需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种用于抗体类治疗分子质量计算的开源框架

2.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65298

⸱

2023年6月16日

 ,  , 
1GlaxoSmithKline, 2Merck, 3Moderna

本文内容

摘要

本文介绍了使用软件应用程序 mAbScale 来计算基于单克隆抗体的蛋白质治疗药物的质量。

摘要

生物治疗药物的质量测定是验证其身份和结构完整性的方法。对完整蛋白质或蛋白质亚基进行质谱分析（MS）为生物制药研发的各个阶段提供了一种简便的分析工具。当质谱测得的实验质量在理论质量的预定义质量误差范围内时，即可确认蛋白质的身份。尽管目前已有一些用于计算蛋白质和多肽分子量的计算工具，但这些工具要么并非专为生物治疗分子的直接应用而设计，要么因需付费授权导致使用受限，要么要求将蛋白质序列上传至服务器主机。

我们开发了一种模块化的质量计算程序，可便捷地确定治疗性糖蛋白（包括单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和抗体-药物偶联物（ADC））的平均质量或单一同位素质量及其元素组成。该基于 Python 的计算框架具有模块化特性，未来可扩展至其他治疗模式，如疫苗、融合蛋白和寡核苷酸，并且该框架也可用于解析自上而下的质谱数据。通过开发一个带有图形用户界面（GUI）的开源独立桌面应用程序，我们希望克服在无法将专有信息上传至基于网络工具的环境中使用所受到的限制。本文介绍了该工具 mAbScale 的算法及其在不同抗体类治疗模式中的应用。

引言

在过去二十年中，生物治疗药物已发展成为现代制药行业的支柱。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV2）大流行及其他危及生命的疾病进一步加大了对生物制药分子更快速、更广泛开发的需求1,2,3。

生物治疗药物的分子量对于分子的鉴定至关重要，需结合其他分析检测方法共同使用。完整分子及还原亚基的分子量贯穿于发现和开发的整个生命周期，作为控制策略的一部分，以确保产品质量，如QTPP（质量目标产品概况）所述4。

生物制药行业的分析开发在很大程度上依赖于质量测定，用于完整分子量分析以及通过肽图谱或多重属性方法（MAM）监测进行深度表征。这些基于现代质谱（MS）平台的技术核心在于实现高分辨率准确质量（HR/AM）测定的能力。大多数HR/AM仪器的质量准确度范围为0.5–5 ppm，并随分子量范围变化。对完整大分子进行准确质量测量的能力，使得大分子治疗药物能够被快速且可靠地鉴定。由于在常规实验条件下无法对大分子（>10 kDa）实现同位素分辨，因此必须计算其平均质量用于比对和鉴定5,6。

典型的完整蛋白或亚基蛋白质谱反映了整体的蛋白异构体谱型，其中包含了由翻译后修饰（PTM）以及任何一级结构差异（如剪切片段或序列变异）所产生的各种分子形式的综合信息。这类检测方法操作相对简便且通量较高，因此在蛋白表征以及作为过程监控手段方面具有吸引力7,8。这些实验的数据分析通常需要用户预先定义分子形式的搜索范围（如PTM或其他分子形式的种类和范围）。对于糖基化蛋白而言，该搜索范围主要受糖型异质性的影响。多种PTM的组合、二硫键构象以及其他一级结构上的变异使得计算所有可能分子形式的过程极为繁琐。因此，人工计算可能的分子形式不仅耗时耗力，而且极易引入人为错误。

本文介绍了一种质量计算工具，该工具在设计时考虑了生物治疗分子（如单克隆抗体、双特异性抗体、抗体药物偶联物等）的最重要特征。该工具允许便捷地引入搜索空间变量，以实现对分子质量及元素组成的准确计算。该工具的模块化特性使其能够进一步拓展，应用于其他类型分子的质量计算与质量匹配。

