本文介绍了一种利用共聚焦显微镜对线粒体网络进行扫描，通过活体骨骼肌成像来分析线粒体密度及纵向分布变化的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
线粒体是一种可根据细胞代谢需求而伸长、断裂和更新的细胞器。线粒体网络的重塑使健康的线粒体能够满足细胞的需求；然而，这种能力的丧失已被认为与多种疾病的发生或进展相关。在骨骼肌中，线粒体的密度和分布变化可见于运动、衰老、肥胖等多种生理和病理状态。因此，对线粒体网络的研究可能有助于更深入理解与这些状态相关的机制。
本文介绍了一种对大鼠活体骨骼肌纤维进行线粒体成像的实验方案。首先在松弛液中手工分离肌纤维，随后将其与一种用于活细胞线粒体荧光成像的探针（四甲基罗丹明乙酯，TMRE）共同孵育。通过共聚焦显微镜采用XYZ扫描模式记录线粒体信号，获得肌原纤维间线粒体（IMF）网络的共聚焦图像。之后，对共聚焦图像进行阈值设定和二值化处理。二值化后的图像中代表线粒体阳性的像素被统计，以计算线粒体密度。骨骼肌中的线粒体网络具有高密度的IMF群体，其沿纵向呈周期性分布，分布模式与横小管（TT）相似。 快速傅里叶变换（FFT）是一种用于评估TT分布的标准分析方法，可确定其分布频率及有序程度。本方案详细描述了FFT算法在分析骨骼肌线粒体纵向分布中的应用。
引言
线粒体形成高度动态的网络，主要由其伸长（融合）与断裂（分裂）之间的平衡所调控1,2，这一过程受到多种蛋白表达与活性的调节，例如线粒体融合蛋白1和2（Mfn1和Mfn2），以及视神经萎缩蛋白1（Opa1），它们分别调控线粒体外膜和内膜的融合1,2。当Drp1（动力相关蛋白）在Ser616位点被磷酸化时，主要调控线粒体的分裂过程3。
在骨骼肌中，线粒体网络根据其与细胞不同区域（肌原纤维、肌膜和细胞核）的相对位置，被明确划分为结构上定义清晰的亚群4,5。位于肌膜正下方的线粒体称为皮下肌膜线粒体（SSM），位于收缩丝之间的是肌原纤维间线粒体（IMF），而围绕细胞核分布的线粒体亚群则称为核周线粒体网络（PMN）。此外，已有研究提示这些线粒体亚群具有区域特异性的功能，并在代谢上表现出特化特征4,5。
细胞能量稳态的维持在很大程度上依赖于线粒体网络特定部位之间的相互作用与通讯（例如，IMF 与 SSM 的相互作用），而这种稳态是实现代谢功能和收缩功能的基础。4,6除了线粒体网络之间的相互作用外，线粒体还可与其他细胞器相互作用，形成结构和功能上的复合体。研究表明，线粒体可位于肌浆网（SR）附近，并靠近Ca2+ 释放单位（CRU），由横小管（TT）形成7。这一事实具有重要意义，因为线粒体 Ca2+ 在调节ATP合成和细胞凋亡中的摄取作用。最近，有研究发现其在调节胞质Ca2+ 瞬态现象也已被提出8.
横管（TT）是肌膜向内凹陷形成的结构，在心肌细胞和骨骼肌纤维的纵轴上呈周期性分布9,10，其分布模式与肌内膜（IMF）的分布相似5。由于横管在收缩功能中发挥重要作用，其分布的改变具有重要的生理意义。然而，目前对横管分布变化的研究主要集中于心肌细胞。通过快速傅里叶变换（FFT）分析，可将周期性信号从距离域转换至频率域，从而获得反映信号频率和规律性的FFT谱图11,12,13。尽管已有证据表明，骨骼肌纤维中线粒体网络的结构对于适应不同代谢状态（如肌肉损伤后的再生过程）至关重要14,15，但目前大多数分析仍以定性方式进行。
此外，由于线粒体功能障碍与多种骨骼肌相关疾病（例如失用性萎缩）2 以及非肌肉疾病（尤其是代谢性疾病）及其伴随的肌肉量减少（即萎缩）16 相关，对骨骼肌中线粒体网络及分布进行定量评估具有重要意义。最近，通过快速傅里叶变换（FFT）分析发现，肥胖组（Ob；Zucker fa/fa 大鼠）与瘦型组（Lean；Zucker +/+ 大鼠）的腓肠肌肌纤维中线粒体的纵向分布存在显著差异17。该研究证明了FFT在分析线粒体分布方面的有效性。因此，本实验方案提供了一种利用荧光共聚焦显微镜获取的图像，研究活体骨骼肌纤维中线粒体的方法。通过背景阈值法对线粒体密度进行定量，并描述了采用FFT分析线粒体纵向分布的方法。整个工作流程如图1所示。
方案
所有动物实验程序均经蒙特雷科技大学动物使用与护理委员会（CICUAL）评估并批准（方案编号 2019-007）。雄性Zucker（+/+ 和 fa/fa使用12至13周龄的大鼠进行本研究。动物饲养于标准的饲养条件下（12小时光照/12小时黑暗循环，40%-60%湿度），并可自由获取食物（标准大鼠饲料）和水 随意摄取.
