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小鼠导管相关性Candida albicans感染模型

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DOI：

10.3791/65307

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2024年3月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

本文内容

摘要

我们建立了一种与C.albicans相关的导管相关性感染（CRI）小鼠模型，该模型中导管表面可形成生物膜，且C.albicans与宿主之间的相互作用与临床CRI具有良好的相关性。该模型有助于筛选针对C.albicans生物膜相关CRI的治疗方法，为临床转化奠定基础。

摘要

导管相关性感染（CRI）是一种在导管植入过程中由candida albicans引起的常见医院获得性感染。通常，生物膜会在导管外表面形成，导致播散性感染，对患者具有致命风险。目前临床尚无有效的预防和治疗管理手段。因此，迫切需要建立一种CRI动物模型，用于新预防和治疗策略的临床前筛选。在本研究中，将一种广泛使用的医用聚乙烯导管植入脱毛后的BALB/c小鼠背部。随后，在导管沿皮肤通路的表面接种表达增强型绿色荧光蛋白的Candida albicans ATCC MYA-2876（SC5314）菌株。3天后，在荧光显微镜下观察到导管表面有强烈的荧光信号。通过扫描电子显微镜观察到导管表面形成了成熟且厚实的生物膜。这些结果表明candida albicans已在导管表面发生黏附、定植并形成生物膜。皮肤标本中表皮增生及炎性细胞浸润提示CRI相关皮肤的组织病理学改变。综上所述，成功建立了小鼠CRI模型。该模型有望为candida albicans相关CRI的治疗策略研发提供有力支持。

引言

近年来，随着生物医学材料的发展和应用，与植入物相关的感染正成为棘手的临床问题1,2。随着医用导管在临床上的广泛应用，每年由此引发的相关感染和死亡病例数量巨大3,4。导管相关性感染（CRI）常见的感染途径包括：（1）皮肤表面的病原体侵入体内并黏附于导管外表面5,6,7；（2）因无菌操作不当导致的病原体侵入、黏附并在导管上定植；（3）血液循环中的病原体黏附并在导管上定植；（4）由病原微生物污染的药物引起感染。

Candida 是导致导管相关性感染（CRI）的第三大常见原因8,9。在植入物表面形成生物膜后，极易引发血流感染及其他危及生命的侵袭性念珠菌病。患者预后较差，死亡率较高2。据报道，中心静脉导管插入后2周内，导管表面即可形成生物膜，数周后导管腔内亦会出现生物膜10,11。

Candida albicans （C. albicans）在医用导管上形成的生物膜具有由酵母、基质和菌丝组成的双层网络结构12,13。C. albicans 生物膜的形成不仅对耐药性和免疫逃逸至关重要13，而且对于产生播散性孢子也极为关键，从而导致进一步的血行感染2,12，并引发更严重甚至危及生命的后果。C. albicans 相关的导管相关性感染（CRI）是临床真菌血流感染的主要原因7,14，超过40%的中心静脉导管中发生 C. albicans 感染的患者会发展为菌血症15。

根据美国感染病学会的建议，Candida 导管相关性感染（CRI）的治疗方案包括：（1）拔除感染的导管；（2）对患者进行为期14天的全身性抗真菌治疗8；（3）重新植入新的导管4。然而，在临床实践中，有时无法完全拔除导管。部分患者只能接受全身性抗生素治疗联合抗菌锁治疗，但此类治疗常伴随严重不良反应16,17。

现有的白色念珠菌（C. albicans）动物模型，例如口咽念珠菌病模型、阴道念珠菌病模型以及由念珠菌病引起的侵袭性全身感染模型18,19，均无法很好地与临床导管相关性感染（CRI）相对应。因此，本研究建立了一种与C. albicans相关的CRI小鼠模型。采用临床常用的聚乙烯导管作为皮下植入物20,21，并在皮肤表面接种C. albicans，以模拟C. albicans对医用导管的黏附及其生物膜的形成。