GUI 模块允许用户指定质量计算的输入参数，如图 1所示；具体而言，用户需输入轻链和重链抗体的单字母氨基酸序列。重链N端环化和C端赖氨酸剪切等常见修饰以复选框形式提供。此外，可通过相应的Chem Mod文本框对这些蛋白链添加或减去化学式/元素组成。这使用户能够灵活地添加包含多种翻译后修饰的元素组成，或在抗体偶联药物（ADC）情况下添加小分子载荷。由于大多数治疗性单克隆抗体经过工程化改造以去除轻链中的糖基化位点，因此轻链中的糖基化被设为可选项，可通过GUI界面上的复选框进行指定。

对抗体进行完整质谱分析时，一种常见的变异方法是还原亚基质谱分析，该方法通过还原链间二硫键使轻链与重链分离。根据所用还原剂的强度不同，链内二硫键可能被断裂，也可能保持完整。用户可根据IgG亚型或半胱氨酸偶联抗体药物偶联物（ADC）的具体情况，灵活输入二硫键的总数9。

该程序以自下而上的方式计算质量，首先分别计算各条重链和轻链的元素组成。接着，通过调整计算所得的元素组成，考虑重链（HC）N端环化及赖氨酸剪切（Lys-clipping）的影响。然后将用户指定的任何化学修饰应用于重链和/或轻链。根据分析类型及用户指定的二硫键连接模式，对两条多肽链的氢原子数目进行相应调整。糖基化重链（HC）和轻链（LC）（可选）的质量根据用户输入进行计算。最后，将多个重链和轻链的质量组合，并自动更新二硫键数量，以完成完整分子质量的计算。

对于完整蛋白质等较大分子，由于使用典型分辨能力的质谱仪时存在累积的质量偏差，无法测量其单一同位素质量。因此，通常测量或报告的是标称质量或平均质量5,10,11,12,13。平均元素质量可能因所采用的质量数据来源不同而有所差异14,15。尽管各元素质量的差异可能很小，但在大分子分子量计算中，这些差异可能累积成显著的数值。软件应用程序默认使用的平均元素质量列于补充表1中。在生物制药研发（R&D）等受监管的环境中，保持分子质量的一致性至关重要，因为质量的变化可能在法规申报过程中被解读为分子实体本身发生了改变。为了确保元素质量使用的一致性，软件工具中包含了一个元素质量字典，以逗号分隔值（csv）文本文件形式提供：Element_Mass.csv （补充编码文件1）。类似地，还包含了一个通常在单克隆抗体（mAbs）上观察到的糖链组成的 curated 列表：Glycan.csv （补充编码文件2）。这两个文件均保存在可执行程序所在的同一文件夹中，用户可根据需要修改，以使用特定的元素质量列表或糖链库。

蛋白质修饰界面；序列分析，二硫键计数；化学修饰示意图。
图 1：mAbScale 应用程序的图形用户界面（GUI）。 该 GUI 模块允许用户设定质量计算的输入参数。用户需输入抗体轻链和重链的单字母氨基酸序列。重链N端环化和C端赖氨酸剪切等常见修饰以复选框形式提供选项。可通过相应的 Chem Mod 文本框添加或减去化学式/元素组成。请点击此处查看该图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

mAbScale 的高级工作流程如图2所示。每个步骤均包含更为复杂的内部决策分支、循环和组合逻辑。详细的算法工作流程描述了计算过程，见补充图1。应用程序的输出结果将保存在用户选定文件夹中的电子表格格式文件中。输出文件包含多个独立的工作表，可分为用户输入、分子量计算以及平均同位素质量推导的参考信息（示例输出见补充表格）。用户输入工作表包括用户输入的蛋白质氨基酸序列及其他信息、平均元素质量以及糖链质量，这些数据用于计算元素组成和不同形式的分子量。分子量计算工作表包括各种形式的化学组成、有无糖基化和化学修饰的还原质量，以及有无糖基化和化学修饰的完整质量。如果用户在输入页面中输入了两条不同的重链（HC）和/或两条不同的轻链（LC），系统将自动生成包含半抗体质量的工作表，因为半抗体是需要相对于目标异源二聚体进行鉴定和定量的主要杂质。mAbScale 的源代码可通过以下代码仓库获取：https://github.com/kkhatri99/mAbScale。

