从活大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞的"脑挤奶"方法

摘要

本文详细介绍了从活大鼠大脑中分离神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞的方法。它允许从同一只动物身上多次收集这些细胞，而不会影响它们的健康。

摘要

组织特异性神经干细胞 （NSC） 在哺乳动物出生后大脑中保持活跃。它们居住在专门的生态位中，在那里它们产生新的神经元和神经胶质细胞。其中一个生态位是室管膜下区（SEZ;也称为室室-脑室下区），它位于侧脑室的侧壁上，与室管膜细胞层相邻。少突胶质细胞祖细胞 （OPC） 大量分布在整个中枢神经系统中，构成可产生少突胶质细胞的增殖祖细胞库。

NSC 和 OPC 都表现出自我更新潜力和静止/激活周期。由于它们的位置，这些细胞的分离和实验研究是在死后进行的。在这里，我们详细描述了"脑挤奶"，这是一种从活体动物中分离 NSC 和 OPC 以及其他细胞的方法。这是一个设计用于啮齿动物并在大鼠中测试的两步方案。首先， 通过 立体定位脑室内 （i.c.v.） 注射"释放鸡尾酒"，将细胞从组织中"释放"。主要成分是神经氨酸酶，其靶向室管膜细胞并诱导室壁剥落、整合素-β1 阻断抗体和成纤维细胞生长因子-2。在第二个"收集"步骤中，从麻醉的大鼠池中进行脑脊液的液体活检，而无需切口。

这里给出的结果表明，分离的细胞保留了其内源性特征，而经济特区的NSC保持了它们的静止状态。室管膜层的剥蚀仅限于注射的解剖水平，并且动物可以很好地耐受该方案（释放和收集）。这种新方法为在实验动物中进行内源性神经发生和胶质生成的纵向研究铺平了道路。

引言

组织特异性干细胞是部分承诺的细胞，可以产生构成各自组织的所有细胞群。除了多能外，它们还是自我更新的细胞，对于维持组织的稳态和再生能力至关重要¹.一些组织特异性干细胞保持活跃、强烈增殖状态，例如肠道或造血干细胞。其他细胞，如脑干细胞，在很大程度上保持静止或休眠状态².在成人大脑中，神经干细胞 （NSC） 可以在特定区域找到，通常称为生态位。在侧脑室的室管膜下区 （SEZ） 和海马的齿状回中存在两个这样的描述良好的区域。经济特区生态位产生的细胞数量最多，主要是向嗅球迁移并有助于局部中间神经元群的神经母细胞;相反，产生的少突胶质细胞迁移到相邻的胼胝体 （CC）³。少突胶质细胞祖细胞 （OPC） 是有丝分裂活性细胞，广泛分布在整个中枢神经系统中，它们:i） 致力于少突胶质细胞谱系，ii） 可以迁移到脱髓鞘位点，以及 iii） 可以分化成髓鞘少突胶质细胞。OPC 还表现出自我更新潜力和静止状态⁴。

到目前为止，NSC和OPC的分离和研究需要对解剖的大脑和脊髓组织进行死后解离。为了规避这一实验限制，我们建立了一种方法，首次允许从活体动物中分离大脑NSC和OPC。我们称这种方法为"挤奶"，因为它可以收集多个细胞，因为它们的池不会耗尽。该协议是在大鼠中开发的，因为它们的大脑体积很大，主要针对经济特区或CC，包括两个主要步骤。首先， 通过 静脉注射含有神经氨酸酶（一种诱导脑室壁剥落的毒素、一种整合素-β1 阻断抗体和成纤维细胞生长因子 2 （FGF2）的"释放鸡尾酒"，将 NSC 或 OPC 从组织中"去除"。鸡尾酒在侧脑室内双侧立体注射。如果预期用途是分离 NSC，则以侧脑室的喙部区域为目标。如果目的是更纯净地分离OPC，则将混合物从尾部注射到海马菌毛区域。在第二个"收集"步骤中，从麻醉大鼠的脑池中进行脑脊液（CSF）的液体活检，而无需切口。将液体活检与NSC培养基混合，并可保持在4°C直至接种。