该模型已成功应用于本实验室，用于筛选不同治疗手段对生物膜的抑制作用22。此外，由于念珠菌（C. albicans）在导管感染后存在检测滞后的问题，我们构建了一株表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的C. albicans菌株，并将其接种于小鼠体内，以便直观观察植入导管上C. albicans的菌落和生物膜形成情况。

方案

实验动物为雄性BALB/c小鼠（12-16 g），购自西安交通大学医学部实验动物中心。所有实验程序均经西安交通大学机构动物伦理委员会批准，许可证号为SCXK（陕西）2021-103。

1. 缓冲液与仪器准备

  1. 用高表达质粒 pCaExp 转染 C. albicans 菌株。
    1. 从 ATCC 购买 C. albicans（SC5314）。通过将含有 EGFP 基因完整开放阅读框的高表达质粒 pCaExp 转染至 C. albicans 中，获得 EGFP 高表达荧光菌株22（质粒图谱见图1），并用于后续实验。
  2. 培养转染后的 C. albicans 菌株。
    1. 从酵母提取蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）平板上挑取 C. albicans 荧光菌株的单克隆菌落，接种于 5 mL YPD 液体培养基（YPD + 50 µg/mL 羧苄西林）中，30 °C、220 rpm 条件下过夜培养。
    2. 将 C. albicans 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟后，用生理盐水重悬。
    3. 通过与 0.5 麦氏标准比浊管比较，调整 C. albicans 悬液浓度至 1 × 108 个细胞/mL。
  3. 准备手术器械。
    1. 确保所有手术器械（剪刀、镊子、止血钳、持针器、缝合针）在 121°C 下高压灭菌 30 分钟。使用无菌 聚乙烯导管（内径：0.28 mm；外径：0.63 mm）。
      注：本研究所用导管经环氧乙烷气体灭菌，包装在经紫外线照射超过 30 分钟的超净工作台上打开。植入小鼠前，导管需浸入 75% 乙醇中以防止污染。

2. 小鼠CRI模型的建立

注意：手术操作如图2所示。

  1. 将30只BALB/c小鼠（雄性，12-16 g）在无特定病原体（SPF）条件下适应环境，自由饮水和进食，光照与黑暗各12小时交替循环。
  2. 将30只BALB/c小鼠随机分为三组（每组n = 10只）：（A）正常对照组；（B）导管组（植入无C. albicans的导管）；（C）模型组（植入含C. albicans的导管）。
  3. 使用1-4%异氟烷麻醉小鼠，并将小鼠俯卧位固定于手术台上。以翻正反射消失且对足趾刺激无反应确认麻醉成功。用碘伏或氯己定与酒精交替擦拭三遍，去除毛发并对手术部位进行消毒。
  4. 对正常对照组小鼠不进行任何处理，自由饮水和进食。
  5. 对导管组和模型组小鼠，维持3%异氟烷麻醉。通过足趾夹捏无反应确认麻醉深度，并根据需要调整异氟烷浓度。
  6. 对导管组小鼠，使用1 mL无菌注射器针头在背部脱毛区域皮内穿刺形成孔道，拔出针头后将一根导管（长约1 cm）插入孔道中。
  7. 对模型组小鼠，用移液器将20 µL C. albicans悬液滴加至背部脱毛区域，以模拟皮肤表面的共生C. albicans。
  8. 待溶液被皮肤吸收后，按照步骤2.5所述相同操作，在背部脱毛区域插入导管。
  9. 沿导管再滴加20 µL C. albicans悬液至组织内，以模拟外界环境中的C. albicans。
  10. 用胶带和纱布固定导管，将小鼠放回笼中饲养。处理结束后，皮下注射美洛昔康（4 mg/kg）作为镇痛剂，连续给药三天。
    注意：术后小鼠需小心喂养，保证饮水和进食。每日观察两次。若小鼠出现进食困难、显著体重减轻（10-20%）或低体温，应采用IACUC批准的方法实施安乐死。

