本文详细介绍了从活体大鼠脑组织中分离神经干细胞和少突胶质前体细胞的方法。该方法可在不损害动物健康状况的前提下，从同一动物多次采集这些细胞。
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本文内容
摘要
摘要
组织特异性的神经干细胞（NSCs）在哺乳动物出生后的脑中保持活性。它们位于特化的微环境中，在那里产生新的神经元和胶质细胞。其中一个微环境是脑室下区（SEZ；也称为脑室-脑室下区），位于侧脑室的外侧壁，紧邻室管膜细胞层。少突胶质前体细胞（OPCs）广泛分布于中枢神经系统中，构成一群具有增殖能力的前体细胞，能够分化为少突胶质细胞。
神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）均具有自我更新潜能以及静息/活化循环特性。由于其所在位置的特殊性，这些细胞的分离与实验研究通常在死后进行。本文中，我们详细描述 "脑部按摩法"，一种从活体动物中分离神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）等多种细胞的方法。该方法为两步法实验方案，专为啮齿类动物设计，并已在大鼠中验证。首先，细胞被 "释放" 从组织中 通过 立体定位脑室内（i.c.v.）注射 "释放剂混合物"主要成分为神经氨酸酶（neuraminidase），可靶向室管膜细胞并诱导脑室壁剥脱；整合素-β1阻断抗体；以及成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2）。在第二个时间点 "收集" 在麻醉大鼠中，通过枕大池进行脑脊液的液体活检，无需切口即可完成该步骤。
本文展示的结果表明，分离的细胞保留了其内源性特征，且脑室下区的神经干细胞保持了其静息状态。导管层的剥离仅局限于注射的解剖水平，且动物对该操作流程（释放与收集）耐受良好 。这一新方法为在实验动物中开展内源性神经发生和胶质发生纵向研究奠定了基础。
引言
组织特异性干细胞是部分定向分化的细胞，能够产生构成相应组织的所有细胞群体。除了具有多向分化潜能外，它们还具有自我更新能力，对维持组织的稳态和再生能力至关重要1。某些组织特异性干细胞处于活跃且高度增殖的状态，例如肠道干细胞或造血干细胞；而另一些，如脑内的干细胞，则大多处于静息或休眠状态2。在成年大脑中，神经干细胞（NSCs）存在于特定的微环境区域，通常称为“干细胞微环境”（niche）。其中两个被充分描述的区域位于侧脑室的室下区（SEZ）以及海马的齿状回。SEZ微环境产生的细胞数量最多，主要是神经前体细胞（神经母细胞），它们迁移至嗅球，并贡献于局部中间神经元群体；相比之下，所生成的少突胶质前体细胞则迁移至邻近的胼胝体（CC）3。少突胶质前体细胞（OPCs）是广泛分布于中枢神经系统中的有丝分裂活跃细胞，具有以下特性：i）定向于少突胶质细胞谱系；ii）可迁移至脱髓鞘病灶部位；iii）可分化为具有髓鞘形成能力的少突胶质细胞。OPCs还表现出自我更新潜能和静息特性4。
迄今为止，神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）的分离与研究均需依赖于解剖后脑和脊髓组织的死后解离。为克服这一实验局限，我们建立了一种方法，首次实现了从活体动物中分离脑内NSCs和OPCs。我们将该方法称为 "....
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方案
动物的繁殖、饲养及实验操作均依照英国《1986年动物（科学实验）法案》以及希腊共和国总统令第56/2013号的规定进行，并经剑桥大学和帕特雷大学的动物福利与伦理审查机构审查批准，同时获得当地州级动物护理与使用委员会的批准和监督（方案编号：5675/39/18-01-2021）。实验所用动物为雄性和雌性Sprague-Dawley、Wistar和Long-Evans大鼠，年龄在2至4个月之间，体重范围为150 g至250 g。该实验方案在图1中以图示形式进行了总结。
1. 裂解液的配制
注意：在操作当天新鲜配制，并置于冰上保存。每2 µL用于单侧脑室注射，按此量配制。每预定注射一次，额外准备1 µL。
- 准备 0.5 µL 来自产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）（旧称 Clostridium welchii）的 500 mU 神经氨酸酶。
注意：将该酶以 1 U/µL 的浓度溶于无菌水中，配制成储存液，于 -20 °C 保存。其他类型的神经氨酸酶尚未经过测试。 - 准备含 1 µg 整合素 β1 阻断抗体的 1 µL 溶液。
注意：于 4 °C 保存。 - 准备含 0.5 µg 碱性成纤....
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结果
神经干细胞的释放与收集
SEZ 的神经干细胞仅由单层室管膜细胞与脑脊液相隔，但仍与脑室内容物保持直接接触 通过 插入性单纤毛突起8,9. 神经氨酸酶特异性作用于室管膜细胞 通过 唾液酸残基的裂解可导致脑室壁裸露，进而引起神经母细胞在脑室表面聚集。10,11此外，在脑室内注射整合素-β1阻断抗体后，已在脑脊液中观察到神经母细胞的流动，这可能是由于室管膜细胞间的连接松解所致。12这些观察结果促使了一种分离脑内干细胞和祖细胞的方案的建立 通过 对侧脑室壁完整性的可控性破坏。第一步，诱导神经干细胞或少突胶质前体细胞从脑实质中释放，并随后流入脑脊液中 通过 脑室内注射释放鸡尾酒。该鸡尾酒以立体定位方式按一定速率注射 1 µL/min，双侧（2 µL 每侧脑.......
