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方法文章

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

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DOI：

10.3791/65328

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2023年5月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, 2Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

本文内容

摘要

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。

摘要

发育中的心脏是一个复杂的结构，包含多种由复杂调控机制控制的前体细胞。对单个细胞的基因表达和染色质状态进行检测，可以识别细胞类型和状态。单细胞测序技术已揭示了心脏前体细胞异质性的多个重要特征。然而，这些方法通常仅限于新鲜组织，这限制了在不同实验条件下的研究，因为新鲜组织必须在同一次实验中立即处理，以减少技术上的变异性。因此，该领域迫切需要简便且灵活的方法，以支持单核RNA测序（snRNA-seq）和基于高通量测序的单核转座酶可及染色质分析（snATAC-seq）等技术的数据生成。本文介绍了一种快速分离细胞核以进行后续单核双组学分析（联合snRNA-seq与snATAC-seq）的实验方案。该方法可从心脏前体细胞的冷冻样本中分离细胞核，并可与使用微流控腔室的平台相结合。

引言

在出生缺陷中，先天性心脏病（CHDs）最为常见，每年约发生在1%的活产婴儿中1,2。仅在少数病例中可识别出基因突变，表明其他病因（如基因调控异常）也参与了先天性心脏病的发病机制2,3。心脏发育是一个涉及多种相互作用细胞类型的复杂过程，这使得识别非编码区致病突变及其对基因调控的影响变得极具挑战性。心脏器官发生始于细胞前体，这些前体分化为不同类型的心脏细胞，包括心肌细胞、成纤维细胞、外膜细胞和内膜细胞4,5。 单细胞基因组学正成为研究心脏发育以及评估细胞异质性在健康与疾病状态下影响的关键方法6。多组学技术的发展实现了对不同参数的同步检测，同时计算分析流程的不断拓展，促进了对正常和病变心脏中细胞类型及亚型的发现6。本文介绍了一种可靠的单细胞核分离方案，适用于从小鼠胚胎获取的冷冻心脏前体细胞，该方案可兼容后续的snRNA-seq和snATAC-seq分析（也可用于snRNA-seq与snATAC-seq联合分析）7,8,9。

ATAC-seq 是一种可靠的方法，可用于鉴定调控性开放染色质区域并确定核小体的位置10,11。这些信息可用于推断转录因子的位置、身份和活性。由于该方法在检测染色质结构的定量变化方面具有高度敏感性，因此还可用于分析染色质因子（包括染色质重塑复合物）以及RNA聚合酶的转录活性1,2。因此，ATAC-seq 提供了一种稳健且无偏倚的方法，用于揭示特定细胞类型中转录调控的机制。ATAC-seq 方案还已被验证可用于单细胞水平的染色质可及性检测，从而揭示细胞群体内染色质结构的异质性10,12,13。

尽管近年来单细胞研究领域取得了显著进展，但开展这些实验所需新鲜样本的处理仍是主要难题14。为克服这一困难，研究人员已开展多项测试，旨在利用冷冻的心脏组织或细胞进行snRNA-seq和snATAC-seq等分析15,16。

已有多种平台被用于分析单细胞基因组学数据17。目前广泛使用的单细胞基因表达和ATAC分析平台均基于多重微流控液滴包封技术17。由于这些平台依赖微流控腔室，碎片或聚集体可能堵塞系统，导致数据无法使用。因此，单细胞研究的成功取决于对单个细胞/细胞核的精确分离。

本文所述方案采用了一种与近期利用snRNA-seq和snATAC-seq研究先天性心脏病相似的方法18,19,20,21,22,23。该方法首先对新鲜显微解剖获得的心脏组织进行酶解离，随后对小鼠心脏前体细胞进行冷冻保存。解冻后，通过纯化获得活细胞，并进一步进行细胞核分离处理。在本研究中，该方案已成功用于从小鼠心脏前体细胞的同一批核制备物中获取snRNA-seq和snATAC-seq数据。

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方案

本研究采用的动物实验方案已获得马赛大学（Aix-Marseille University，C2EA-14）动物伦理委员会的批准，并依照国家动物实验伦理委员会指定机构批准的方案进行（法国国民教育、高等教育与研究部；授权编号 Apafis N°33927-2021111715507212）。