3. CRI 模型的评估

  1. 3天后，用3%异氟烷麻醉小鼠，并通过颈椎脱位处死。收集小鼠背部的导管及皮肤组织样本。
  2. 通过扫描电子显微镜观察 C. albicans 及导管上的生物膜。
    1. 将导管浸入2.5%戊二醛溶液中，在4 °C固定48小时。用无菌PBS冲洗导管三次。
    2. 用1%锇酸固定导管3小时，并用无菌PBS冲洗三次。
    3. 用梯度乙醇溶液（浓度依次为50%、70%、80%、90%和100%，每级15分钟）对导管上的细胞进行脱水。
    4. 将导管浸入叔丁醇中三次（每次30分钟）。
    5. 将导管在液氮中迅速冷冻，并按照制造商说明在冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
    6. 通过离子束沉积法在导管样品表面喷镀10 nm厚的金层。
    7. 在扫描电子显微镜下（高真空，1.5 kV条件下）观察各组导管表面C. albicans及其生物膜的存在情况，并记录各组图像。
  3. 通过荧光显微镜观察导管上的C. albicans。
    1. 将导管浸入4%多聚甲醛溶液中，在4 °C固定48小时。
    2. 在484 nm激发光下，用荧光显微镜观察各组导管表面C. albicans及其生物膜的存在情况，并记录各组图像。
      注：放大倍数为400倍。Candida albicans在490 nm激发、510 nm发射条件下可观察到荧光。
  4. 观察小鼠皮肤中定植的C. albicans。
    1. 将小鼠背部皮肤组织浸入4%多聚甲醛溶液中，在4 °C固定48小时。
    2. 用梯度乙醇溶液（浓度依次为50%、70%、80%、90%和100%，每级15分钟）对背部皮肤组织进行脱水。
    3. 将脱水后的背部皮肤组织在55–60 °C下进行石蜡包埋。注意温度控制，避免组织变脆。为尽可能去除杂质，重复此步骤三次（每次30分钟）。
    4. 使用切片机对背部皮肤组织进行切片（厚度 = 5 µm）。
    5. 将载玻片浸入二甲苯中两次，每次20分钟，以脱去石蜡。
    6. 通过梯度乙醇（无水乙醇、90%乙醇、75%乙醇、水）逐级洗脱，每次5分钟，对切片进行复水。
    7. 将切片浸入过碘酸溶液中染色15分钟，随后用流水冲洗一次，再用蒸馏水冲洗两次。
    8. 按照制造商说明，在避光条件下用雪夫染色液（chevron staining solution）染色30分钟，然后用流水冲洗5分钟。
    9. 将切片浸入苏木精溶液中3–5分钟，随后依次用流水（2–3分钟）、分化液（5–10分钟）和流水冲洗。
    10. 将切片依次浸入乙醇三次（每次5分钟）和二甲苯两次（每次5分钟），然后用中性树胶封片。
    11. 使用显微镜观察标本图像，并分析小鼠皮肤中C. albicans的残留情况。
      注：目镜放大倍数为10倍，物镜放大倍数为4倍或10倍。
  5. 观察背部皮肤组织的组织病理学变化。
    1. 将背部皮肤组织浸入4%多聚甲醛溶液中，在4 °C固定48小时。用梯度乙醇溶液（浓度依次为50%、70%、80%、90%和100%，每级15分钟）对背部皮肤组织进行脱水。
    2. 将脱水后的背部皮肤组织按步骤3.4.3所述方法进行石蜡包埋。
    3. 使用切片机对背部皮肤组织进行切片（厚度 = 5 mm）。
    4. 将载玻片浸入二甲苯中两次，每次20分钟，以脱去石蜡。
    5. 通过梯度乙醇（无水乙醇、90%乙醇、75%乙醇、水）逐级洗脱，每次5分钟，对切片进行复水。
    6. 用苏木精染色4分钟，然后用自来水冲洗以去除浮色。
    7. 用1%盐酸-乙醇溶液对样本进行分化，随后用流水冲洗载玻片。
    8. 将样本依次浸入85%和95%乙醇中各5分钟，然后用伊红溶液染色3分钟。
    9. 将样本依次浸入梯度乙醇（70%、90%、95%和100%）和二甲苯中各2分钟，进行脱水。
    10. 用中性树脂封片。
    11. 使用显微镜观察标本图像，并分析病理变化。

