过程中观察到 TCPP 相关颗粒物作为副产物生成，可通过可选的过滤步骤减少其数量。所制备的 TCPP 微球已成功应用于多荧光标记人痰细胞实验中的流式细胞术补偿。TCPP 微球在冰箱中储存 300 天后仍保持稳定。

引言

由于具有荧光特性和肿瘤靶向性，卟啉类化合物多年来在生物医学领域备受关注1,2,3。光动力治疗（PDT）和声动力治疗（SDT）等治疗应用需要将卟啉类药物系统性地给予癌症患者，使其在肿瘤组织中富集，随后对肿瘤局部施加特定波长的激光或超声照射。激光或超声的刺激可促使卟啉产生活性氧，进而导致细胞死亡4,5。在光动力诊断（PDD）中，利用卟啉的荧光特性可区分癌细胞与正常细胞6。在此背景下，原卟啉IX是一种天然的荧光性卟啉，在系统性或局部注射其前体5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）后，可在肿瘤组织中富集，已被用于识别胃肠道间质瘤、膀胱癌和脑癌7,8。最近，研究人员还探索了使用5-ALA处理来检测多发性骨髓瘤中微小残留病灶的可能性9。本实验室一直采用四芳基卟啉TCPP（5,10,15,20-四（4-羧基苯基）-21,23H-卟吩），因其能够选择性地染色人类痰液样本中的肺癌细胞及与癌症相关的细胞，该特性已被应用于基于载玻片和流式细胞术的诊断检测方法中10。

某些卟啉具有双功能特性，既可用作治疗剂，也可用作诊断剂2,11。在生物医学研究中，这类双功能卟啉被用于评估其选择性靶向并杀伤癌细胞的能力如何依赖于其分子结构，以及如何受到其他化合物存在的影响12,13,14,15,16。卟啉的细胞摄取及其细胞毒性均可通过流式细胞术平台以高通量方式测定。荧光卟啉的吸收光谱和发射光谱较为复杂，但大多数流式细胞仪均配备有能够准确识别它们的检测系统。荧光卟啉的吸收光谱特征是在380–500 nm范围内存在一个强烈的吸收峰，称为Soret带；在500–750 nm范围内通常还可观察到两至四个较弱的吸收峰（Q带）17。大多数流式细胞仪配备的蓝色 488 nm激光器或紫色激光器（405 nm）均可产生合适波长的光以激发卟啉。卟啉的发射光谱通常在600–800 nm范围内出现峰值18，这导致其与异硫氰酸荧光素或藻红蛋白（PE）等荧光染料之间的光谱重叠极小，但与其他常用荧光染料（如别藻蓝蛋白（APC））以及串联荧光染料（如PE-Cy5等）之间存在显著的光谱重叠。因此，在多色流式细胞术实验中使用卟啉时，必须设置单荧光染料对照，以充分校正荧光信号在非目标检测通道中的溢出。

理想情况下，用于计算一组荧光染料溢出矩阵的单荧光染料对照（也称为"补偿对照"）应使用与待测样本相同的细胞类型。然而，如果起始样本量极少，或样本中目标细胞群体非常稀少 （例如，在研究微小残留病灶或疾病早期阶段的癌细胞时），则不宜使用样本本身作为对照。一种有效的替代方案是使用与样本分析中相同的荧光染料偶联的微球。目前市面上有多种此类微球可供选择：它们要么已预先标记所需荧光染料（预标记的特异性荧光微球）19,20，要么可将荧光标记抗体结合到微球表面（抗体捕获微球）20,21。尽管许多荧光染料均有商用补偿微球，但卟啉类染料尽管在基础与临床研究中的应用日益广泛，目前却尚无相应的补偿微球产品。

除了样本保存以及阳性和阴性群体的适当比例外，使用微球作为补偿对照的其他优势还包括制备简便、背景荧光低以及长期稳定性优异22。使用微球作为补偿对照的潜在缺点是，结合在微球上的荧光抗体的发射光谱可能与用于标记细胞的同种荧光抗体存在差异。在使用光谱流式细胞仪时，这一点可能尤为重要20。因此，微球补偿对照的开发必须在将用于相关检测的流式细胞仪上进行。此外，微球的开发过程还需包含与使用相同荧光染色试剂标记的细胞进行对比。

本文描述了TCPP胺基化聚苯乙烯补偿微球的制备方法，其在检测通道中的中位荧光强度与痰液中TCPP标记细胞的荧光强度相当，可用于流式细胞术的补偿对照。同等条件下未功能化的微球自发荧光足够低，可作为阴性荧光补偿对照。此外，这些微球在储存近1年期间表现出良好的稳定性。