1. 溶液组成
- 通过混合 表1 中列出的组分，配制新鲜的松弛液（Relax solution）。使用氢氧化钠（NaOH）将pH值调节至7.3。
- 使用金属离子游离浓度计算模拟程序，确定松弛液中的游离钙离子浓度。
- 在二甲基亚砜（DMSO）中配制5 mM的四甲基罗丹明甲酯（TMRE）储备液，并进一步稀释为0.1 mM的DMSO溶液。
2. 腓肠肌肌纤维束的解剖
- 将动物放入诱导室并盖上盖子。打开氧气源，将气体流速设为 0.5 L/min，并将蒸发器设为 4% 七氟烷以诱导麻醉。
- 当大鼠进入睡眠状态后，将其从诱导室中取出，置于仰卧位并维持麻醉。通过夹捏脚趾或尾巴来确认反射消失。
- 使用剪刀切开腹部的皮肤和肌肉。随后剪开胸腔，以暴露心脏。
- 进行心脏切除时，用镊子夹住心脏顶部的静脉和动脉，用剪刀剪断血管，取出心脏。
- 安乐死后立即用乙醇消毒后肢，并使用剃毛机剃除毛发。
- 固定后足，用剪刀在跟腱水平处切开皮肤。
- 在近端胫骨水平用剪刀切断后肢，将其转移至一个盛有 3 mL 冰冷 Relax 溶液的 60 mm 培养皿中，呈背侧朝上放置。加入足量溶液以防止肌肉干燥。
- 辨认跟腱，用镊子小心提起，用虹膜剪将肌肉从骨骼上分离。从此步骤开始，解剖过程中应使用体视显微镜。
- 辨认并分离出位于后肢背部的主要肌肉团块——完整的腓肠肌。
- 用尖头镊子剥离并弃除肌肉周围的结缔组织和脂肪组织。将肌肉的外侧头转移至一个新的含有冰冷 Relax 溶液的培养皿中（见图 2A）。
- 用镊子轻轻夹住肌肉一端，用显微剪小心地将其分离成肌束。操作肌束时，始终用镊子轻夹其一端进行处理。
注意：肌束长约 10 mm，宽约 2 mm。 - 将肌纤维束转移至一个含有 2 mL 冰冷 Relax 溶液的新培养皿中。仅选择表面光滑、完整贯穿两端且未缩短的肌束（图 2B）。
3. 通过共聚焦显微镜对骨骼肌线粒体进行活细胞成像采集
- 将纤维置于 2.5 × 10-4 在室温下用 Relax 溶液稀释的 mM TMRE 孵育 20 分钟。
注意：使用推荐的TMRE工作浓度时，应处于非淬灭模式。从此步骤开始需避光操作。 - 孵育期间：
- 打开共聚焦显微镜标准软件，选择 构型 框架，以及在 硬件配置 对话框中选择 激光 并检查 HeNe 543 选项
- 在 获取 框架，选择 采集 对话框中，并在 采集模式，选择 XYZ 面板.
- 在 XY 对话框，选择 512 × 512 格式，400 Hz 速度，并检查 针孔板在显示的针孔对话框中，选择 AU 用于单位并添加一个值 3艾里 针孔。
注意：如果能够保持足够的荧光信号，应考虑将针孔尺寸减小至最接近1艾里单位（Airy）最优标准。 - 在 光路设置 对话框中，选择20倍、数值孔径（NA）为0.7的水浸物镜20x/0.7 IMM），并选择576-700 nm的发射波长窗口。选择DD488/543滤光片组合，并将激光功率设为15% 543 激光器.