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讨论
干细胞与祖细胞在哺乳动物脑组织中相对稀少，且神经干细胞（NSCs）位于难以进行安全、便捷活检的区域（如脑室壁、海马体）。因此，迄今为止，实验研究这类细胞的唯一途径是通过死后组织分离。本文逐步介绍一种名为“挤取”（milking）的技术，可用于从活体大鼠中单次或重复采集神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）。该方法基于两个关键特征：i）NSCs或OPCs被室管膜细胞单层与脑室系统内的脑脊液（CSF）分隔；ii）室管膜细胞与神经前体细胞之间，以及它们与其他邻近细胞类型之间保持细胞连接。 通过 整合素。因此，注射到脑室特定区域以促使神经干细胞（NSCs）或少突胶质前体细胞（OPCs）从脑实质中分离的释放混合液中含有神经氨酸酶，一种可特异性靶向并杀死室管膜细胞的毒素。10,11，以及整合素-β1阻断抗体。此外还含有FGF2，因为该生长因子对于神经干细胞在微环境及体外培养中的存活与维持至关重要15,
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
本工作获得了 Action Medical Research（英国）基金（项目编号：GN2291）对 R.J.M.F. 和 I.K. 的资助。该项研究还部分得到了希腊研究与创新基金会（H.F.R.I.）的资助（用于动物费用及对 D.D. 的支持），资助项目为 "支持高校教职员工与研究人员及采购高成本科研设备的 H.F.R.I. 首轮研究项目资助计划"（项目编号：3395）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 释放混合液 | |||
| β1-整合素阻断抗体 | BD Biosciences | #555002 | 纯化NA/LE仓鼠抗大鼠CD29克隆Ha2/5，1 mg/mL。任何具有阻断活性的抗体均可适用。 |
| 来自Clostridium perfringens（Clostridium welchii）的神经氨酸酶 | Sigma-Aldrich | #N2876 | 其他来源（例如霍乱弧菌）的神经氨酸酶尚未经过测试。 |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（154个氨基酸） | Peprotech | #100-18B | 以1 μg/μL储存液形式保存，溶于无菌水，-20 °C保存 |
| 手术操作 | |||
| 10 µL注射器 | Hamilton | #80330 | 型号701 RN，可拆卸小针头，26s规格，2英寸，2型针尖 |
| BD Micro-fine 1 mL胰岛素注射器 | BD biosciences | 04085-00 | 29 G × 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL（布托啡诺0.3 mg/mL） |
| 数字标准型大鼠和小鼠立体定位仪 | Stoelting | 51500D | |
| 恒温监测系统 | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g 吸入用蒸气，液体 | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | 氯胺酮100 mg/mL |
| 尼龙缝合线，Ethilon | Ethicon | D9635 | 透明，5-0规格 |
| 可充电无线外科修剪器 | Stoelting | Item:51472 | |
| 手术刀片，无菌 | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8英寸棉签 | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| 立体定位高速钻 | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s立体定位仪套件 | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | 赛拉嗪，25 mL |
| 组织与细胞处理及免疫染色 | |||
| 适用于显微镜观察的96孔板 | Greiner | #655866 | Screen star微孔板 |
| B27添加剂 | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Merck | P06-1391100 | 第五组分，热激处理 |
| 柠檬酸盐 | Merck | 71497 | 一水合柠檬酸钠 |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | 细胞核染色，稀释比例：1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | 高糖，含丙酮酸钠 |
| 驴抗山羊 | Biotium | 20016 或 20106 或 20048 | 稀释比例：1/1,000 |
| 驴抗小鼠 | Biotium | 20014 或 20105 或 20046 | 稀释比例：1/1,000 |
| 驴抗兔 | Biotium | 20015 或 20098 或 20047 | 稀释比例：1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2（或bFGF） | Peprotech | 100-18B | |
| 山羊抗GFAP | Abcam | ab53554 | 稀释比例：1/500 |
| 山羊抗SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | 稀释比例：1/200 |
| 小鼠抗ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | 稀释比例：1/200 |
| 小鼠抗S100β | Sigma | S2532 | 稀释比例：1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | 封片剂 |
| N2添加剂 | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| 多聚甲醛 | Merck | 158127 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Merck, Millipore | A-003-E | 溶液，1.0 mg/mL |
| 兔抗双皮质素（DCX） | Abcam | ab18723 | 稀释比例：1/500 |
| 兔抗PDGFRα | Abcam | ab51875 | 稀释比例：1/200 |
| 兔抗β-连环蛋白 | Abcam | ab16051 | 稀释比例：1/500 |
| 吐温X-100 | Merck | X100 | |
| 显微镜观察与图像分析 | |||
| 共聚焦显微镜 | Leica | SP6 和 SP8 | |
| 图像分析 | NIH, USA | ImageJ | |
| 图像分析 | Leica | LasX |
参考文献
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal....
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重印与许可