化学组成计算过程；流程图；肽序列；糖型质量；Excel结果。
图2：使用该应用程序计算元素组成和质量所涉及步骤的概览。 可使用颜色编码与补充图1中描述的流程相对应。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 打开 mAbscale 应用程序

  1. 通过双击可执行文件的图标来打开软件应用程序。

2. 序列录入

  1. 在标有1的相应文本框中输入重链和轻链序列，序列中不得包含任何空格。
    1. 对于双特异性抗体（bsAbs），在标有2的第二组文本框中添加额外的重链或轻链。对于具有相同重链和轻链的单克隆抗体（mAbs），请将2留空。
    2. 如果适用重链末端变体，请勾选N端环化和/或C端截短复选框。
    3. 将任何化学修饰（包括抗体偶联药物（ADC）分子的连接子和载荷）添加到重链化学修饰和/或轻链化学修饰文本框中。
      1. 以元素组成为形式指定修饰，例如 CaCl2。该修饰将被添加至相应的蛋白质亚基或链上。
        ​注意：通过在元素组成前添加负号“-”，可从亚基或链中减去该化学组成。例如，-H2O 将从亚基的组成和质量中减去一个水分子。

3. 确定二硫键的数量

  1. 在标记为二硫键总数的文本框中指定蛋白质分子中二硫键的数量。
  2. 根据还原程度（完全或部分），将未还原重链二硫键的数量输入到未还原重链二硫键文本框中，将未还原轻链二硫键的数量输入到未还原轻链二硫键文本框中。
    注意：单克隆抗体亚基的还原质量分析涉及通过还原/分离二硫键连接的重链和轻链。
  3. 如果单克隆抗体轻链上存在糖基化，请勾选轻链发生糖基化复选框。

4. 设置输出文件夹并运行程序

  1. 点击 浏览 按钮，在 输出文件夹 文本框中选择一个输出文件夹。
  2. 在 Excel 文件（无扩展名） 文本框中输入输出文件名（无需文件扩展名，将自动保存为 .xlsx 格式）。
  3. 点击 提交 按钮以启动应用程序。输出文件将保存在指定的文件夹中。
    ​注意：可通过编辑分隔符文本文件 Element_Mass.csv（补充编码文件 1）和 Glycan.csv（补充编码文件 2）来自定义元素质量及糖链列表。这些文件必须与可执行文件 mAbScale.exe（补充编码文件 3）位于同一文件夹中，程序才能正常运行。每次运行后，应用程序将自动关闭。若需进行第二次计算，用户需重新启动该程序。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

选择了多种单克隆抗体（mAbs）以代表不同类型的mAbs。选用一种 commercially available mAb 标准品来代表具有相同重链、相同轻链以及在Fc区含有一个N-连接糖基化位点的传统mAb。 还选择了具有额外轻链N-连接糖基化的单克隆抗体、双特异性单克隆抗体以及抗体-药物偶联物（ADC）单克隆抗体，以拓展其应用范围。这些示例单克隆抗体的化学组成、计算质量、实测质量及质量误差汇总如下 表1mAbScale 报道的蛋白质化学组成和计算质量经 GPMAW 确认16一种用于蛋白质和多肽一级结构分析的程序。