注意：强烈建议使用水浸物镜进行活体成像扫描（如有条件）。因为浸没介质与培养介质具有相似的折射率。
- 孵育20分钟后，更换孵育液两次。确保在孵育后20-30分钟内获取共聚焦图像。
- 使用厚度为0.15 mm的硼硅酸盐玻璃盖玻片制备记录室。
注意：根据可用的记录腔室选择盖玻片的厚度，通常厚度在0.15至0.22 mm之间时性能最佳。 - 添加 200 µL 向记录室中加入松弛液，并转移纤维束。
- 在共聚焦显微镜下，使用明场模式识别可用于线粒体荧光记录的存活肌纤维。存活肌纤维应完整、未收缩，并具有完整的横纹结构。
- 用镊子将纤维束彼此分离并排列整齐，选择最靠近盖玻片的纤维束。
- 使用以下方法扫描荧光信号 活体按钮 在控制面板控制台中调整增益和偏移时需考虑以下因素：
- 选择较低的荧光强度值，使背景接近 0 任意单位（A.U.）。
- 在增益水平之间进行选择 100 和 200 A.U. 以避免记录系统的饱和。因此，不要记录最高的荧光水平。
- 选择150-190 nm的像素尺寸以获取纤维的全宽，通过调整缩放倍数来实现 XY 对话框
注意：建议使用接近奈奎斯特准则的像素尺寸（90 nm），以便对纤维的全宽度进行扫描。
- 在Z轴堆叠对话框中，调整 Z 距离 从初始阶段开始获取荧光信号 纤维深度 的 15 µm （开始按钮） 最多 22 µm （结束按钮）选择 3 µm 作为Z轴步长。
- 点击 开始 按钮以获取共聚焦图像。获取由三幅在不同深度采集的共聚焦图像组成的Z轴层扫图像。 15, 18，以及 21 µm 的 深度.
4. 线粒体密度分析
- 在用于生物图像分析的开源平台中18 打开Z轴堆栈文件，并旋转图像使纤维呈水平方向，如图所示 图3B.
- 随机选择一个包含线粒体所在区域的兴趣矩形区域（ROI）（ROI线粒体）。选择 感兴趣区域线粒体 大小范围从65到 90 µm 对于X。对于Y，尺寸将取决于纤维宽度，避免其边缘区域。
- 复制选定的Z轴层叠图像 ROI线粒体 并将其保存为一个新的Z轴层叠图像（Mito-stack) 的 TIFF 格式。保存 ROI线粒体 在原始图像栈中选择的位置 ROI 管理器 工具。
- 按如下方法计算背景减除的阈值：
- 使用快捷方式 command+shift+t 打开 阈值 对话框
- 选择阈值算法 Otsu |B&W | 深色背景 选项。观察图像现已变为二值化。
- 在 阈值 对话框中，观察荧光强度分布的直方图及显示的阈值。
注意：线粒体阳性像素的荧光强度值高于阈值，在二值图像中显示为白色像素。 - 对二值图像序列应用阈值 应用. 在所示的 将堆栈转换为二进制 对话框中，选择相应选项 计算每幅图像的阈值，黑色背景，创建新堆栈，然后单击 好的.
- 观察到生成了一个包含三幅二值图像的图像栈（BinDMito-stack 以TIFF格式保存。
- 计算线粒体密度 BinDMito-堆栈 如下所示：
- 选择 分析 菜单。接下来，单击 直方图在显示的直方图对话框中，单击 是 以包含堆栈中的所有图像用于分析。
- 在 图像堆栈的直方图 对话框中，单击 列表 获取直方图数据。将直方图数据转移至电子表格。
- 在电子表格中识别 线粒体像素 那些具有 255 值。计算 线粒体密度 使用公式（1):
线粒体密度 =
× 100 (1)
总像素被识别为 N 在“直方图”对话框中或通过在电子表格中对直方图的像素数量求和来计算。 - 计算线粒体所占面积（µm2)，将 Mito-pixels 的 BinDMito-堆栈 由 像素大小.
5. 通过快速傅里叶变换分析线粒体分布
- 在用于生物图像分析的开源平台中，打开 BinDMito-堆栈 并绘制一条 矩形感兴趣区域 的 256像素宽度 和 5 µm 高度在中央位置和侧向位置分别选择一个ROI，如图所示 图4A，B.
- 使用 ROI 管理器 用于配置FFT分析的感兴趣区域并保存的工具。
注意：根据分析需求，可在不同位置选择其他感兴趣区域（ROI），并调整其大小。但其宽度必须等于2n 像素以执行快速傅里叶变换（例如，128、256、512 像素）。 - 使用快捷方式获取 ROI 的剖面图 command + k 并将数据转移至电子表格。
- 在电子表格中填写 B 和 C 将图表分析所得数据填入相应的列中。 B 列包含距离信息 µm，以及 C 柱状图显示荧光强度的相应灰度值（A.U.）。
- 该 D 列对应于FFT频率（事件/µm），将按如下方式填充：
- 计算采样频率（Fs): Fs = 1/Δd，其中 Δd 是距离步长（第二个值） B).
- 计算 ΔFsΔFs = Fs/N， 其中 N 数据点的数量 B (256).
- 计算FFT频率的截止值S): S = (N/2 ×ΔFs
- 填充 D 柱状图如下所示：
- 第一个值 D 柱等于 0.
- 选择 第二个细胞 在 D 柱，前往 主菜单，选择 填充，然后单击 系列选择 柱. 对于 步骤值，使用 计算的 Δ Fs. 对于 终止值，使用 计算的 S.
- 接下来，填充 E 列，包含如下FFT复数值：
- 插入 0 在 第一个细胞 的 C 列，因为距离0必须与信号0重合，以便进行FFT计算。
- 然后，转到 数据 菜单，单击 数据分析，并选择 傅里叶分析.
