小鼠脑室内自由手注射

摘要

本文介绍了一种无需使用脑立体定位仪的徒手操作方法，用于在小鼠中快速、简便地进行脑室内注射。

摘要

研究神经内分泌系统通常需要将药物、病毒或其他实验试剂直接递送至小鼠脑内。脑室内（ICV）注射可使实验试剂广泛分布于全脑（尤其是靠近脑室的结构）。本文描述了在成年小鼠中进行徒手脑室内注射的方法。通过利用小鼠头部的视觉和触觉解剖标志，可快速且可靠地将试剂注入侧脑室。注射时使用玻璃注射器，由实验者手持，并根据与解剖标志的大致距离进行定位。因此，该技术无需使用立体定位仪。此外，该技术仅需短暂的异氟烷麻醉，便于在清醒、自由活动的小鼠中后续评估其行为和/或生理状态。徒手脑室内注射是一种高效向活体小鼠脑内递送实验试剂的有力工具，可与其他技术结合使用，例如频繁采血、神经环路操控或体内记录，以研究神经内分泌过程。

引言

在神经内分泌学研究中，通常需要将实验试剂（如药物¹、病毒²或细胞³）递送至脑内。如果该试剂不能轻易穿过血脑屏障，或实验目的是特异性地检测该试剂的中枢作用，则必须具备一种可靠的脑内注射给药方法。此外，向脑室内（ICV）注射可使试剂在脑内广泛分布，并提供较大的靶区，从而提高注射成功的可能性²。

一种常见的脑室内注射方法是植入永久性留置导管。该方法需要使用立体定位仪来固定 commercially available 或定制的导管，并用胶水或牙科水泥将导管固定在颅骨上。通常在动物恢复后，通过导管给予超生理剂量的血管紧张素II，若立即观察到饮水行为，则认为导管位置正确⁴。该方法具有多种优势，包括能够进行长期输注以及对同一动物进行多次注射；此外，若使用血管紧张素II，可在给予实验性化合物之前确认导管位置是否准确。然而，植入永久性导管也存在一些局限性，例如需要昂贵的设备（立体定位仪）、导管植入后可能受到损伤（例如小鼠可能啃咬同笼小鼠的导管）以及导管周围可能发生感染。单次脑室内注射也可借助立体定位仪完成³，尽管该方法有效，但需要较长时间暴露于麻醉状态，因此可能掩盖治疗引起的某些急性生理和行为效应。此外，将小....

方案

所有实验程序均经科罗拉多州立大学（#3960）和加州大学圣地亚哥分校机构动物照护与使用委员会批准，代表性数据在上述机构采集（S13235，项目负责人 Kellie Breen Church）。代表性数据部分展示了五只成年雌性及两只成年雄性 C57/BL6 小鼠（9–16 周龄）的数据。雌性小鼠在脑室内注射和采血前 3–4 周进行了卵巢切除术，操作步骤如前所述⁷。实验前，小鼠饲养于 12 小时光照/12 小时黑暗的光周期环境中，并可自由获取饲料和饮水，符合《实验动物照护与使用指南》的要求。

1. 实施开颅手术

注意：开颅手术可于实际注射前数日进行，这样可使实验当天的注射过程更加快捷。

1. 按照以下说明准备开颅手术所需材料。
   1. 在工作台面上铺上干净的垫布或无菌铺巾。将异氟烷蒸发器的鼻罩用胶带固定在工作台面上（靠近但背向实验操作者；见图1A）。
   2. 将硅胶管套在无菌锋利的18 G针头末端，使针尖约有 ~1 mm 露出。同样，将硅胶管套在无菌钝头针末端，使针尖约有 ~1 mm 露出。
      注意：每只小鼠应使用独立包装、无菌的针头（锋利和钝头），不可重复使用。
   3. 准备电动剃毛器、碘伏消毒液、无菌纱布和....

结果

当操作成功时，该技术可实现将实验试剂快速递送至脑室系统。图 2A 展示了一只接受脑室内注射 3 µL 无菌等渗盐水（多种药理学化合物的溶剂）的去卵巢小鼠的黄体生成素（LH）脉冲分泌谱。此示例表明，短暂暴露于气体麻醉以及向脑室系统注射 3 µL 液体本身并未改变 LH 的脉冲式分泌。脑室内注射后 3 小时，动物被实施安乐死，采集新鲜冷冻的神经组织并在冷冻切片机上切片；可见注射轨迹明显穿入侧脑室。在经固定液灌注（10 mL 肝素化生理盐水，随后 20 mL 磷酸盐缓冲液中的 4% 多聚甲醛）的小鼠神经组织中，也可观察到注射轨迹。正确注射位置的示例如图 2B 所示。图 2C 展示了两个注射位置错误的示例。正确（左侧）与错误注射印度墨汁的示例如图 2D 所示。注射印度墨汁有助于练习该技术，因其可清晰显示注射部位。在正确注射的样本中，可见染料流入双侧侧脑室及第三脑室（图

讨论

本文介绍了一种在小鼠中进行脑室内注射的简单且有效的方法。由于该技术不需要使用立体定位仪，因此更多研究人员能够开展药物和实验试剂的中枢递送研究。此外，该方法通量相对较高，因为准备和注射操作均可快速完成。

由于该操作需要手动操控针头和玻璃注射器，并依据大致距离进行定位，因此建议初学者在接触活体动物前，先花费一定时间练习相关操作动作。此外，使用小鼠尸体有助于练习通过针头定位前囟。在初步掌握操作动作后，借助专门用于练习的活体动物积累经验将非常有帮助。练习过程中，注射3 µL印度墨汁可使注射位置的视觉评估更为直观。定位准确的注射会在同侧侧脑室出现黑色染色，常同时可见第三脑室及对侧侧脑室染色。墨汁注射为终末性操作，注射后不应让小鼠从麻醉中苏醒。即使是经验丰富的操作者，也建议在正式注射前重复练习2 mm外侧和1 mm尾侧的移动动作数次。此外，将玻璃注射器插入脑组织时，必须保持其垂直。通过反复练习， >可预期约75%的注射能够准确定位。在完全注入液体后，将针头保持在原位约1分钟，有助于防止液体从脑组织回流。在此期间，必须确保针头处于正确位置且无任何移动。成功完成该操作需要操作者具备稳定操控.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18号钝头针	SAI输注	B18-150
18号针头	BD Medical	305195
酒精棉片	菲舍尔科技公司	22-363-750
实验台垫	菲舍尔科技公司	14-206-62AC22
聚维酮碘溶液	菲舍尔科技公司	NC1696484
丁丙诺啡	Patterson Vet Supply	07-892-5235	管制药品
眼用润滑膏	菲舍尔科技公司	50-218-8442
玻璃注射器	Hamilton	7634-01
注射针头	Hamilton	7803-01	27号，小接头RN针头，尖端类型：4，针头长度：10 cm，角度：45°
异氟烷	Patterson Vet Supply	07-893-8441
异氟烷挥发器	Vet Equip	V-10
实验室胶带	VWR	89098-128
医用级氧气	Airgas	OX USPEA
多聚甲醛	Millipore-Sigma	8.18715.1000
磷酸盐缓冲液	菲舍尔科技公司	J67802.K2
PulsaR软件	开源，奥塔哥大学		参见参考文献9
尺子	菲舍尔科技公司	12-00-152
硅胶管（0.040" 内径）	DOW	508-005
硅胶管（0.078" 内径）	DOW	508-009
无菌生理盐水	VWR	101320-574
蔗糖	菲舍尔科技公司	S5-500