结果

C. albicans 及导管上的生物膜可通过扫描电镜（SEM）观察。如图322所示，导管组聚乙烯导管表面光滑，未见黏附的致病微生物。然而，模型组聚乙烯导管表面可见成熟且致密的C. albicans生物膜，表明在实验条件下，C. albicans可在小鼠体内成功定植并在导管表面形成生物膜。此外，荧光显微镜结果进一步验证了上述结论（图4）22。导管组聚乙烯导管表面无明显荧光信号，而模型组导管表面可见黏附的C. albicans细胞发出强烈荧光，提示大量C. albicans细胞黏附于导管表面，证明了小鼠C. albicans生物膜相关导管感染（CRI）模型构建成功。

为了更直观地验证小鼠皮肤组织的感染情况，进行了雪夫过碘酸染色分析。该方法可检测真菌细胞中的碳水化合物，常用于临床研究（图5）22。正常对照组和导管组的皮肤组织对过碘酸-雪夫（PAS）染色呈阴性反应，表明组织中无C. albicans细胞存在。模型组中观察到少量PAS染色阳性的C. albicans细胞，进一步验证了成功模拟了与C. albicans相关的侵袭和黏附过程。

接下来，观察小鼠皮肤组织中由...诱导的病理学变化 C. albicans 通过组织病理学分析进行评估。如图所示 图622，模型组的表皮层显著增厚并延伸至皮肤内层。还可观察到炎症浸润，表明感染已发生 C. albicans 导致小鼠皮肤组织出现明显的病理改变。导管组中，表皮层、真皮层、皮脂腺、毛囊及其他结构清晰完整，未见水肿及炎性细胞浸润，与正常对照组相似。这些结果表明，仅插入导管并不会引起皮肤组织的明显改变。模型组组织的病理改变是由感染所致 C. albicans综上所述，实验结果验证了与CRI相关的小鼠模型成功建立 与白色念珠菌 生物膜

用于基因表达的 pCaEXP 6225bp 质粒图谱，带有 MET3 启动子和抗性基因。
图 1：pCaExp 质粒图谱。 请点击此处查看此图的放大版本。

白色念珠菌感染时间线与导管置入；扫描电镜、荧光、苏木精-伊红、过碘酸-雪夫染色分析
图2示意图显示了该操作流程的步骤 白色念珠菌-相关的CRI小鼠模型 请点击此处以查看此图的放大版本。

显微结构分析；导管与模型表面在1000倍和5000倍放大下的扫描电镜图像。
图3：各组导管表面的扫描电镜观察结果。（A）导管组；（B）模型组（1000×，比例尺 = 50 µm；5000×，比例尺 = 10 µm）。本图经Mo等22许可修改。 请点击此处查看该图的高清版本。

明场与荧光显微镜，导管组与模型组显微图像对比，100 µm 比例尺。
图4：各组导管表面荧光显微镜图像。（A）导管组；（B）模型组（比例尺 = 100 µm）。本图经 Mo 等人22许可修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠背部皮肤组织学显微镜图像，导管组、模型组与对照组在40倍和100倍下的组织学比较。
图5：各组小鼠背部皮肤的H&E染色结果。（A）导管组；（B）模型组；（C）对照组（40x，比例尺 = 400 µm；100x，比例尺 = 200 µm）。本图经Mo等22许可修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织学分析、导管、模型、对照组；40×、100×放大倍数下的显微镜比较。
图6：各组小鼠背部皮肤的PAS染色结果。（A）导管组；（B）模型组；（C）对照组（40×，比例尺 = 400 µm；100×，比例尺 = 200 µm）。模型组可见表皮层显著增厚并向皮肤内层延伸（红色矩形框）。本图经Mo等22许可修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