- 在新窗口中，选择列中描述的荧光信号的数据点范围 C 输入范围。
注意：数据点的数量必须为2n （例如，256 或 128 个荧光信号数据点）。 - 选择相应的范围 E 输出范围。
- 选择 好的 并让FFT复数值自动填充。
- 填充 F 以FFT幅值作为列，如下所示：
- 使用 IMABS 函数 从复数中返回 F 的绝对值 E 并乘以 2/N 归一化（公式（2)):
FFT 幅值 = (IM.ABS (E1…En) × (2/N) (2)
- 使用 IMABS 函数 从复数中返回 F 的绝对值 E 并乘以 2/N 归一化（公式（2)):
- 使用 FFT 幅值绘制 FFT 谱 F，作为FFT频率的函数 D，直到 S。找到最大峰值点及其对应的 FFT 频率。
- 将最大峰的FFT频率通过公式（3该计算距离代表线粒体分布的纵向距离。
距离（µm) = 1/FFT 频率3)
注意：由于 FFT 对称性，不要绘制超过 FFT 频率的图像 S 值，对应于一半的数据点，以避免FFT频谱的重复。
6. 图像分析前可选的预处理步骤以降低图像噪声
- 应用中值滤波或二维去卷积，步骤如下：
- 用于中值滤波：
- 选择 流程 | 滤器 并点击 中位数 选项
- 在所示的 中位数 对话框中，选择 2.0 用于 半径 并单击 好的选择 是 将该流程应用于所有图像 Mito-stack.
- 观察图像中噪声的减少。
- 用于二维去卷积：
- 生成理论点扩散函数（PSF）。
- 下载插件 PSF_Generator.jar 并将文件放入“Plugins”文件夹中。
- 在 PSF 发生器 对话框中，点击该选项 博恩 & Wolf 3D 光学模型，输入 折射率浸液值 的 1.33 共聚焦扫描过程中使用，并选择 最佳 对于 准确率计算 选项
- 捕获 576 nm 用于 发射波长好的，这是译文： ， NA 的 物镜 使用于 0.7，以及 Z步进 的 3,000 nm.
- 捕获 像素尺寸 XY 待去卷积的共聚焦图像及其尺寸 XYZ 表示X和Y方向的像素数量以及Z方向的步数（3 （针对本方案）。
- 在 显示 菜单的 PSF 发生器，点击该选项 线性的，选择 8 位分辨率，然后选择 灰色 查找表（LUT）选项。
- 运行 PSF 发生器 并将生成的理论点扩散函数以TIFF格式保存。
- 对通过打开生成的点扩散函数（PSF）的切片求和 Z轴投影 选项工具 堆叠 位于 图像 菜单
- 在所示的 Z轴投影 对话框中，选择 切片求和 对于 投影类型，然后单击 好的将新的点扩散函数以TIFF格式保存。
注意：可通过共聚焦扫描已知直径的荧光微球实验获得点扩散函数（PSF），以替代理论PSF。 - 下载插件“DeconvolutionLab_2.jar”19 并将其放入插件文件夹中。
- 点击菜单 插件接下来，单击 DeconvolutionLab2.
- 分离共聚焦图像 Mito-stack 使用该工具 待堆叠的图像 从 堆叠 位于的选项 图像 菜单并以TIFF格式保存。
- 在 DeconvolutionLab2 对话框中，选择从获得的图像中的一个 线粒体堆叠. 选择 理论点扩散函数 创建，并选择算法 理查森-露西 与 15 次迭代.
- 运行 DeconvolutionLab2，验证图像中的信号增强与噪声减少效果，并以TIFF格式保存。
- 用于中值滤波：
- 继续进行步骤4.4的图像分析。
- 对于去卷积图像的阈值处理，将其转换为 8位掩膜 在……期间 阈值化处理过程. 创建一个 堆叠 通过选择二值化和去卷积图像 图像堆叠 在 堆叠 工具的 图像 菜单
- 对于去卷积图像的FFT分析，轮廓图包含以像素为单位的距离。将像素单位转换为 µm 如下所示：
- 在电子表格中，完成步骤 5.4 后，将数据从 B 到 A接下来，填充 B 与 距离 在 µm 通过将每个像素数值乘以 A 由像素大小决定。
结果
按照本方案，可在活体骨骼肌中实现线粒体密度与分布的分析。该方案分为三个主要阶段：骨骼肌束解剖、共聚焦显微镜扫描以及图像分析。工作流程概览见图1。图2A显示了培养皿中完整的大鼠腓肠肌，标示出获取肌纤维的外侧头；而图2B展示了置于松弛液（Relax solution）中的肌纤维束。通过共聚焦显微镜，可利用荧光探针TMRE记录活体骨骼肌纤维纵深方向的线粒体。TMRE是一种亲脂性阳离子荧光染料，可根据线粒体膜电位选择性地在线粒体内聚集20。
通过选择合适的Z轴距离，可获得最佳的肌内脂肪（IMF）共聚焦图像 15 µm 纤维内部的深度图3A). 图3B 显示沿腓肠肌纤维Z轴距离（15至 21 µm). 采用阈值处理对共聚焦图像进行处理，将其转换为二值图像，以便进行线粒体分析。 图3B （左侧面板）显示了一根来自运动过的瘦型大鼠的肌纤维。该图像代表了骨骼肌纤维线粒体典型的共聚焦记录，因为其在线粒体分布上沿肌纤维呈现出一致的规律性模式。相比之下，我们选取了一根来自肥胖型（Ob）大鼠的肌纤维（图3B线粒体含量和分布发生显著改变（右侧面板）。 图 3C 显示由每个二值化图像（见图中插图）获得的线粒体密度，即线粒体所占纤维区域的定量结果 B）。与预期一致，Ob纤维的线粒体密度较低。该结果在所分析的Z轴距离范围内均保持一致，这一现象同样可见于 图3D 当线粒体密度按共聚焦图像堆栈计算时，该堆栈由在15、18和 21 µm.