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方案

所有操作均需在使用适当个人防护装备的情况下进行。

1. TCPP 储备液的制备，1.0 mg/mL

注意：可每月制备一次。

  1. 使用分析天平、药匙和称量纸，称取 49.0–50.9 mg 的 TCPP。将称量结果精确至 0.1 mg。将称好的 TCPP 避光保存备用。
    注意：若称量读数不稳定，可使用除静电枪。
  2. 根据步骤 1.1 中称得的 TCPP 质量，从表 1中确定所需纯水和异丙醇（IPA）的用量。将纯水和异丙醇加入一个 100 mL 玻璃烧杯中，并用封口膜覆盖，防止挥发。
  3. 根据步骤 1.1 中称得的 TCPP 质量，从表 1中确定所需碳酸氢钠的用量。
  4. 使用分析天平、药匙和称量纸，称取步骤 1.3 中确定的所需量的碳酸氢钠。将称量结果精确至 0.1 mg。
    注意：若称量读数不稳定，可使用除静电枪。
  5. 将称好的碳酸氢钠加入 含有纯水和异丙醇的 100 mL 烧杯中。用封口膜覆盖溶液，防止挥发。
  6. 将步骤 1.5 得到的溶液置于搅拌器上搅拌，直至完全溶解（约 10 分钟）。
  7. 测定 pH 值，确保步骤 1.6 中含碳酸氢钠的溶液 pH 值在 9 至 10 之间。
  8. 缓慢将步骤 1.1 中称好的 TCPP 加入步骤 1.7 的溶液中，继续搅拌至完全溶解（约 30 分钟）。此步骤需避光操作。
  9. 将溶液储存于玻璃或聚丙烯容器中，室温保存并避光。

2. 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）及其半钠盐缓冲液（0.1 M，pH 6.0–6.2）的配制（"MES缓冲液"）

注意：必须在使用当天配制，并于室温下保存。

  1. 称取 2.50 g MES 半钠盐，加入一个 150 mL 塑料瓶中。
  2. 加入 121 mL 纯化水，手动振摇至无可见固体完全溶解。
  3. 测定 MES 缓冲液的 pH 值，确保其在 6 至 6.2 之间。
  4. 室温保存，并于当日使用。

3. N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺（EDC）粉末

  1. 将 EDC 粉末从冷冻箱中取出，置于室温下放置，待第 5 步使用。

4. 将胺基功能化的聚苯乙烯珠与TCPP溶液混合

  1. 取4.3 mL步骤2中配制的0.1 M MES缓冲液，加入至一个15 mL聚丙烯管中。
  2. 将步骤中提供的氨基化聚苯乙烯微球悬浮液（10 µm，2.5% w/v）在最大转速下涡旋振荡60秒。
  3. 取288 µL上述 freshly vortexed 微球悬浮液，加入至步骤4.1中的MES缓冲液中。
  4. 将MES/微球混合液在最大转速下涡旋振荡15秒。
  5. 将步骤1中配制的1 mg/mL TCPP溶液在最大转速下涡旋振荡60秒。
  6. 取1.20 mL上述 freshly vortexed TCPP储备液，加入至步骤4.4中的MES/微球悬浮液中。
  7. 将MES/微球/TCPP悬浮液在最大转速下涡旋振荡15秒。
  8. 在配制EDC溶液期间，用铝箔包裹试管避光。

5. N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）储备液的制备

注意：EDC 溶液易变质，配制后应立即使用。

  1. 向一个新的50 mL锥形管中加入20.0 mL纯化水。
  2. 称取步骤3中得到的200 mg EDC HCl，并将其加入水中（步骤5.1）。
  3. 以最大速度涡旋震荡EDC HCl溶液15秒，直至形成澄清溶液。

6. EDC HCl/MES 工作溶液的配制

注意：EDC HCl/MES 溶液易变质，配制后应立即使用。

  1. 向一个150 mL塑料瓶中加入54.0 mL MES缓冲液（按步骤2配制）。
  2. 向MES缓冲液中加入6.0 mL EDC HCl储备液（按步骤5配制），振荡10秒混匀。

7. 使用 TCPP 标记微珠

  1. 将4.5 mL的EDC工作液（来自步骤6）加入含有珠粒和MES缓冲液中TCPP的15 mL聚丙烯管中（步骤4.7）。
  2. 将该管置于倒置旋转仪上，于室温、避光条件下以35 rpm转速旋转16小时。
  3. 在室温下以1,000 × g离心10分钟。
  4. 吸除上清液，并将珠粒重悬于0.8 mL的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。
  5. 用1 mL移液器将珠粒悬液转移至棕色聚丙烯样品瓶中，于4 °C保存，待后续使用。
    ​注意：此时珠粒至少可稳定保存3个月。

