本文详细介绍了从活体大鼠脑组织中分离神经干细胞和少突胶质前体细胞的方法。该方法可在不损害动物健康状况的前提下，从同一动物多次采集这些细胞。
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摘要
摘要
组织特异性的神经干细胞（NSCs）在哺乳动物出生后的脑中保持活性。它们位于特化的微环境中，在那里产生新的神经元和胶质细胞。其中一个微环境是脑室下区（SEZ；也称为脑室-脑室下区），位于侧脑室的外侧壁，紧邻室管膜细胞层。少突胶质前体细胞（OPCs）广泛分布于中枢神经系统中，构成一群具有增殖能力的前体细胞，能够分化为少突胶质细胞。
神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）均具有自我更新潜能以及静息/活化循环特性。由于其所在位置的特殊性，这些细胞的分离与实验研究通常在死后进行。本文中，我们详细描述 "脑部按摩法"，一种从活体动物中分离神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）等多种细胞的方法。该方法为两步法实验方案，专为啮齿类动物设计，并已在大鼠中验证。首先，细胞被 "释放" 从组织中 通过 立体定位脑室内（i.c.v.）注射 "释放剂混合物"主要成分为神经氨酸酶（neuraminidase），可靶向室管膜细胞并诱导脑室壁剥脱；整合素-β1阻断抗体；以及成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2）。在第二个时间点 "收集" 在麻醉大鼠中，通过枕大池进行脑脊液的液体活检，无需切口即可完成该步骤。
本文展示的结果表明，分离的细胞保留了其内源性特征，且脑室下区的神经干细胞保持了其静息状态。导管层的剥离仅局限于注射的解剖水平，且动物对该操作流程（释放与收集）耐受良好 。这一新方法为在实验动物中开展内源性神经发生和胶质发生纵向研究奠定了基础。
引言
组织特异性干细胞是部分定向分化的细胞，能够产生构成相应组织的所有细胞群体。除了具有多向分化潜能外，它们还具有自我更新能力，对维持组织的稳态和再生能力至关重要1。某些组织特异性干细胞处于活跃且高度增殖的状态，例如肠道干细胞或造血干细胞；而另一些，如脑内的干细胞，则大多处于静息或休眠状态2。在成年大脑中，神经干细胞（NSCs）存在于特定的微环境区域，通常称为“干细胞微环境”（niche）。其中两个被充分描述的区域位于侧脑室的室下区（SEZ）以及海马的齿状回。SEZ微环境产生的细胞数量最多，主要是神经前体细胞（神经母细胞），它们迁移至嗅球，并贡献于局部中间神经元群体；相比之下，所生成的少突胶质前体细胞则迁移至邻近的胼胝体（CC）3。少突胶质前体细胞（OPCs）是广泛分布于中枢神经系统中的有丝分裂活跃细胞，具有以下特性：i）定向于少突胶质细胞谱系；ii）可迁移至脱髓鞘病灶部位；iii）可分化为具有髓鞘形成能力的少突胶质细胞。OPCs还表现出自我更新潜能和静息特性4。
迄今为止，神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）的分离与研究均需依赖于解剖后脑和脊髓组织的死后解离。为克服这一实验局限，我们建立了一种方法，首次实现了从活体动物中分离脑内NSCs和OPCs。我们将该方法称为 "挤奶"，因为它能够在细胞池不被耗尽的情况下实现多次细胞收集。该方案最初在大鼠中建立，主要得益于其较大的脑容量，靶向区域主要为SEZ或CC，包含两个主要步骤。首先，获取NSCs或OPCs "已移除" 从组织中 通过 脑室内注射 a "释放剂混合物" 含有神经氨酸酶（可诱导心室壁剥脱）、整合素-β1阻断抗体以及成纤维细胞生长因子2（FGF2）。该混合液通过立体定位双侧注射至侧脑室。若目标是分离神经干细胞（NSCs），则靶向侧脑室的吻侧区域；若旨在更纯化地分离少突胶质前体细胞（OPCs），则将混合液注射至海马伞的尾侧区域。在第二次 "收集" 步骤：对麻醉大鼠进行枕大池脑脊液（CSF）液态活检，无需切口。将液态活检样本与NSC培养基混合，可在4 °C保存至接种。