与线粒体密度分析类似，使用荧光探针（如 TMRE）对活细胞进行共聚焦扫描，可用于研究活体骨骼肌中线粒体的纵向排列。线粒体网络（IMF）在靠近横小管（TT7）的I带区域呈现周期性排列，可通过快速傅里叶变换（FFT）分析来量化线粒体信号的频率及其有序程度17。图4展示了来自瘦型和肥胖型大鼠腓肠肌中线粒体网络（IMF）排列的差异，以及FFT如何揭示线粒体信号分布的变化。图4A、B显示了在肌纤维中央和侧向位置选定的纵向感兴趣区域（ROI），用于FFT分析。在执行FFT之前，需计算阈值以扣除背景信号，随后对图像进行二值化处理；这些步骤可消除线粒体荧光信号强度的差异。二值化图像提供了进行FFT所必需的荧光分布轮廓图。
图4C、D 显示了面板 A 和 B 中选定的感兴趣区域（ROI）及其对应的轮廓图（上图）。从轮廓图中可以观察到瘦型（Lean）和肥胖型（Ob）大鼠来源肌纤维间线粒体荧光分布的差异，以及同一肌纤维内不同感兴趣区域之间的变化。每个轮廓图均对应显示其快速傅里叶变换（FFT）频谱（下图）。FFT频谱峰值所对应的频率值（X轴）反映了线粒体信号沿肌纤维纵向分布的空间频率。在瘦型大鼠的侧部和中央感兴趣区域，该频率可转换为约2 µm的距离值。值得注意的是，FFT峰值的幅值可作为线粒体信号规律性的指标，其振幅的变化揭示了线粒体分布模式的改变。
图4E、F展示了瘦型和肥胖型来源肌纤维在侧区和中心区ROI分析中FFT谱的差异。在侧区ROI（图4E）中，瘦型与肥胖型来源肌纤维的线粒体纵向分布频率相似；然而，肥胖型来源肌纤维的最大FFT峰振幅更高，这与图4B图像中观察到的信号规律性增强一致。然而，在存在线粒体分布显著改变的情况下，肥胖型中心ROI（图4F）表现为相较于瘦型FFT峰显著降低的典型例子。
图1：通过共聚焦显微镜进行骨骼肌线粒体分析的流程示意图。 本示意图总结了该实验方案的三个主要阶段。第一阶段为腓肠肌肌纤维束的解剖，进一步细分为三个连续步骤：首先分离腓肠肌，随后通过机械解剖将肌肉分解为纤维束，最后进行活性纤维束的视觉筛选。第二阶段为利用共聚焦显微镜进行活细胞成像，包括在室温下用荧光染料（TMRE）孵育20分钟，然后将纤维置于成像腔室中。随后，在显微镜上设置合适的参数以获取共聚焦图像。第三阶段进行共聚焦图像处理与数据分析。图像处理起始时需设定阈值，生成二值化图像，并据此计算线粒体密度，同时通过快速傅里叶变换（FFT）分析线粒体分布。缩写：TMRE = 四甲基罗丹明乙酯；FFT = 快速傅里叶变换。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：骨骼肌束的解剖。（A）在含有 Relax 溶液的培养皿中分离出的大鼠外侧腓肠肌头（黑色箭头）。（B）在加载 TMRE 前，含有 Relax 溶液的腓肠肌纤维束的代表性图像。缩写：TMRE = tetramethylrhodamine ethyl ester。请点击此处查看该图的放大版本。
图3线粒体密度分析 (A) 示意图展示了在骨骼肌纤维中对 IMF 线粒体进行共聚焦扫描时推荐的 Z 距离。B) 用TMRE染色的骨骼肌纤维线粒体的共聚焦图像序列，分别来自运动后的Zucker +/+大鼠（瘦型）和肥胖型Zucker大鼠 fa/fa 大鼠（Ob）在Z轴距离（从15到 21 µm 深度）的图像经过阈值处理，转换为二值图像。C) 在图层面板中观察到的不同Z距离下获得的共聚焦切片的计算线粒体密度 B. (D由图层面板中观察到的图像组成的图像栈所获得的线粒体密度 B. 图中各图 B 65 x 50 µm比例尺 = 10 µm缩写：Mito-density = 线粒体密度；IMF = 肌原纤维间线粒体；Ob = 肥胖；SSM = 肌膜下线粒体。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：通过快速傅里叶变换（FFT）分析线粒体分布。 代表性共聚焦图像显示了使用荧光探针TMRE染色的线粒体，图像采集自运动训练后的Zucker +/+ 大鼠（消瘦型，图A）和肥胖型Zucker fa/fa 大鼠（Ob，图B）骨骼肌纤维深度21 µm处。图像经阈值处理后转换为二值图像。图A（图C）和图B（图D）中标示的侧部和中央感兴趣区域（ROIs），及其相应的荧光强度分布图（上方曲线）和FFT频谱图（下方曲线）。FFT分析基于宽度为256像素的ROI，对应图A中ROI尺寸为39 × 5 µm，图B中ROI尺寸为50 × 5 µm。图E展示了来自消瘦型和肥胖型大鼠侧部ROI的FFT频谱差异，而图F展示了中央ROI的FFT频谱差异。比例尺 = 10 µm。缩写：A.U. = 任意单位；FFT = 快速傅里叶变换；ROIs = 感兴趣区域；Ob = 肥胖型。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 试剂 | 100 mL 中的终浓度 | 储备液 |