8. 通过流式细胞术对TCPP微珠进行质量检测（QC）

注意：质量控制应重点评估四羧基苯基卟啉（TCPP）微球的中位荧光强度（MFI）是否足够强，以满足其预期用途，以及该操作产生的微粒数量。更多细节请参见代表性结果部分。

  1. 将一个5 mL聚苯乙烯管标记为"TCPP阴性微珠"。
    注意：阴性微珠与用于标记的胺基功能化微珠不同。参见材料表。
  2. 将另一个管标记为"TCPP阳性微珠"。
  3. 将另一个管标记为"彩虹微珠"。
  4. 向标记为"TCPP阴性微珠"和"TCPP阳性微珠"的管中分别加入300 µL冰浴HBSS。
  5. 向标记为"彩虹微珠"的管中加入500 µL冰浴HBSS。
  6. 将未功能化的聚苯乙烯（未标记）微珠悬液在最大转速下短暂涡旋振荡（2–3秒），并取10 µL加入标记为"TCPP阴性微珠"的管中。
  7. 将TCPP标记的微珠悬液（在步骤7.5中完成制备）在最大转速下短暂涡旋振荡，并取3 µL加入"TCPP阳性微珠"管中。
  8. 将彩虹微珠悬液在最大转速下短暂涡旋振荡，并加入两滴至"彩虹微珠"管中。
  9. 将所有管置于冰上，避光并加盖保存。
  10. 启动流式细胞仪相应的日常开机程序，并执行质控步骤，以确认流体系统和激光对焦处于最佳状态。
    注意：本实验方案的此部分假设操作人员已接受过所用流式细胞仪的操作培训，包括光散射和荧光强度的标准化操作，以及正确计算补偿矩阵的基本原理。
  11. 在不同样本检测之间不调整电压设置的情况下，依次检测彩虹微珠和TCPP标记微珠。
    1. 检测并采集彩虹微珠的10,000个事件。
    2. 用水冲洗后，采集TCPP阴性微珠的10,000个事件。
    3. 用水冲洗后，采集TCPP阳性微珠的10,000个事件。
    4. 用清水冲洗1分钟。
      注意：在检测TCPP微珠后必须进行清水冲洗。若未将TCPP从细胞仪管路中彻底冲洗干净，则残留的TCPP可能对后续待检测样本中的细胞产生非特异性标记。
    5. 根据仪器制造商提供的说明，执行相应的清洁和关机程序。
      ​注意：代表性结果见图1。

9. 珠层过滤

注意：如果通过流式细胞术对磁珠进行质量控制（步骤 8）显示颗粒物比例较高（70% 或更高），请考虑使用以下方案过滤磁珠悬浮液（图 2）。

  1. 向步骤 7.5 中制备完成的 0.8 mL TCPP 微球悬液中加入 3.20 mL 冰冷的 HBSS（形成五倍稀释）。
  2. 将稀释后的微球悬液在最大转速下涡旋振荡 15 秒。
  3. 从一次性 5 mL 注射器中取出活塞。
  4. 将玻璃纤维尖端滤器（5 µm，13 mm 直径）安装到注射器上。
  5. 向注射器中加入 4 mL HBSS。
  6. 加入 0.5 mL 经涡旋振荡的稀释微球悬液（步骤 9.2）。
  7. 使用活塞以约每秒 2 滴的速度将悬液通过注射器/滤器装置过滤。
  8. 以约每秒 2 滴的速度通过滤器将 5 mL 新鲜 HBSS 吸入注射器，洗涤微球。
  9. 再次以约每秒 2 滴的速度将 HBSS 推入废液容器中。
  10. 为从滤器上回收微球，通过滤器将另外 5 mL 新鲜 HBSS 吸入注射器。
  11. 小心地将滤器从注射器上取下。
  12. 将注射器中的微球悬液排入一个 50 mL 圆锥形离心管中。
  13. 将滤器重新装回注射器，并重复步骤 9.10–9.12 共四次。然后 丢弃滤器和注射器。
  14. 重复步骤 9.2–9.13，直至步骤 9.1 中的所有微球均完成过滤。每次使用新的注射器和滤器。
  15. 将过滤后的微球悬液在室温下以 1,000 × g 离心 10 分钟。
  16. 吸除每个 50 mL 管中的上清液，并轻轻重悬微球，最终合并于 0.5 mL 新鲜 HBSS 中。
  17. 使用 p1,000 微量移液器将微球转移至一个新的棕色玻璃或聚丙烯小瓶中，于 4 °C 保存。
  18. 重复步骤 8，以确定过滤后微球悬液中与 TCPP 相关的颗粒物比例是否降低。代表性结果见 图 3。

