一种用于抗体类治疗分子质量计算的开源框架

摘要

本文介绍了使用软件应用程序 mAbScale 来计算基于单克隆抗体的蛋白质治疗药物的质量。

摘要

生物治疗药物的质量测定是验证其身份和结构完整性的方法。对完整蛋白质或蛋白质亚基进行质谱分析（MS）为生物制药研发的各个阶段提供了一种简便的分析工具。当质谱测得的实验质量在理论质量的预定义质量误差范围内时，即可确认蛋白质的身份。尽管目前已有一些用于计算蛋白质和多肽分子量的计算工具，但这些工具要么并非专为生物治疗分子的直接应用而设计，要么因需付费授权导致使用受限，要么要求将蛋白质序列上传至服务器主机。

我们开发了一种模块化的质量计算程序，可便捷地确定治疗性糖蛋白（包括单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和抗体-药物偶联物（ADC））的平均质量或单一同位素质量及其元素组成。该基于 Python 的计算框架具有模块化特性，未来可扩展至其他治疗模式，如疫苗、融合蛋白和寡核苷酸，并且该框架也可用于解析自上而下的质谱数据。通过开发一个带有图形用户界面（GUI）的开源独立桌面应用程序，我们希望克服在无法将专有信息上传至基于网络工具的环境中使用所受到的限制。本文介绍了该工具 mAbScale 的算法及其在不同抗体类治疗模式中的应用。

引言

在过去二十年中，生物治疗药物已发展成为现代制药行业的支柱。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV2）大流行及其他危及生命的疾病进一步加大了对生物制药分子更快速、更广泛开发的需求^1,2,3。

生物治疗药物的分子量对于分子的鉴定至关重要，需结合其他分析检测方法共同使用。完整分子及还原亚基的分子量贯穿于发现和开发的整个生命周期，作为控制策略的一部分，以确保产品质量，如QTPP（质量目标产品概况）所述⁴。

生物制药行业的分析开发在很大程度上依赖于质量测定，用于完整分子量分析以及通过肽图谱或多重属性方法（MAM）监测进行深度表征。这些基于现代质谱（MS）平台的技术核心在于实现高分辨率准确质量（HR/AM）测定的能力。大多数HR/AM仪器的质量准确度范围为0.5–5 ppm，并随分子量范围变化。对完整大分子进行准确质量测量的能力，使得大分子治疗药物能够被快速且可靠地鉴定。由于在常规实验条件下无法对大分子（>10 kDa）实现同位素分辨，因此必须计算其平均质量用于比对和鉴定^5,

方案

mAbScale 的高级工作流程如图2所示。每个步骤均包含更为复杂的内部决策分支、循环和组合逻辑。详细的算法工作流程描述了计算过程，见补充图1。应用程序的输出结果将保存在用户选定文件夹中的电子表格格式文件中。输出文件包含多个独立的工作表，可分为用户输入、分子量计算以及平均同位素质量推导的参考信息（示例输出见补充表格）。用户输入工作表包括用户输入的蛋白质氨基酸序列及其他信息、平均元素质量以及糖链质量，这些数据用于计算元素组成和不同形式的分子量。分子量计算工作表包括各种形式的化学组成、有无糖基化和化学修饰的还原质量，以及有无糖基化和化学修饰的完整质量。如果用户在输入页面中输入了两条不同的重链（HC）和/或两条不同的轻链（LC），系统将自动生成包含半抗体质量的工作表，因为半抗体是需要相对于目标异源二聚体进行鉴定和定量的主要杂质。mAbScale 的源代码可通过以下代码仓库获取：https://github.com/kkhatri99/mAbScale。

结果

选择了多种单克隆抗体（mAbs）以代表不同类型的mAbs。选用一种 commercially available mAb 标准品来代表具有相同重链、相同轻链以及在Fc区含有一个N-连接糖基化位点的传统mAb。 还选择了具有额外轻链N-连接糖基化的单克隆抗体、双特异性单克隆抗体以及抗体-药物偶联物（ADC）单克隆抗体，以拓展其应用范围。这些示例单克隆抗体的化学组成、计算质量、实测质量及质量误差汇总如下 表1mAbScale 报道的蛋白质化学组成和计算质量经 GPMAW 确认¹⁶一种用于蛋白质和多肽一级结构分析的程序。

进行完整分子量分析时，将单克隆抗体样品用液相色谱-质谱级水稀释至1 mg/mL后进样分析。进行还原分析时，样品首先用二硫苏糖醇处理，并在37 °C孵育15分钟，以断裂链间二硫键。所有样品均采用与质谱仪联用的Acquity UPLC系统进行分析。使用BEH 200 SEC色谱柱，以水/乙腈（65:35）含0.1%三氟乙酸作为流动相，通过等度洗脱方法实现在线脱盐以及重链与轻链的分离。.......

讨论

mAbScale 提供了一个直观的用户界面，具有灵活调整质量与元素计算基本模块的功能。用户需对目标分子具备基本了解，以便正确使用该应用程序、推导准确的质量数据并解读结果。例如，完整分子或还原后分子的质量输出表可能因包含大量完整或还原质量数据而显得复杂，这是因为默认的糖链数据库包含 88 种常见于治疗性抗体 Fc 区域的 N-连接糖链，而该应用程序会计算数据库中所有可能的糖型质量^18,19。尽管大多数治疗性单克隆抗体经过工程化设计以去除 Fab 区域的糖基化，但某些单克隆抗体仍可能保留该糖基化位点，这将进一步增加糖基化蛋白异构体的总数。建议用户根据特定分子定制糖链数据库，聚焦于最相关的糖型，以降低输出结果的复杂性，并使计算结果更贴近实测质量，从而有助于质谱峰的鉴定。

由于轻链和重链的异质性，双特异性抗体（bsAbs）的复杂程度进一步增加。该软件应用程序可根据提供的轻链（LC）、重链（HC）序列及糖型，生成所有可能的排列组合，从而预测抗体亚基错配或配对不完全所产生的各种.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Acquity UPLC 系统	Waters Corp., Milford, MA	N/A	模块化系统
抗体-药物偶联物（ADC）	GlaxoSmithKline	N/A	专有分子
BEH 200 SEC 色谱柱	Waters Corp., Milford, MA	176003904
双特异性单克隆抗体	GlaxoSmithKline	N/A	专有分子
Byos	Protein Metrics, Cupertino, CA	https://proteinmetrics.com/byos/ 版本 4.5
GPMAW	GPMAW	http://www.gpmaw.com/
LC-MS 级水	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	W6-1
单克隆抗体标准品	Waters Corp., Milford, MA	186009125	Waters 人源化单克隆抗体质量校验标准品
mAbScale	GlaxoSmithKline	Apache 许可证，版本 2.0
Xevo G2 Q-TOF 质谱仪	Waters Corp., Milford, MA	N/A	模块化系统