| K-天冬氨酸 | 100 mM | |
| KCl | 20 mM | |
| HEPES | 20 mM | |
| L-谷氨酸 | 3 mM | |
| 苹果酸 | 3 mM | |
| EGTA | 0.1 mM | 10 mM |
| MgCl2 | 1 mM 游离 Mg2+ | |
| CaCl2 | 0.00002 mM 游离 Ca²⁺ | |
| 磷酸肌酸二钠 | 5 mM | 500 mM |
| 肌酸磷酸激酶 | 5 U/mL | 200 U/mL |
| MgATP | 5 mM | |
| pH 7.3（用 NaOH 调节） |
表1：松弛溶液试剂及其浓度。
补充图 S1：图像预处理方法的影响。（A）来自运动后的Zucker +/+ 大鼠（瘦型，上图）和肥胖Zucker fa/fa 大鼠（下图）骨骼肌纤维中线粒体的代表性共聚焦图像，线粒体负载荧光指示剂TMRE，在18 µm深度采集，并分别展示经Otsu阈值法、中值滤波结合Otsu阈值法以及2D去卷积结合Otsu阈值法预处理后的对应图像。（B）采用不同预处理方法后，由共聚焦图像（图A）获得的线粒体密度（mito-density）的轮廓图。图A中的图像大小为65 × 50 µm。比例尺 = 10 µm。缩写：2D-Decon = 2D去卷积；Mito-density = 线粒体密度。请点击此处下载该文件。
讨论
线粒体是一类具有高度重塑能力的细胞器。其含量、密度和分布可通过激活线粒体融合与分裂机制（即线粒体动力学1）以及线粒体更新机制之间的平衡——包括线粒体生物发生和特化的线粒体降解途径——线粒体自噬（mitophagy）21,22——而迅速改变。线粒体的含量和形态可因细胞类型和发育阶段的不同而变化，并可在多种生理和病理刺激条件下发生重塑17,22,23,24。因此，对线粒体形态的研究已有半个多世纪的重要意义25。其中，通过电子显微镜进行线粒体分析一直是多项研究中采用的标准技术26。
近年来，共聚焦显微镜下的荧光研究因其能够在不同肌纤维深度对线粒体进行活细胞成像而日益受到重视，这有助于更深入地理解线粒体在骨骼肌不同适应性与非适应性状态中的作用27。本研究描述了一种利用共聚焦显微镜分析活体骨骼肌纤维中线粒体密度与分布的方法。使用活体骨骼肌纤维的主要挑战之一是从组织分离到线粒体共聚焦成像的整个过程中避免肌肉收缩。为实现这一目标，采用高镁和ATP松弛液17使肌纤维保持松弛状态至少2小时，从而为完成肌纤维分离、荧光探针负载以及共聚焦显微镜下线粒体信号采集提供充足时间。该实验方案的关键步骤在于机械法获取肌纤维，因其对操作精度和组织新鲜度要求较高；然而，采用此前已报道并验证的技术28，仍可从大鼠肌肉中获得具有活性的肌纤维束。获取完整肌纤维有助于维持肌膜结构及细胞内环境的完整性，从而保留细胞结构之间的代谢与功能相互作用28,29。
与使用组织或固定细胞不同，通过共聚焦显微镜获取活细胞成像荧光图像可实现对不同实验条件下效应的实时监测。本实验方案可用于实时探索线粒体密度和分布的变化，并比较不同实验组之间的差异，例如本文所示的瘦型（Lean）与肥胖型（Ob-derived）肌纤维之间的比较（图3 和 图4）。必须始终注意，活细胞成像需要在尽量减少细胞损伤的前提下，标准化最优工作条件。工作时间、所用溶液的质量、图像采集参数以及激光曝光均需精确控制。因此，以下列出了若干关键注意事项。
由于肌纤维的尺寸以及长时间激光照射可能造成的纤维损伤，无法通过共聚焦显微镜完整地记录肌纤维中线粒体的全长结构。然而，该技术仍可获取具有代表性的纤维样本图像。尽管可以通过共聚焦显微镜记录大鼠骨骼肌纤维的完整厚度，但这需要更长的成像时间和更高的激光暴露。在对照组大鼠中，此类记录通常不会出现问题。然而，病理状态下的肌纤维可能更易受损，例如在Ob大鼠的肌纤维中所观察到的情况。因此，更推荐获取在不同Z轴距离下获得的代表性共聚焦图像堆栈。当仅记录肌纤维部分厚度时，建议在所有被测纤维上以相同的深度采集图像堆栈，因为线粒体的分布和密度可能随其在纤维内的位置而变化。建议在深度超过15 µm的位置采集信号，以获得代表性的肌内膜线粒体（IMF）共聚焦图像，避免受到位于肌纤维周边区域的皮下线粒体群（SSM）的影响。