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结果

该TCPP标记微珠的实验方案相对快速且高效。图1展示了通过流式细胞术测定的TCPP微珠标记过程的代表性结果。图1A显示了Rainbow微珠在检测TCPP的适当通道中的标准化谱图。这些微珠用于对流式细胞仪检测TCPP时的激光电压进行标准化质控。图1B显示了经胺基功能化的聚苯乙烯微珠（TCPP标记微珠）的光散射谱图。图1C显示了非功能化微珠（未标记微珠）的光散射谱图；我们将其用作阴性微珠对照，以计算补偿矩阵。红色矩形所示的群体在未标记微珠悬液中不存在，代表了TCPP与偶联试剂EDC接触后形成的与TCPP相关的颗粒聚集体。在测定微珠荧光强度（FI）时，应排除此类聚集体。图1D显示了通过图1B中黑色门控选中的标记微珠的FI，其值明显比（未设门控的）未标记微珠的FI高出数个数量级（比较

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讨论

尽管卟啉在癌症诊断和治疗中具有多种应用2，但关于其作为流式细胞术试剂用于区分原代人体组织中癌细胞与非癌细胞群体的潜在用途，相关文献仍十分有限24,25,26。我们在对人类痰液进行流式细胞术分析的研究24,27中，需要使用TCPP及其他几种荧光染料对解离的痰液细胞进行染色。然而，TCPP在其他荧光染料检测通道中的荧光溢出问题，意味着需要一种标记TCPP的微球作为补偿对照。然而，此类微球并无商业产品，必须自行制备。已有文献报道将四芳基卟啉连接到基于二氧化硅的分子筛上28,29，但基于二氧化硅的颗粒被证明不适合用于制备流式细胞术标准品（数据未显示）。因此，我们的研究集中于聚苯乙烯...

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披露

所有作者均为 bioAffinity Technologies 的员工。

致谢

我们感谢 David Rodriguez 在图像制备方面的协助，以及 Precision Pathology Services（美国德克萨斯州圣安东尼奥）提供其 Navios EX 流式细胞仪的使用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琥珀色塑料离心管，2 mL，U型底，聚丙烯材质研究产品国际公司  ZC1028-500
胺基功能化的聚苯乙烯-二乙烯基苯交联（PS/DVB）微球，10.6 μm 直径，2.5% w/v 水悬浮液，3.82 x 107 beads/mL，7.11 × 1011 氨基/微珠SpherotechAPX-100-10直径规格 8.0–12.9 μm，悬浮液 2.5% w/v 3.82 × 107 beads/mL，7.11 × 1011 氨基/微珠
50 mL 圆锥形管，FalconFisher Scientific14-432-22
离心配备合适的转子
带盖一次性聚苯乙烯瓶，150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC（N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐）， ≥98%Sigma03450-1GCAS 号：  25952-53-8
FlowJo 单细胞分析软件（v10.6.1）BD
22 x 22 mm 玻璃盖玻片Fisher Scientific12-540-BP
玻璃纤维注射器滤器（Finneran，5 µm，13 mm 直径托马斯科学公司1190M60
载玻片，275 × 75 × 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks平衡盐溶液（HBSS）Fisher Scientific14-175-095
异丙醇，ACS 级Fisher ScientificAC423830010
单通道机械移液器，100-1000 µL，配吸头Eppendorf3123000918
MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸，半钠盐）SigmaM0164CAS 编号：  117961-21-4
Navios EX 流式细胞仪贝克曼库尔特
奥林巴斯BX-40显微镜配备DP73相机、40倍物镜及cellSens软件Olympus或类似物
巴斯德吸管，玻璃，5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH计（UB 10 Ultra Basic）丹佛仪器公司
移液控制器（Drummond）Pipete.comDP101
5 mL塑料注射器Fisher Scientific14955452
聚苯乙烯颗粒（非功能化），SPHERO  2.5% w/v，8.0–12.9 µmSpherotechPP-100-10 
聚丙烯管，15 mL，锥形Fisher Scientific14-959-53A
聚苯乙烯试管，圆底 Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads（Spherotech URCP-50-2K）Fisher ScientificNC9207381
一次性血清移液管 - 10 mLFisher Scientific07-200-574
一次性血清移液管 - 25 mLFisher Scientific07-200-576
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)SigmaS6014CAS 号：  144-55-8
TCPP（meso-四(4-羧基苯基)卟啉）  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS 编号：  14609-54-2
Tecan Spark 酶标仪（或类似设备）Tecan生命科学
试管旋转混匀仪/旋转器赛默飞世尔科技88881001
涡旋混合器Fisher Scientific2215365

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