方案

动物育种、维护和实验程序是根据内政部授权的《1986年英国动物（科学程序）法》和希腊共和国第56/2013号总统令进行的，由剑桥大学和帕特雷大学的动物福利和伦理审查机构审查，并由当地县动物护理和使用委员会批准和审查（协议编号: 5675/39/18-01-2021）。 使用雄性和雌性 Sprague-Dawley、Wistar 和 Long-Evans 大鼠，年龄在 2 至 4 个月之间，体重在 150 g 至 250 g 之间。该协议以图形方式总结在 图1中。

1. 释放鸡尾酒准备

注意:手术当天新鲜准备并放在冰上。每 2 μL 给予量以静脉注射到每个侧脑室中。每次预期进样再准备 1 μL。

1. 从 产气荚膜梭菌 （Clostridium welchii）中制备0.5μL的500mU神经氨酸酶。
   注意:将其储存为1U / μL原液，在-20°C的无菌水中稀释。 其他类型的神经氨酸酶尚未经过测试。
2. 制备含有 1 μg 整合素-β1 阻断抗体的 1 μL。
   注意:将其储存在4°C。
3. 制备含有0.5μg碱性成纤维细胞生长因子（重组人FGF-碱性）的0.5μL。
   注意:将其储存为1μg/ μL原液，在-20°C的无菌水中稀释。

2.注射释放鸡尾酒

注意:整个过程可以在 20 分钟内完成。注意在无菌条件下进行手术。用消毒剂（例如 3% 或 6% 过氧化氢）清洁所有表面。使用高压灭菌或易于消毒的工具、手套、防护服和窗帘。

1. 通过吸入异氟烷麻醉实验动物（诱导为2.5%，维持为2%）。通过检查角膜反射、对刺激的反应（后肢和尾巴捏合试验）和呼吸方式来确认麻醉深度。
   注意:外科手术可以在腹膜内注射麻醉诱导的全身麻醉下进行（例如，氯胺酮 [40 mg/kg] 和甲苯噻嗪 [10 mg/kg]）。通过检查角膜反射、对刺激的反应（后肢和尾巴捏合试验）和呼吸方式来确认深度麻醉。
2. 麻醉诱导后皮下注射镇痛药（例如，0.3 mg/mL 丁丙诺啡）。
3. 将大鼠安装在立体定位框架上。
4. 用剃须刀剃掉头部的皮毛，并用防腐剂清洁皮肤，例如10%聚维酮碘溶液，然后用酒精清洁皮肤。使用无菌棉签涂抹消毒剂三次。每次以圆周运动揉搓 3-5 秒。涂抹眼药膏以防止干燥。
5. 使用无菌手术刀沿中线在头部皮肤上做一个 2 厘米的切口。
6. 使用无菌拭子和无菌盐水仔细清除颅骨。
7. 使用安装在立体定位装置上的 10 μL Hamilton 注射器的针头边缘识别前囟。将 bregma 设置为"点 0,0"。
   注意:前囟被确定为矢状缝和冠状缝之间的交点。更多细节可以在Paxinos和Watson⁵的大鼠大脑图谱中找到。
8. 将设备移动到坐标前后 （AP） = 0.3 mm，横向 （L） = +1.2 mm（以瞄准经济特区），或 AP = 1.5 mm，L = +2.0 mm（以瞄准 CC）。
9. 用牙钻钻一个 1 毫米的毛刺孔。
   注意: 用手钻孔时，注意不要伤害皮质表面。预计出血量不会很大。用生理盐水清除所有血液，并施加压力以阻止更持久的出血。
10. 在 10 μL Hamilton 注射器中加载 4 μL 释放混合物。
11. 降低汉密尔顿注射器的针头（最好是钝的或锥形边缘），以便与硬脑膜接触。
12. 将针插入所需深度 （D = 3.5 mm）。
    注意:将生理盐水倒在硬脑膜表面以保持组织水分。
13. 以 1 μL/min 的速率注入 2 μL 释放混合物。
14. 在缓慢取出之前，将针头再留在原位 2 分钟，以避免释放混合物浮出水面。
15. 在坐标 AP = 0.3 mm、L = -1.2 mm（以经济特区为目标）或 AP = 1.5 mm、L = -2.0 mm（以 CC 为目标）处对另一个半球重复步骤 2.8-2.14。
16. 用 5-0 尼龙（直径 0.1 毫米）缝合切口，并用防腐剂清洁缝合区域。
17. 取下供应麻醉剂的面罩，并将动物转移到术后监测区域。
    注意:麻醉恢复和卧位维持应在 5-10 分钟内进行，并在 25 分钟内完全恢复（正常行为）。
    1. 密切监测恢复情况（生动和不间断的运动，经常接触水），在加热良好（24-25°C）的安静空间中，没有小颗粒床上用品，这可能会阻塞气道。只有在确认完全康复后，才能将动物放回笼友的陪伴下（而不是新动物）。
    2. 手术后在维持设施中监测动物至少48小时。通过给予镇痛剂（例如，皮下注射 0.3 mg/mL 丁丙诺啡）来解决疼痛体征（隐藏头部、头部或身体姿势异常、超敏反应和对处理过度兴奋）。将皮毛变色或竖立的动物转介给负责的兽医。