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方案
动物的繁殖、饲养及实验操作均依照英国《1986年动物（科学实验）法案》以及希腊共和国总统令第56/2013号的规定进行，并经剑桥大学和帕特雷大学的动物福利与伦理审查机构审查批准，同时获得当地州级动物护理与使用委员会的批准和监督（方案编号：5675/39/18-01-2021）。实验所用动物为雄性和雌性Sprague-Dawley、Wistar和Long-Evans大鼠，年龄在2至4个月之间，体重范围为150 g至250 g。该实验方案在图1中以图示形式进行了总结。
1. 裂解液的配制
注意：在操作当天新鲜配制，并置于冰上保存。每2 µL用于单侧脑室注射，按此量配制。每预定注射一次，额外准备1 µL。
- 准备 0.5 µL 来自产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）（旧称 Clostridium welchii）的 500 mU 神经氨酸酶。
注意：将该酶以 1 U/µL 的浓度溶于无菌水中，配制成储存液，于 -20 °C 保存。其他类型的神经氨酸酶尚未经过测试。 - 准备含 1 µg 整合素 β1 阻断抗体的 1 µL 溶液。
注意：于 4 °C 保存。 - 准备含 0.5 µg 碱性成纤维细胞生长因子（重组人 FGF-basic）的 0.5 µL 溶液。
注意：将该因子以 1 µg/µL 的浓度溶于无菌水中，配制成储存液，于 -20 °C 保存。
2. 释放鸡尾酒的注射
注意：整个过程可在20分钟内完成。手术操作需在无菌条件下进行。使用消毒剂（如3%或6%过氧化氢）清洁所有表面。使用经高压灭菌或预灭菌的器械、手套、手术衣和铺巾。
- 通过吸入异氟烷（诱导剂量为2.5%，维持剂量为2%）对实验动物进行麻醉。通过检查角膜反射、对刺激的反应（后肢和尾部夹捏试验）以及呼吸模式来确认麻醉深度。
注意：手术可在腹腔注射麻醉剂（如氯胺酮[40 mg/kg]和赛拉嗪[10 mg/kg]）诱导的全身麻醉下进行。通过检查角膜反射、对刺激的反应（后肢和尾部夹捏试验）以及呼吸模式确认深度麻醉。 - 在麻醉诱导时皮下注射镇痛药（如0.3 mg/mL丁丙诺啡）。
- 将大鼠固定在立体定位仪上。
- 使用剃刀剃除头部毛发，并用消毒剂（如10%聚维酮碘溶液）清洁皮肤，随后用酒精擦拭。使用无菌棉签重复消毒三次 ，每次以环形方式擦拭3-5秒。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 使用无菌手术刀沿头部中线做一条长约2 cm的切口。
- 使用无菌棉签和无菌生理盐水仔细清理颅骨表面。
- 使用安装在立体定位仪上的10 µL Hamilton注射器针头边缘定位前囟。将前囟设为"0,0点"。
注意：前囟定义为矢状缝与冠状缝交汇的点。更多细节可参考Paxinos和Watson的大鼠脑图谱5。 - 将装置移动至以下坐标：前后向（AP）= 0.3 mm，外侧向（L）= +1.2 mm（靶向SEZ），或AP = 1.5 mm，L = +2.0 mm（靶向CC）。
- 使用牙科钻头钻出直径1 mm的钻孔。
注意：手动钻孔时需注意避免损伤皮层表面。出血量通常不大。如有出血，使用生理盐水清除，并施加压力以控制持续性出血。 - 将4 µL释放混合液装入10 µL Hamilton注射器中。
- 降低Hamilton注射器的针头（建议使用钝头或锥形针尖），使其接触硬脑膜。