在进行共聚焦显微镜成像时，必须考虑一些重要因素。首先，应根据放大倍数、高数值孔径（NA）以及浸没介质来选择浸没式物镜。由于细胞维持在亲水性培养介质中，培养介质与浸没介质的折射率必须相近，才能获得良好的信号并实现对组织深层的有效扫描。通常使用水浸物镜来满足这一要求。图3 和 图 4 的共聚焦图像采用20倍、0.7 NA的水浸物镜获取。该物镜可记录纤维的完整深度信息，但选择在15、18和21 µm深度进行扫描，是因为在此深度可获得荧光信号强且纤维损伤较小的代表性肌内脂肪（IMF）共聚焦图像。也可考虑其他放大倍数（如40倍）及油浸介质，但需进一步评估。
其次，根据奈奎斯特采样定理计算成像采集的像素尺寸，以选择合适的像素大小，避免过采样（导致激光暴露过高）和欠采样（导致分辨率降低）30。该计算取决于所选物镜的特性及激发光波长（约90 nm）。像素尺寸可通过缩放倍数进行调整，因此仅存在一个最佳缩放设置可提供符合奈奎斯特准则的最优像素尺寸30。然而在实际操作中，缩放倍数还需考虑待分析样品区域的大小。因此，需在两者之间取得平衡，使所采用的像素尺寸尽可能接近奈奎斯特准则，同时又能覆盖待分析的区域。图 3 和 图 4 采用的像素尺寸分别为150 nm和190 nm，足以对直径约为50–80 µm的纤维全宽进行分析。
第三，应使用适当的针孔直径，以防止非焦平面的光线到达检测器。通常，1 阿贝单位（Airy）被认为是最佳的针孔尺寸，因为它允许检测到约 80% 来自焦平面的光子30。然而，某些荧光信号较弱的染色生物样本需要增大针孔尺寸30。由于在较小的阿贝单位下信号较弱，图 3 和 图 4 的共聚焦图像采用 3 阿贝单位的针孔尺寸采集。需要注意的是，增大针孔尺寸虽然可提高信号强度，但会因接收到更多非焦平面的光线而导致分辨率下降。因此，我们建议尽可能使用接近 1 阿贝单位的针孔尺寸。
当获得足够质量的共聚焦图像后，可对其进行处理，以获取线粒体密度和分布的定量信息。然而，在分析前必须进行关键的图像处理步骤——设定阈值，以提高信号定量的准确性。在此关键步骤中，需定义一个荧光强度值，用以区分代表线粒体的阳性像素与背景像素。当图像的直方图呈现双峰分布时，其中一个峰对应背景，另一个峰对应线粒体，此时可通过高斯拟合线粒体峰来确定阈值。然而，并非每幅图像都能获得双峰分布，因此需要采用其他阈值设定方法。
本方案描述了Otsu阈值分割方法的实现，这是一种非参数、无监督的方法，旨在当两个峰未完全分离或存在其他峰时寻找阈值31。可使用开源生物图像分析平台轻松应用Otsu方法；然而，也可尝试其他阈值分割方法。所有共聚焦图像必须采用相同的阈值分割方法，并且每个共聚焦图像需独立计算阈值。对整幅图像堆栈应用同一阈值会导致错误结果。在完成阈值分割获得二值图像后，可依照本方案所述步骤简便地进行线粒体密度分析和FFT分析。但在进行这两项分析时需注意避免将细胞核和毛细血管纳入分析区域，否则会导致定量误差。关于密度分析，只需从待分析的总像素数或总面积中减去细胞核或毛细血管所占的像素数或面积即可。此外，在进行FFT分析时，必须确认线粒体信号呈直线状。相反，若线粒体信号发生倾斜，则可能产生无法代表线粒体纵向分布的轮廓，从而导致FFT频谱数据不准确。此外，可应用预处理步骤以降低图像噪声。本方案介绍了两种可选的预处理方法：中值滤波和二维去卷积。这些预处理方法对图像及线粒体密度分析结果的影响见补充图S1。需要注意的是，尽管这些预处理步骤可改善图像质量，但也可能导致某些图像细节的丢失。因此，应谨慎使用，并确保在所有待分析图像中一致地应用相同的预处理方法。
尽管共聚焦显微镜具有诸多优势，但在采用最佳成像条件时，其横向分辨率（XY）仍受限于180–250 nm32。线粒体直径约为200–700 nm，接近共聚焦显微镜的衍射极限；因此，亚线粒体结构无法被充分检测33，也无法通过本实验方案中所示的密度和FFT分析进行评估。其他超分辨率显微技术，如随机光学重建显微镜（STORM）、受激发射损耗（STED）纳米显微镜或结构照明显微镜（SIM），可用于解析亚线粒体结构32。在本实验方案中，线粒体的共聚焦图像使用依赖线粒体膜电位的荧光探针TMRE获取。因此，线粒体的荧光强度会因其膜电位的不同而变化。为克服这一问题，在数据分析前需进行阈值化处理。所有高于设定阈值的像素均被视为线粒体信号阳性，而与其具体荧光值无关。然而必须指出，膜电位极低的线粒体无法通过该技术分辨。因此，建议辅以线粒体蛋白含量定量的互补性研究。使用TMRE的一个优势在于，共聚焦图像还可用于线粒体膜电位分析，但需设置适当的解耦联剂对照，例如羰基氰-p-三氟甲氧基苯腙（FCCP）。此外，线粒体密度与分布分析也可采用绿色荧光探针标记线粒体，这类探针可不依赖膜电位而进入线粒体，但其孵育策略和共聚焦成像参数需进行标准化优化。