3. 脑脊液（CSF）液体活检

注意:整个过程可以在 10 分钟内完成。这里描述的液体活检在注射释放鸡尾酒后 3 天进行，但可以在需要时以完全相同的方式进行。注意在无菌条件下进行手术。用消毒剂（例如，3% 或 6% 过氧化氢）清洁所有表面。使用高压灭菌或易于消毒的工具、手套、防护服和窗帘。

1. 通过吸入异氟烷麻醉动物（2.5%用于诱导，2%用于维持）。通过检查角膜来确认麻醉深度
   反射、对刺激的反应（后肢和尾巴捏合试验）和呼吸方式。
   注意:外科手术可以在腹膜内注射麻醉（例如氯胺酮 [40 mg/kg] 和甲苯噻嗪 [10 mg/kg]）诱导的全身麻醉下进行。然而，这是不可取的，因为手术时间很短，特别是如果活检将在连续几天进行多次。
2. 麻醉诱导后皮下注射镇痛药（例如，0.3 mg/mL 丁丙诺啡）。
3. 将实验动物安装在立体定位框架上。使用耳杆固定头部，而不会阻碍向前和向后的旋转运动。
4. 将头部稳定在向下的 40° 角，以便颈部后部的良好伸展。
   注意: 一种方法是使用设备⁶ 的口杆。
5. 用剃须刀剃掉颈部的毛发，并用防腐剂清洁皮肤，例如 10% 聚维酮碘溶液，然后使用酒精。使用无菌棉签涂抹消毒剂三次。每次以圆周运动揉搓 3-5 秒。
6. 用指尖找到位于枕骨突起和脊柱之间的菱形可抑郁区域⁶.
7. 画一个点标记（例如，使用记号笔）。
8. 将 1 mL 或 0.5 mL 注射器固定在立体定位框架上。
   注意:建议使用带有不可拆卸针头的注射器，因为它们会产生更好的吸力和更少的死体积。
9. 将针头放在与皮肤接触点的点标记处。
10. 用一把镊子抬起皮肤，同时将注射器穿过皮肤层。
11. 稍微取回柱塞以在注射器中产生负压。
12. 重新启动以非常缓慢地浸入针头，直到注射器中出现液体 （CSF）。
13. 将针头固定在这个位置，让脑脊液缓慢流动。
    注意:如果脑脊液流速非常慢，针头可以稍微降低或升高。
14. 开始缓慢（以 40 μL/min 的步长）去除 CSF，直至 120 μL。
15. 慢慢取回注射器。
16. 腹膜内施用 1 mL 正常血清以支持实验动物补充液体。
17. 将液体活检（CSF）与400μLNSC培养基混合，并将微量离心管保持在4°C直至进一步使用。
    注意:如果不冷冻，液体活检应在 3 小时内处理。
18. 取下提供麻醉剂的面罩，将动物转移到术后监测区域。
    注意:麻醉恢复和卧位维持应在 5-10 分钟内进行，并在 25 分钟内完全恢复（正常行为）。
    1. 密切监测恢复情况（生动和不间断的运动，经常接触水），在加热良好（24-25°C）的安静空间中，没有小颗粒床上用品，这可能会阻塞气道。只有在确认完全康复后，才能将动物送回笼友（而不是新动物）的陪伴下。
    2. 手术后在维持设施中监测动物至少48小时。如果观察到疼痛体征（头部隐藏、头部或身体姿势异常、过敏反应和对处理过度兴奋），给予镇痛（例如，皮下注射 0.3 mg/mL 丁丙诺啡）。将皮毛变色或竖立的动物转介给负责的兽医。