- 将针头插入至目标深度（D = 3.5 mm）。
注意：在硬脑膜表面滴加生理盐水以保持组织湿润。 - 以1 µL/min的速度注入2 µL释放混合液。
- 注液完成后，将针头留置原位2分钟，再缓慢拔出，以防止释放混合液回流。
- 在对侧半球重复步骤2.8–2.14，靶向坐标为AP = 0.3 mm，L = -1.2 mm（靶向SEZ），或AP = 1.5 mm，L = -2.0 mm（靶向CC）。
- 使用5-0尼龙线（直径0.1 mm）缝合切口，并用消毒剂清洁缝合区域。
- 移除麻醉面罩，将动物转移至术后监测区域。
注意：动物应在5–10分钟内从麻醉中恢复并维持卧姿，25分钟内完全恢复（行为正常）。- 在温暖（24–25 °C）、安静、无细颗粒垫料（以防阻塞气道）的环境中密切监测恢复情况（包括活跃且持续的运动、频繁饮水）。仅在确认完全恢复后，将动物归还至原笼伴鼠（不得与新动物合笼）。
- 术后至少在饲养设施中监测动物48小时。若出现疼痛迹象（如藏头、异常头位或体位、触碰时过度敏感或兴奋），应给予镇痛处理（如皮下注射0.3 mg/mL丁丙诺啡）。如发现动物毛发变色或竖立，应转交负责兽医处理。
3. 脑脊液（CSF）液体活检
注意：整个过程可在10分钟内完成。此处所述的液体活检在注射释放鸡尾酒溶液后第3天进行，但可根据需要在任何所需时间以完全相同的方式进行。手术操作需在无菌条件下进行。使用消毒剂（例如3%或6%过氧化氢）清洁所有表面。使用已高压灭菌或预灭菌的器械、手套、手术服和手术单。
- 通过异氟烷吸入麻醉动物（诱导浓度为2.5%，维持浓度为2%）。通过检测角膜反射确认麻醉深度
反射、对刺激的反应（后肢和尾部夹捏试验）以及呼吸方式。
注意：手术操作可在腹腔注射麻醉剂（如氯胺酮 [40 mg/kg] 和赛拉嗪 [10 mg/kg]）诱导的全身麻醉下进行。然而，由于该操作时间较短，尤其当需要在连续数天内多次取活检时，不建议采用此种麻醉方式。 - 在麻醉诱导时皮下注射镇痛剂（例如，0.3 mg/mL 布托啡诺）。
- 将实验动物固定于立体定位仪上，使用耳杆固定头部，确保头部可自由前后旋转而不受阻碍。
- 将头部稳定在向下40°角，以充分伸展颈部后侧。
注意：一种实现方法是使用该设备的口部挡板6. - 用剃刀剃除颈部区域的毛发，并使用消毒剂（如10%聚维酮碘溶液）清洁皮肤，然后使用酒精。重复应用消毒剂三次。 使用无菌棉签，每次以环形动作擦拭3-5秒。
- 用指尖寻找位于枕外隆凸与寰椎棘突之间呈菱形的可凹陷区域6.
- 画一个点标记（例如，使用记号笔）。
- 在立体定位仪上安装1 mL或0.5 mL注射器。
注意：建议使用针头不可拆卸的注射器，因为其吸力更强且死体积更小。 - 将针头置于皮肤标记点处接触。
- 用镊子提起皮肤，同时将注射器穿过皮肤各层向下推进。
- 稍微回抽活塞，以在注射器内产生负压。
- 重新开始，非常缓慢地插入针头，直到有液体（脑脊液）出现在注射器中。
- 将针头固定在此位置，使脑脊液缓慢流出。
注意：如果脑脊液流动非常缓慢，可略微降低或升高针头。 - 以每分钟40 µL的速率逐步缓慢移除脑脊液，总量达120 µL。
- 缓慢取出注射器。
- 腹腔注射1 mL正常血清，以支持实验动物的液体补充。
- 将液体活检样本（脑脊液）与400 µL NSC培养基混合，将微量离心管置于4 °C保存，待后续使用。
注意：若未冷冻，液体活检样本应在3小时内处理。 - 移除提供麻醉的面罩，并将动物转移至术后监护区域。
注意：动物应在5-10分钟内从麻醉中恢复并维持卧姿，25分钟内应完全恢复（行为正常）。- 密切监测动物恢复情况（活动生动且不间断，频繁饮水），恢复环境应保持温暖（24–25 °C）、安静，且不使用细颗粒垫料，以免阻塞气道。确认动物完全恢复后，方可将其归还至原笼位同伴中（不可与新动物合笼）。