导管相关性感染（CRI）是临床实践中最常见的医院获得性感染之一23。皮肤附属器（如表皮、皮脂腺和毛囊）中的病原体均可能是CRI的病因23,24。Candida 是引起CRI的第三大病原体，其中Candida albicans 是导致生物膜感染最常见的类型25,26。因此，我们旨在建立一种与Candida albicans 生物膜相关的CRI动物模型，以支持相关CRI的治疗与预防研究。

为构建CRI模型，将少量C. albicans接种至小鼠背部皮肤，以模拟临床上常规消毒无法彻底清除皮肤深层组织及附属器中部分C. albicans的情况。在导管植入后，再次接种C. albicans，以模拟手术过程中外部环境中存在C. albicans的情形。

本研究选择在第3天进行模型构建，该时间点短于传统的C. albicans生物膜相关动物模型18,27，原因是生物膜形成较为困难。感染后，该模型中导管表面可见C. albicans的黏附与生物膜形成，扫描电镜（SEM）和荧光显微镜结果对此提供了证据（图3 和 图4）。这可能是由于本研究中C. albicans的浓度为1 × 108 CFU/mL，远高于其他动物模型18,27。此外，导管周围的皮肤持续与外界环境接触。为了模拟导管相关感染（CRI）可能遇到的极端环境，术后再次接种了C. albicans。

感染的复发通常是由于病原体残留在周围组织中所致23,28,29。因此，组织中病原体的存在与否对慢性皮肤真菌感染（CRI）具有重要意义。本文采用过碘酸-雪夫（PAS）染色法检测皮肤组织中白色念珠菌（C. albicans）的残留情况。该方法也可用于评估新型治疗药物或疗法对CRI的清除效果。

综上所述，本研究利用表达eGFP的Candida albicans菌株构建了小鼠导管相关性感染（CRI）模型，以直观观察Candida albicans在导管上的定植 情况。该菌株还可用于评估Candida albicans与宿主细胞之间的相互作用，例如Candida albicans对宿主的侵袭与黏附、药物抗Candida albicans的效果以及宿主免疫反应。此外，本研究采用两步接种法模拟来自外部环境和体内来源的病原体感染过程。值得注意的是，感染后未进行后续的微生物培养。生物膜的存在是导致培养法敏感性低下的重要因素30,31,32。既往研究表明，感染后的微生物培养在敏感性、特异性和准确性方面均较低30,31,32,33,34。相反，植入物表面生物膜的存在是一个更为可靠的检测指标。因此，本研究采用扫描电镜（SEM）和荧光显微镜技术对形成生物膜的Candida albicans进行可视化观察与鉴定。

然而，该模型并未模拟患者免疫力减弱与 白色念珠菌 临床观察到的感染。如果该模型能够考虑免疫抑制治疗（如持续注射糖皮质激素）35 之前 白色念珠菌 接种后，将能够更好地模拟临床情况中发生的感染。

披露

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

感谢陕西省自然科学基金（项目编号 2021SF-118）和国家自然科学基金（项目编号 81973409、82204631）对本研究的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 Mactutrius turbidibris上海路径科技有限公司5106063
2.5% 戊二醛固定液星之生物技术有限公司DF015
4 °C 冰箱伊莱克斯（中国）电器有限公司ESE6539TA
琼脂北京奥博星生物技术有限责任公司01-023
分析天平岛津ATX124
高压灭菌器三洋MLS-3750
丁醇天津科密欧化学试剂有限公司200-889-7
羧苄西林AmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon 直立光学显微镜 尼康Eclipse Ts2-FL
葡萄糖Macklin D823520
接种环赛默飞世尔科技251586
异氟烷RWD20210103
多聚甲醛碧云天生物技术P0099
PAS染色试剂盒赛维尔生物G1285
蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司01-001
聚乙烯导管闪耀塑料商城PE100
RWD R550 多通道小动物麻醉机 RWDR550
扫描电子显微镜（SEM）日立TM-1000
恒温培养箱上海智楚仪器有限公司ZQTY-50N
超纯水制水机海扶力NW20VF
超声波仪多创DS10260D
二甲苯国药集团 化学试剂有限公司10023428
酵母提取物赛默飞世尔科技 OxoidLP0021B

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