4. 用于免疫荧光的组织处理

1. 通过心内输注 20 mL 冰冷盐水，然后输注 50 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA;在 pH = 7.4 的磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 中）对动物实施安乐死。
2. 解剖脑组织。
   1. 用剪刀将头部与身体分开，在宫颈区域切开。用剪刀去除皮肤，然后沿着矢状中线剪下颅骨，剪刀的尖端朝上，以免损坏脑组织。目标是尽可能多地继续切割，通过日冕中线。
   2. 使用镊子取出骨头，从枕上骨和顶骨开始，最后取出额骨。
   3. 一旦脑组织显露出来，用镊子或刮刀将其从颅骨中取出。为了促进这一点，如果不需要，请切断大脑底部的神经和嗅球。
3. 将组织在4°C下在2%PFA中固定过夜。
4. 在4°C下在30%蔗糖（PBS中）中冷冻保护组织至少48小时，直到组织沉入底部。
5. 将组织冷冻在-80°C。
6. 用低温恒温器将脑组织切成 14 μm 厚的冠状切片。
7. 使用标准方案进行免疫荧光染色 ^3,7
   1. 在室温下用封闭缓冲液（3%牛血清白蛋白[BSA]，0.1%Triton X-100，在PBS中）孵育切片2小时。
   2. 进行抗原修复（在10mM柠檬酸盐缓冲液中煮沸15分钟，pH = 6.0，使用玻璃罐）。
      注意:此步骤是可选的，但对于核抗原是必需的。
   3. 置于室温下，与抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP），双皮质素（Dcx），S100β和β-连环蛋白的一抗（参见 材料表）在封闭缓冲液中在4°C下孵育过夜。
   4. 在PBS中与具有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的二抗一起孵育2小时，用于室温下的核复染（参见 材料表）。
   5. 安装盖玻片。

5. 处理分离的细胞进行免疫荧光

1. 将细胞铺接到与显微镜兼容的 96 孔板中，涂有聚-D-赖氨酸 （100 μg/mL）。
2. 将细胞固定在冰冷的 2% PFA 中 10 分钟，并用 PBS 洗涤 3 次。
3. 使用标准程序 ^3,7 对 PDGFRα、GFAP、Dcx、SOX2 和 ID3 进行免疫荧光（参见材料表）。
4. 将细胞在4°C下保持在4°C的PBS + NaN₃ （0.1%）中。

6. 显微镜和图像分析

1. 使用落射荧光或共聚焦显微镜拍摄图像，并使用标准图像分析软件工具（如细胞计数仪）进行细胞计数。

结果

NSC的发布和收集
经济特区的 NSC 仅通过室管膜细胞的单层与脑脊液分离，尽管它们通过插入的单纤毛突与心室内容物保持直接接触 ^8,9。神经氨酸酶通过裂解唾液酸残基特异性作用于室管膜细胞，并可诱导心室壁脱落。这导致神经母细胞聚集在心室^{表面 10,11}。此外，在静脉注射整合素-β1 阻断抗体后，在脑脊液中观察到神经母细胞流动，这可能是由于室管膜间细胞连接松动¹²。这些观察结果导致了一种协议的发展，该协议能够通过控制侧脑室壁的完整性来分离大脑的干细胞和祖细胞。在第一步中，通过注射释放混合物来诱导从薄壁组织的释放以及随后在脑脊液内流动的 NSC 或 OPC。以1μL / min的速率立体定向注射，双侧（每次注射2μL）在侧脑室（针对SEZ NSC的坐标:AP = 0.3 mm，L = ± 1.2 mm，D = 3.5 mm;靶向CC OPC的坐标:AP = 1.5 mm，L = ± 2 mm，D = 3.5 mm）。第二步（"收集"）涉及从大池进行脑脊液活检。大鼠需要麻醉，活检可以用1mL注射器进行。使用立体定位装置几乎可以完全成功取出约 100 μL 的 CSF，而无需切口。将液体活检加入冰镇培养基中，并保持在4°C直至接种<3小时（NSC培养基含有Dulbecco改良的Eagle培养基[DMEM]，B27补充剂[2%]，N2补充剂[1%]，FGF2 [20ng / mL]和表皮生长因子[EGF;20ng / mL]）。