- 术后至少在维持饲养设施中观察动物48小时。若观察到疼痛迹象（如头部躲藏、头或身体姿势异常、触碰时过敏或过度兴奋），应给予镇痛处理（例如，皮下注射0.3 mg/mL丁丙诺啡）。如动物出现毛发变色或竖立现象，应转交负责兽医处理。
4. 免疫荧光组织处理
- 通过心内灌注 20 mL 冰冷生理盐水，随后灌注 50 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA；溶于 pH = 7.4 的磷酸盐缓冲液 [PBS] 中），处死动物。
- 解剖脑组织。
- 使用剪刀在颈椎区域剪切断头，将头部与身体分离。用剪刀去除皮肤，然后沿矢状中线剪开颅骨，剪刀尖端朝上，以避免损伤脑组织。尽量继续剪切，越过冠状中线。
- 使用镊子去除颅骨，从枕上骨和顶骨开始，最后去除额骨。
- 暴露脑组织后，使用镊子或刮匙将其从颅腔中取出。为便于操作，可剪断脑底部的神经以及（如不需要）嗅球。
- 将组织在 4 °C 条件下，用 2% PFA 固定过夜。
- 将组织在 30% 蔗糖（溶于 PBS）中于 4 °C 冰冻保护至少 48 小时，直至组织沉至底部。
- 将组织在 -80 °C 下冷冻。
- 使用冷冻切片机将脑组织切成 14 μm 厚的冠状切片。
- 采用标准方案进行免疫荧光染色 3,7
- 将切片在封闭缓冲液（含 3% 牛血清白蛋白 [BSA] 和 0.1% Triton X-100 的 PBS）中室温孵育 2 小时。
- 进行抗原修复（将切片置于玻璃瓶中，在 10 mM 柠檬酸缓冲液（pH = 6.0）中煮沸 15 分钟）。
注意：此步骤为可选，但对核抗原检测是必需的。 - 恢复至室温后，在封闭缓冲液中加入针对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、双皮质素（Dcx）、S100β 和 β-连环蛋白（β-catenin）的一抗（参见材料表），4 °C 过夜孵育。
- 在含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 PBS 中加入二抗，室温孵育 2 小时，用于细胞核复染（参见材料表）。
- 封片。
5. 免疫荧光染色用分离细胞的处理
- 将细胞接种至适用于显微镜观察的96孔板中，孔板需预先用多聚赖氨酸（100 µg/mL）包被。
- 用预冷的2%多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟，随后用PBS洗涤3次。
- 按照标准流程进行免疫荧光染色3,7，检测PDGFRα、GFAP、Dcx、SOX2和ID3（参见材料表）。
- 将细胞置于含叠氮化钠（NaN3，0.1%）的PBS中，4 °C避光保存。
6. 显微镜观察与图像分析
- 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜拍摄图像，并利用标准图像分析软件工具（如细胞计数器）进行细胞计数。
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结果
神经干细胞的释放与收集
SEZ 的神经干细胞仅由单层室管膜细胞与脑脊液相隔，但仍与脑室内容物保持直接接触 通过 插入性单纤毛突起8,9. 神经氨酸酶特异性作用于室管膜细胞 通过 唾液酸残基的裂解可导致脑室壁裸露，进而引起神经母细胞在脑室表面聚集。10,11此外，在脑室内注射整合素-β1阻断抗体后，已在脑脊液中观察到神经母细胞的流动，这可能是由于室管膜细胞间的连接松解所致。12这些观察结果促使了一种分离脑内干细胞和祖细胞的方案的建立 通过 对侧脑室壁完整性的可控性破坏。第一步，诱导神经干细胞或少突胶质前体细胞从脑实质中释放，并随后流入脑脊液中 通过 脑室内注射释放鸡尾酒。该鸡尾酒以立体定位方式按一定速率注射 1 µL/min，双侧（2 µL 每侧脑...