鉴于线粒体结构与线粒体及细胞的基本功能密切相关，本文所述方案可为研究疾病状态下或特定应激损伤过程中线粒体的重塑提供有价值的信息。该方案有助于更深入地理解由线粒体调控的骨骼肌关键功能，例如能量生成，或线粒体在与其他细胞器相互作用中发挥重要作用的过程，如收缩-代谢偶联。遵循本方案的操作步骤，可在活体骨骼肌中估算线粒体的密度和分布情况。本方案分为三个主要阶段：骨骼肌束解剖、共聚焦显微镜扫描和图像分析，每个阶段均包含详细的操作说明和重要注意事项。值得注意的是，用户可根据自身需求进一步优化该方案，增加Z轴步进扫描层数，以实现肌纤维内线粒体的完整三维重建。例如，共聚焦成像和图像分析步骤也可用于研究在活体或固定样本中具有类似分布特征的其他细胞结构，如横小管（TT）。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由蒙特雷科技大学医学院及肥胖研究所资助。图3A 使用科学图像与插图软件制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 腺苷5′’三磷酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | A6419 | |
| 硼硅酸盐玻璃盖玻片 | Warner Instruments | 64-0709 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | TCS SP5 | |
| 共聚焦显微镜软件 Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
| 肌酸磷酸激酶 | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DeconvolutionLab2（DeconvolutionLab_2.jar） | 生物医学影像研究组，EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-天冬氨酸钾饱和半水合物 | Sigma-Aldrich | 11240 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N´N´四乙酸 | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| 镊子 | Miltex | MH-18 | |
| HC PL APO 20x/0.7 IMM 物镜 | Leica | 506517 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 虹膜剪 | Miltex | 5-304 | |
| L-(-)-苹果酸 | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| L-谷氨酸单钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Maxchelator | 加州大学戴维斯分校健康中心 | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
| 微型剪刀 | Miltex | 18-1633 | |
| 用于生物图像分析的开源平台 Fiji | 由 Eliceiri/LOCI 团队、Jug 团队和 Tomancak 实验室维护的公共项目。Fiji | https://fiji.sc/ | |
| 磷酸肌酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| PSF 生成器 (PSF_Generator.jar) | 生物医学成像组，EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
| 记录室 | Warner Instruments | RC-27N | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Microsoft Excel 电子表格 | 微软 | ||
| 体视显微镜 | Zeiss | Stemi 508 | |
| 四甲基罗丹明乙酯 | Invitrogen | T669 |
参考文献
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