注射释放鸡尾酒后脑室周围区域的组织学评估
第一组实验显示，当注射超过 3 μL 的液体时，心室可能因非特异性机械损伤而受损（图 2B，C）。缓慢注射 2 μL 释放混合物导致心室表面出现 Dcx 免疫阳性神经母细胞簇。即使在注射后8个月，这些簇仍然可见（图2D）。由于该方法旨在进行纵向研究，旨在对动物进行长期随访，因此评估了释放混合物引起的组织损伤。对 14 μm 厚的冷冻恒温器脑切片进行室管膜细胞标志物（如 S100β 和 β-catenin¹³）的免疫染色，并评估室管膜层的整体完整性。室管膜层的剥蚀部位仅存在于注射的尾部水平附近，在经济特区的后部和更前部区域检测到室管膜层扰动逐渐减少（图2E，F），并且在距离注射部位±2毫米后消失。上述结果表明，静脉注射释放混合物引起的室管膜层的部分剥蚀是局灶性的，在注射部位附近受到限制，并使室室管膜周围层的其余部分完好无损。

采集细胞的标记物谱和 体外 行为
随后，评估通过挤奶方案分离的细胞的体外行为和标志物谱。每次液体活检的平均细胞产量约为 300 ± 45 个细胞（每次活检 100 μL）⁷。挤奶活检产生的 NSC 培养物平均为 3.17 ± 0.45 个传代电位。从注射盐水的大鼠中分离的细胞平均可以传代1.92±0.76次;相比之下，通过挤奶分离的那些甚至达到了九次传代（p = 0.038，t 检验）（图 3A）⁷。 标准死后、经济特区衍生的神经球培养物的平均传代能力高于我们手中的 12 次传代。由于 SEZ NSC 的体内扩增潜力，如体内细胞命运定位实验 ¹⁴ 所揭示的那样，已被证明是有限的，因此挤奶产生的细胞在体外行为与标准培养物中的细胞行为显着不同，尽管更接近内源性 NSC 的行为。 将收集的细胞接种在聚-D-赖氨酸包被的孔上， 它们既作为贴壁单层生长，又很少作为神经球生长（图3B）。对星形胶质细胞标志物GFAP免疫阳性的新鲜分离细胞（注射后3天收集，铺板后24小时固定）也对静止标志物ID3免疫阳性，并具有NSC双极形态学的特征（图3C）。此外，如前所述⁷，在注射后 3 天对来自同一动物的活检来源细胞和死后来源细胞进行了更详细的免疫细胞化学比较（寻找 GFAP+ 星形胶质细胞、Dcx+ 神经母细胞、PDGFRa+ 少突胶质细胞祖细胞和神经谱系的 SOX2+ 细胞）表明，收集的细胞的特征与内源性 SEZ 细胞的特征相似（图 3D）).值得注意的是，当在不同条件下比较活检和组织来源的细胞时（例如，注射有和没有FGF2的释放混合物），发现生长因子导致SOX2+细胞的存在同时显着增加，以及两个样品中Dcx +神经母细胞的存在显着减少（图3D).这些数据证实，内源性 NSC 群体谱中出现的任何变化都会反映在挤奶产生的细胞样本中。