1. 解剖前设置定时交配

  1. 为获取小鼠胚胎，需在心脏区域分离前9.5天进行定时交配。本实验中使用2-6月龄的野生型C57BL/6J小鼠，并在夜间进行定时交配。
  2. 次日早晨检查雌鼠是否形成阴道栓。将发现阴道栓的当天记为胚胎发育第0.5天（E0.5）。

2. 组织制备与细胞分离

  1. 在受孕后第9.5天处死2至6月龄的C57BL/6J妊娠雌性小鼠 通过 CO2 随着浓度增加，随后进行颈椎脱位。用70%乙醇清洁腹部下部。
    注意：不建议在颈椎脱位前使用麻醉剂，因为这会使胚胎暴露于可能影响后续转录组学和表观基因组学研究的环境变化中。
  2. 用剪刀打开腹腔和腹膜。观察子宫角，并用镊子切除两侧子宫角。
  3. 将角放入含有冷的完全培养基（含1% FBS）的培养皿中。虽然对体积没有特定要求，但需注意确保胚胎完全浸没在培养基中。每10 cm培养皿使用约10 mL培养基较为合适。
  4. 在体视显微镜下将放大倍数设为5倍，使用镊子从每个胚胎中去除子宫内膜组织、胎盘和卵黄囊。
  5. 将胚胎置于含有1% FBS的冷完全培养基的培养皿中。按照示意图中所示胚胎的示意，解剖胚胎心脏区域 图1，置于冰冷的完全培养基中。
  6. 将五只小鼠胚胎解剖所得的心脏组织汇集至一个1.5 mL微量离心管中。预先将水平转子离心机冷却至4 °C。
  7. 300 × g 离心x g 在室温下以摆桶式离心机离心1分钟。弃去上清液，加入1 mL组织培养级PBS洗涤组织。
  8. 300 x g 离心 g 室温下孵育1分钟。移除上清液，并重复洗涤步骤，共洗涤两次。重复洗涤两次，每次用0.05%胰蛋白酶/EDTA（1×）替代PBS。
  9. 组织消化时，在37 °C下加入50 µL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，孵育10分钟。5分钟后，使用宽孔滤芯吸头通过上下吹打进行轻柔的机械解离。
  10. 通过向解离的细胞中加入 350 µL 完全培养基以终止胰蛋白酶消化反应。将重悬的细胞经 40 µm 细胞滤网过滤。

3. 细胞计数与活力评估

注意：细胞数量和活力是单细胞实验成功的关键参数。snATAC-seq 方法对细胞数量的微小变化非常敏感。细胞数量过少会导致染色质过度消化，从而产生更多的测序读段，并导致不可及的染色质区域被检测到（噪声增加）。同样，细胞数量过多则会产生难以测序的高分子量片段。为了准确定量细胞和细胞核浓度，采用两种不同方法对细胞数量和活力进行了评估。

  1. 按照下述方法进行台盼蓝染色法细胞计数。
    1. 涡旋混匀0.4%台盼蓝染色液，在室温下以2,000 × g 离心10秒，并将10 µL转移至微量离心管中。
    2. 使用移液器混匀细胞悬液，取10 µL细胞悬液加入已分装好的10 µL台盼蓝溶液中。用移液器轻轻吹打混匀10次。
    3. 取10 µL染色后的细胞悬液加入细胞计数板中。将计数板放入细胞计数仪，自动计算细胞浓度和活率。
  2. 按照下述方法进行基于荧光的细胞死亡率评估。
    注意：该检测基于荧光染料（碘化丙啶同源二聚体-1，EthD-1，以及钙黄绿素AM）评估细胞活力。使用市售试剂盒，并按照供应商提供的说明进行试剂的配制和使用。
    1. 取5 µL提供的2 mM EthD-1储备液加入1 mL无菌组织培养级D-PBS中，配制成10 µM EthD-1溶液，涡旋混匀5秒以确保充分混合。
    2. 将2.5 µL提供的4 mM钙黄绿素AM储备液加入已配制的EthD-1溶液中，涡旋混匀5秒以确保充分混合。
    3. 取10 µL配制好的10 µM EthD-1和10 µM钙黄绿素AM工作液，加入10 µL细胞悬液中。
      注意：钙黄绿素在水溶液中极易水解，因此工作液应在1天内使用完毕。
    4. 取10 µL染色后的细胞悬液滴加至细胞计数板上，将计数板插入自动荧光细胞计数仪中。使用GFP滤光片计数活细胞，使用RFP滤光片计数死细胞。
      注意：两种计数方法所得细胞数量和活率结果相似，新鲜解离的细胞总数估计约为每胚胎心脏区域（0.06 mm3）20,000个细胞。