进行完整分子量分析时，将单克隆抗体样品用液相色谱-质谱级水稀释至1 mg/mL后进样分析。进行还原分析时，样品首先用二硫苏糖醇处理，并在37 °C孵育15分钟，以断裂链间二硫键。所有样品均采用与质谱仪联用的Acquity UPLC系统进行分析。使用BEH 200 SEC色谱柱，以水/乙腈（65:35）含0.1%三氟乙酸作为流动相，通过等度洗脱方法实现在线脱盐以及重链与轻链的分离。...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

mAbScale 提供了一个直观的用户界面，具有灵活调整质量与元素计算基本模块的功能。用户需对目标分子具备基本了解，以便正确使用该应用程序、推导准确的质量数据并解读结果。例如，完整分子或还原后分子的质量输出表可能因包含大量完整或还原质量数据而显得复杂，这是因为默认的糖链数据库包含 88 种常见于治疗性抗体 Fc 区域的 N-连接糖链，而该应用程序会计算数据库中所有可能的糖型质量18,19。尽管大多数治疗性单克隆抗体经过工程化设计以去除 Fab 区域的糖基化，但某些单克隆抗体仍可能保留该糖基化位点，这将进一步增加糖基化蛋白异构体的总数。建议用户根据特定分子定制糖链数据库，聚焦于最相关的糖型，以降低输出结果的复杂性，并使计算结果更贴近实测质量，从而有助于质谱峰的鉴定。

由于轻链和重链的异质性，双特异性抗体（bsAbs）的复杂程度进一步增加。该软件应用程序可根据提供的轻链（LC）、重链（HC）序列及糖型，生成所有可能的排列组合，从而预测抗体亚基错配或配对不完全所产生的各种...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

本软件在 Apache 2.0 许可下发布。版权所有 (2022) GlaxoSmithKline Research & Development Limited。保留所有权利。本软件已根据 Apache 许可证 2.0 版（以下简称“"许可证"）获得许可；除非遵守该许可证条款，否则不得使用本文件。您可以在 http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0 获取许可证副本。除非适用法律要求或书面同意，根据许可证分发的软件均按“"现状"”提供，不附带任何形式的明示或暗示的担保或条件。有关许可权限和限制的具体条款，请参见许可证。L.C. 为葛兰素史克（GSK）员工。T.H. 和 K.K. 在 GSK 任职期间开发了本软件，目前分别为默克（Merck）和莫德纳（Moderna）的合作者。

致谢

作者感谢 Robert Schuster 在数据验证方面的协助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Acquity UPLC 系统 Waters Corp., Milford, MAN/A模块化系统
抗体-药物偶联物（ADC）GlaxoSmithKlineN/A专有分子
BEH 200 SEC 色谱柱 Waters Corp., Milford, MA176003904
双特异性单克隆抗体GlaxoSmithKlineN/A专有分子
ByosProtein Metrics, Cupertino, CAhttps://proteinmetrics.com/byos/
版本 4.5
GPMAWGPMAWhttp://www.gpmaw.com/
LC-MS 级水 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAW6-1
单克隆抗体标准品 Waters Corp., Milford, MA186009125Waters 人源化单克隆抗体质量校验标准品
mAbScaleGlaxoSmithKlineApache 许可证，版本 2.0 
Xevo G2 Q-TOF 质谱仪Waters Corp., Milford, MAN/A模块化系统

参考文献

  1. Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
  2. Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).
  3. Wang, M. -Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).
  4. ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline (2018).
  5. Donnelly, D. P., et al. Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry. Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).
  6. Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).
  7. Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).
  8. Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches. Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).
  9. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of IgG molecules. mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  10. Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).
  11. Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).
  12. Valeja, S. G., et al. Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).
  13. Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).
  14. Berglund, M., Wieser, M. E. Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).
  15. Wang, M., et al. The Ame2012 atomic mass evaluation. Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).
  16. Peri, S., Steen, H., Pandey, A. GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides. Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).
  17. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).
  18. De Leoz, M. L. A., et al. interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).
  19. Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential. Biologicals. 52, 1-11 (2018).
  20. Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. Modification site localization scoring integrated into a search engine. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).
  21. Chalkley, R. J., Clauser, K. R. Modification site localization scoring: Strategies and performance. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

一种用于抗体类治疗分子质量计算的开源框架
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。