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讨论
干细胞与祖细胞在哺乳动物脑组织中相对稀少，且神经干细胞（NSCs）位于难以进行安全、便捷活检的区域（如脑室壁、海马体）。因此，迄今为止，实验研究这类细胞的唯一途径是通过死后组织分离。本文逐步介绍一种名为“挤取”（milking）的技术，可用于从活体大鼠中单次或重复采集神经干细胞（NSCs）和少突胶质前体细胞（OPCs）。该方法基于两个关键特征：i）NSCs或OPCs被室管膜细胞单层与脑室系统内的脑脊液（CSF）分隔；ii）室管膜细胞与神经前体细胞之间，以及它们与其他邻近细胞类型之间保持细胞连接。 通过 整合素。因此，注射到脑室特定区域以促使神经干细胞（NSCs）或少突胶质前体细胞（OPCs）从脑实质中分离的释放混合液中含有神经氨酸酶，一种可特异性靶向并杀死室管膜细胞的毒素。10,11，以及整合素-β1阻断抗体。此外还含有FGF2，因为该生长因子对于神经干细胞在微环境及体外培养中的存活与维持至关重要15,
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
本工作获得了 Action Medical Research（英国）基金（项目编号：GN2291）对 R.J.M.F. 和 I.K. 的资助。该项研究还部分得到了希腊研究与创新基金会（H.F.R.I.）的资助（用于动物费用及对 D.D. 的支持），资助项目为 "支持高校教职员工与研究人员及采购高成本科研设备的 H.F.R.I. 首轮研究项目资助计划"（项目编号：3395）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 释放混合液 | |||
| β1-整合素阻断抗体 | BD Biosciences | #555002 | 纯化NA/LE仓鼠抗大鼠CD29克隆Ha2/5，1 mg/mL。任何具有阻断活性的抗体均可适用。 |
| 来自Clostridium perfringens（Clostridium welchii）的神经氨酸酶 | Sigma-Aldrich | #N2876 | 其他来源（例如霍乱弧菌）的神经氨酸酶尚未经过测试。 |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（154个氨基酸） | Peprotech | #100-18B | 以1 μg/μL储存液形式保存，溶于无菌水，-20 °C保存 |
| 手术操作 | |||
| 10 µL注射器 | Hamilton | #80330 | 型号701 RN，可拆卸小针头，26s规格，2英寸，2型针尖 |
| BD Micro-fine 1 mL胰岛素注射器 | BD biosciences | 04085-00 | 29 G × 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL（布托啡诺0.3 mg/mL） |
| 数字标准型大鼠和小鼠立体定位仪 | Stoelting | 51500D | |
| 恒温监测系统 | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g 吸入用蒸气，液体 | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | 氯胺酮100 mg/mL |
| 尼龙缝合线，Ethilon | Ethicon | D9635 | 透明，5-0规格 |
| 可充电无线外科修剪器 | Stoelting | Item:51472 | |
| 手术刀片，无菌 | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8英寸棉签 | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| 立体定位高速钻 | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s立体定位仪套件 | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | 赛拉嗪，25 mL |
| 组织与细胞处理及免疫染色 | |||
| 适用于显微镜观察的96孔板 | Greiner | #655866 | Screen star微孔板 |
| B27添加剂 | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Merck | P06-1391100 | 第五组分，热激处理 |
| 柠檬酸盐 | Merck | 71497 | 一水合柠檬酸钠 |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | 细胞核染色，稀释比例：1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | 高糖，含丙酮酸钠 |
| 驴抗山羊 | Biotium | 20016 或 20106 或 20048 | 稀释比例：1/1,000 |
| 驴抗小鼠 | Biotium | 20014 或 20105 或 20046 | 稀释比例：1/1,000 |
| 驴抗兔 | Biotium | 20015 或 20098 或 20047 | 稀释比例：1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2（或bFGF） | Peprotech | 100-18B | |
| 山羊抗GFAP | Abcam | ab53554 | 稀释比例：1/500 |
| 山羊抗SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | 稀释比例：1/200 |
| 小鼠抗ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | 稀释比例：1/200 |
| 小鼠抗S100β | Sigma | S2532 | 稀释比例：1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | 封片剂 |
| N2添加剂 | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| 多聚甲醛 | Merck | 158127 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Merck, Millipore | A-003-E | 溶液，1.0 mg/mL |
| 兔抗双皮质素（DCX） | Abcam | ab18723 | 稀释比例：1/500 |
| 兔抗PDGFRα | Abcam | ab51875 | 稀释比例：1/200 |
| 兔抗β-连环蛋白 | Abcam | ab16051 | 稀释比例：1/500 |
| 吐温X-100 | Merck | X100 | |
| 显微镜观察与图像分析 | |||
| 共聚焦显微镜 | Leica | SP6 和 SP8 | |
| 图像分析 | NIH, USA | ImageJ | |
| 图像分析 | Leica | LasX |
参考文献
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