4. 细胞冻存

  1. 在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心细胞悬液 5 分钟。小心移除上清液，避免接触管底，然后将沉淀重悬于 1 mL 预冷的冻存液中。
  2. 将细胞悬液转移至预冷的冻存管中，并将冻存管放入预冷的冻存盒内。
  3. 将冻存盒置于 −80 ◦C 环境中 4 至 8 小时。随后将冻存管转移至液氮中，用于后续的单核 RNA 测序和 ATAC 测序实验。
    ​注意：冻存管在使用前应以干冰运输。根据我们的经验，细胞在液氮中可保存至少 6 个月，且细胞活力不会下降。储存温度应始终低于 −150 °C，以防止冰晶形成。

5. 细胞复苏与死细胞去除

  1. 将冻存管置于 37 °C 水浴中 1-2 分钟。当冻存管中仅剩微小晶体时，立即取出。
  2. 加入 1 mL 预热（37 °C）的完全培养基，用移液器轻轻吹打混匀 3 次。将细胞悬液转移至含有 10 mL 温热完全培养基的 15 mL 锥形离心管中。
  3. 将全部细胞悬液通过 30 µm 细胞筛过滤。用 1-2 mL 温热完全培养基冲洗细胞筛，将滤过液收集至同一锥形离心管中。
  4. 以 300 x g 离心 5 分钟，弃上清液。用 PBS 洗涤一次，将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  5. 以 300 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
  6. 向细胞沉淀中加入 100 µL 提供的磁性微珠，使用宽口移液器吸头吹打混匀 5 次。室温孵育 15 分钟。
  7. 在此期间，用 500 µL 1x 结合缓冲液冲洗磁性分离柱（容量：1 x 107 至 2 x 108 个细胞）。
  8. 孵育结束后，用 500 µL 1x 结合缓冲液稀释含微珠的细胞悬液。
  9. 将细胞悬液（0.6 µL）加至已准备好的磁性分离柱中。流穿部分为阴性分选的活细胞组分，磁性滞留部分为阳性分选的死细胞。
  10. 将活细胞流出液收集至 15 mL 离心管中。用 2 mL 1x 结合缓冲液冲洗盛有细胞悬液的 1.5 mL 微量离心管及磁性分离柱，并将冲洗液收集至同一 15 mL 离心管中。
  11. 以 300 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
  12. 加入 1 mL PBS-BSA 溶液，使用宽口移液器吸头轻轻吹打 5 次混匀。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  13. 以 300 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
  14. 加入 1 mL PBS-BSA 溶液重悬细胞沉淀，并重复洗涤步骤，共洗涤两次。
  15. 将细胞重悬于 100 µL PBS-BSA 溶液中，用移液器轻轻吹打 10 次混匀。
  16. 使用前述方法（步骤 3.1 和步骤 3.2）测定细胞浓度和活力。进行下一步前，确保细胞数量 ≥100,000 个。代表性结果见 图 2。
    ​注意：冻存过程会导致活细胞起始材料损失约 40%。根据起始细胞数量，磁珠柱分离可获得高细胞活力，但总细胞数量会减少至原来的二分之一至五分之一。建议仅在起始材料充足时使用基于柱的磁珠试剂盒去除死细胞。

6. 细胞核分离

注意：单核ATAC和单核RNA测序联合实验需使用纯净且完整的细胞核悬液。建议针对所用细胞类型优化裂解条件（裂解时间和NP40浓度）。最佳裂解时间点和去垢剂浓度应是在不破坏细胞核形态的前提下，使尽可能多的细胞被裂解。使用水平转子离心机替代固定角转子离心机可减少细胞/细胞核的损失。为最大限度减少细胞核在塑料器皿上的残留，建议使用低吸附型移液器吸头和离心管，这有助于提高细胞核回收率。使用5% BSA对移液器吸头和离心管进行包被是一种成本较低但耗时较长的替代方案。