图 1:挤奶的图形摘要。 一个脑半球的冠状切片，具有主要的解剖标志（侧脑室、上覆的胼胝体和下方的前连合 [灰色白质束]和侧壁的室管膜下区 [蓝色]）。释放混合物被注射到侧脑室中，导致组织的完整性受损，并释放出生后脑脊液中的脑神经干细胞，它们 可以通过液体活 检从中收集。缩写:SEZ = 室管膜下区;LV = 侧脑室;CSF = 脑脊液;pbNSCs = 出生后脑神经干细胞;β1-int = β1 整合素。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2:静脉注射效果的组织学评估。 （A-D） Dcx 免疫染色后侧脑室背侧半部的低倍率图像（红色，用于标记神经母细胞）。（A） 简单的静脉注射汉密尔顿注射器不会干扰经济特区的细胞结构，而静脉注射 10 mL（输注速率为 1 mL/min）会导致脑室壁的严重损伤，无论其内容如何。（B）生理盐水和（C）释放鸡尾酒。（D） 注射 2 μL 释放鸡尾酒会导致心室壁的受控损害，即使在手术后 8 个月也能观察到。注射后 7 天和 14 天经济特区壁的高放大倍率细节分别显示在 （E） 和 （F） 中。有一个杂乱无章的结构，Dcx+神经母细胞（绿色）位于壁的表面，而生态位的其他细胞（Sox2+，白色）则位于更深的地方。在2个月的时间点（以G为单位），脑室周围组织在注射的尾部水平受损，而在同一只动物中，组织在更尾部的水平（H）处完好无损。通过室管膜标志物 S100β 和 β-连环蛋白的免疫染色来评估心室壁。墙体典型结构的细节如（I）所示。使用DAPI（以蓝色显示）进行核染色。比例尺 = 300 μm（A-C、G、H、嵌件）、150 μm （D）、30 μm （E、F） 和 50 μm （I）。该图修改自 McClenahan 等人 ¹³。缩写:SEZ = 室管膜下区;i.c.v = 脑室内;Dcx = 双皮质素;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 通过 挤奶分离的细胞的评估 。 （A） 显示从盐水注射动物（灰色条，共 12 个样品）或挤奶后（黑条，共 29 个样品，释放含有神经氨酸酶和整合素-β1 阻断抗体）的液体活检样品获得的最大传代次数的图表。（B） 注射后 3 天 通过挤奶 获得的原代细胞的代表性共聚焦显微镜图像，对 GFAP 和 ID3 进行免疫染色。（三、四）注射后 3 天分离的细胞的明场图像，接种在聚 D-赖氨酸包被的孔上，并在 NSC 增殖培养基中生长 7 天。（E） 图表显示了 通过 挤奶分离的细胞的细胞谱 经济特区 SEZ 和来自同一实验动物的内源性经济特区 NSC 群体。FGF2共注射后，SOX2+和Dcx+组分分别显著增加和减少。（每个标记物的单因素方差分析，然后进行事后分析;n = 每个实验组 4-6 只动物。比例尺 = 100 μm （C，D） 和 10 μm （B）。该图修改自 McClenahan 等人 ¹³。缩写:SEZ = 室管膜下区;DPI = 注射后天数;NSC = 神经干细胞;Dcx = 双皮质素;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

干细胞和祖细胞在哺乳动物脑组织中相对稀疏。此外，NSC 位于难以进入且易于安全活检的区域（心室壁、海马体）。因此，到目前为止，对这种细胞进行实验的唯一方法是它们的死后分离。这里逐步描述了一种允许从活大鼠中单次或重复收集NSC和OPC的方法，称为挤奶。该方法基于两个关键特征:i） NSC 或 OPC 由室管膜细胞单层与脑脊液分离，在脑室系统内流动;ii） 室管膜细胞和神经祖细胞通过整合素保持它们之间以及与其他邻近细胞类型之间的联系。因此，注射到脑室特定区域以使 NSC 或 OPC 脱离脑实质的释放混合物含有神经氨酸酶、一种特异性靶向和杀死室管膜细胞的毒素^10,11，以及整合素-^β1 阻断抗体。它还含有FGF2，因为这种生长因子对于NSC在生态位和培养物中的生存和维持至关重要^15,16。先前已经表明⁷ 该方案对动物的耐受性良好;在这份报告中，进一步证实，作为脑脊液中 NSC/OPC 释放的先决条件，释放混合物诱导的对室管膜细胞的损伤仅限于注射的尾部水平。这一点至关重要，因为该协议应保留大脑的稳态功能，包括干细胞生态位本身，并且不应损害动物的长期福祉。释放鸡尾酒的立体定向注射严重程度较轻，从未导致死亡。此外，从蓄水池进行液体活检是一种快速且微创的手术，可以连续重复几次。

重要的是，通过挤奶分离的 NSC 样品密切反映了 NSC 的内源性库。经济特区祖细胞的特征可能受到 FGF2 的 i.c.v. 注射的影响。当这种情况发生时，挤奶细胞的特征也会以同样的方式受到影响。此外，先前的实验工作表明，通过经济特区挤奶分离的 NSC 具有有限的自我更新潜力，其行为类似于体内、转基因、细胞命运策略所揭示的内源性 NSC^14,17。出生后脑 NSC 保留在静止状态，很少过渡到有丝分裂激活以产生神经源性和胶质生成后代^18,19,20。在这里，提供了证据表明，表达 GFAP 并有望包括真正的 NSC 的挤奶衍生细胞部分共表达 ID3，这是静止 NSC^{的标志物 21}。静态 NSC 的富集存在，然后将其接种在通常用于培养死后分离的 NSC 培养基中，似乎限制了收集的 NSC 的扩增潜力（例如，如果细胞用于自体移植，这一过程至关重要）。这是因为这些培养基是专门为活化 NSC 的存活和有丝分裂扩增而设计的;因此，能够高效、快速地激活静止 NSC 的方案将增加挤奶的价值和使用范围。

总体而言，这些数据表明，挤奶能够从活大鼠中取样出生后脑NSC和OPC（取决于注射释放鸡尾酒的尾部水平）。这项工作表明了在同一只动物中进行连续液体活检的可行性，即使在注射释放混合物后的相当长的时间长度（因此，计划和进行纵向实验研究），因为神经母细胞即使在注射后 8 个月仍然聚集在心室壁上。这些方法至关重要，因为它们可以研究个体动物体内的事件，从而减少生理变化产生的生物噪音。这反过来又提高了准确性，并实施了"3R"（替换、减少和改进）的原则。未来改进该方法的关键步骤将是确定在一次释放程序后可以进行液体活检的最大数量和时间范围，尽管在必要时执行额外的释放程序应该是可行的。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
释放鸡尾酒
β1-整合素阻断抗体	BD Biosciences	#555002	纯化的 NA/LE 仓鼠抗大鼠 CD29 克隆 Ha2/5,1 mg/mL。任何具有阻断活性的 abntibody 都应该是合适的。
来自 产气荚膜梭菌 （ Clostridium welchii）	Sigma-Aldrich	#N2876	来源（例如，来自霍乱弧菌）的神经氨酸酶尚未经过测试。
重组人 FGF 碱性 （154 a.a.）	Peprotech	#100-18B	保持为 1 μg/μL 储备液，用无菌水稀释 -20 °C;C
外科手术
10 µL 注射器	Hamilton	#80330	型号 701 RN，小可拆卸针头，26s 规格，2 英寸，点式 2
BD 微细 1 mL 胰岛素注射器	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE 切割。SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU：
5201048131168 Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL（丁丙诺啡 0.3 mg/mL）
数字新标准立体定位、大鼠和小鼠	呕吐	51500D
恒温监测系统	哈佛仪器	55-7020
异氟林 1,000 mg/g 吸入蒸气，液体	Vetpharma动物健康	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU：	氯胺酮100毫克/毫升
尼龙缝合线，Ethilon	Ethicon	D9635	透明，尺寸5-0
可充电无线手术修剪器	滑行	项目：51472
手术刀刀片，无菌	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr. 8 英寸拭子	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
立体高速钻	Foredom	1474w/o1464
Stoelting's 立体定位器械套件	Stoelting	项目： 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	甲苯噻嗪，25 mL
组织和细胞处理和免疫染色
96孔板 适用于显微镜	Greiner	#655866	Screen star 微孔板
B27 补充剂	ThermoFisher Scientific	A1486701
牛血清白蛋白 （BSA）	Merck	P06-1391100	馏分 V，热休克
柠檬酸盐	Merck	71497	柠檬酸二氢钠
低温恒温器	Leica	CM1510S
	DAPI Merck，Calbiochem	28718-90-3	细胞核染色，稀释度：1/1,000
DMEM	ThermoFisher科学	11995065	高葡萄糖、丙酮酸
驴抗山羊	Biotium	20016 或 20106 或 20048	稀释度：1/1,000
驴抗小鼠	Biotium	20014 或 20105 或 20046	稀释度：1/1,000
驴抗兔	Biotium	20015 或 20098 或 20047	稀释度：1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2（或 bFGF）	Peprotech	100-18B
山羊抗 GFAP	Abcam	ab53554	稀释度：1/500
山羊抗 SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	稀释度：1/200
小鼠抗 ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	稀释度：1/200
小鼠抗 S100&β;	Sigma	S2532	稀释度：1/200
Mowiol	Merck，Calbiochem	475904	封固剂
N2 补充剂	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck，Millipore	A-003-E	溶液，1.0 mg/mL
兔抗双皮质素 （DCX）	Abcam	ab18723	稀释度：1/500
兔抗 PDGFR&α;	Abcam	ab51875	稀释度：1/200
兔抗 β;- 连环蛋白	Abcam	ab16051	稀释度：1/500
Triton X-100	Merck	X100
显微镜和图像分析
共聚焦显微镜	Leica	SP6 和 SP8
图像分析	美国 NIH	ImageJ
图像分析	Leica	LasX