  1. 使用70%乙醇和RNase去除溶液清洁工作区域和材料。
  2. 将摆动桶离心机预冷至4 °C。新鲜配制裂解缓冲液、裂解稀释缓冲液、0.1x裂解缓冲液和洗涤缓冲液（见表1）。将缓冲液置于冰上保存。
  3. 在摆动桶离心机中，以500 x g 在4 °C下离心细胞悬液5分钟。小心移去上清液，避免触碰管底，以防扰动细胞沉淀。
  4. 加入100 µL预冷的0.1x裂解缓冲液，通过移液器轻柔吹打10次混匀。冰上孵育5分钟。
  5. 加入1 mL预冷的洗涤缓冲液，用移液器轻柔吹打5次混匀。在4 °C下以500 x g 离心5分钟。移去上清液时避免破坏核沉淀。
  6. 用预冷的洗涤缓冲液重复洗涤，共进行三次洗涤。配制稀释的核缓冲液。重悬后，将核储存液置于冰上保存。

7. 分离细胞核的质量与数量评估

注意：根据初始细胞计数，并估计细胞裂解过程中约有 50% 的细胞核损失，应将适当数量的细胞重悬于冰冷的稀释细胞核缓冲液中。使用预冷稀释细胞核缓冲液重悬的体积计算，需依据目标回收的细胞核数量以及制造商用户指南中推荐的相应细胞核储存浓度。该计算示例见补充方案 1。

  1. 根据初始细胞数量，并估计细胞裂解过程中约有 50% 的细胞核损失，将适当数量的细胞重悬于冷的稀释细胞核缓冲液中。
  2. 测定实际的细胞核浓度。取 2 µL 细胞核储备液与 8 µL 稀释细胞核缓冲液混合，然后将混合液加入预先分装好的 10 µL 台盼蓝或 EthD-1/CalceinAM 工作液中。使用自动细胞计数仪对细胞核进行计数。活细胞比例应低于 5%。代表性结果见图 3。
  3. 计算所需细胞核储备液和稀释细胞核缓冲液的体积，以获得推荐用于转座反应浓度下的总体积 5 µL（参见试剂盒用户指南）。立即按照用户指南进行转座反应17。
    ​注意：从转座反应到 ATAC 和 GEX 文库构建的所有步骤均按照用于 snRNA-seq 与 snATAC-seq 联用试剂盒的用户指南进行17。

8. snRNA-seq 和 snATAC-seq 文库的质量分析

  1. 在进行下一代测序之前，需验证最终的单核转座可及性测序（snATAC-seq）和基因表达（GEX）文库的质量及片段大小分布。使用片段分析系统评估文库中测序序列的质量和数量。代表性质量评估结果参见图4。
    注意：snATAC-seq文库的最终图谱应显示出核小体缠绕的周期性特征，片段大小范围应在200 bp至数Kbp之间；而基因表达文库的片段大小范围应在300 bp至600 bp之间。

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结果

与用于单细胞技术的单细胞悬液制备相比，单核悬液的制备更具挑战性，需要更高的分辨率和更精细的处理。成功实现snRNA-seq与snATAC-seq联合分析的关键因素在于获得纯净且完整的细胞核悬液。高效的细胞核分离方案必须根据组织类型和样本状态（新鲜或冷冻）进行相应调整。本文介绍了一种优化后的从小鼠胚胎心脏冷冻组织中分离细胞核的方案。从胚胎心脏区域的解剖、心肌细胞的解离到细胞核的分离，所有步骤均在图1中进行了总结。在起始材料方面，建议用于高效细胞核分离的细胞数量为1×105–1×106个细胞，细胞活力应>70%。如图2所示，本方案中在解冻后额外增加了死细胞去除与分选步骤，从而获得了更纯净的细胞悬液，显著提高了细胞活力，并改善了起始样本的质量。除细胞核分离外，本方案还详细说明了如何评估所分离细胞核的质量与数量（图3）。所分离细胞核的质量会显著影响snRNA-seq与snATAC-seq联合数据的质量；在此，通过评估核膜形态...

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讨论

通过结合单核RNA测序（snRNA-seq）和单核ATAC测序（snATAC-seq）研究发育中心脏的细胞组成，有助于更深入理解先天性心脏病的发病机制26。多个研究实验室已探讨了心脏组织冷冻保存对snRNA-seq的影响27。在比较不同实验条件时，使用来自人类疾病小鼠模型的新鲜显微解剖组织进行snRNA-seq和snATAC-seq在操作上可能具有挑战性。对于特定发育阶段，一个难点在于对照组和实验组必须在同一轮实验中处理，以减少样本处理过程中引入的技术变异。当无法处理新鲜组织时，根据我们的研究结果，建议先进行组织解离，然后冷冻保存，而不是直接将整个胚胎心脏组织速冻。选择前一种方法的原因在于，若将心脏组织整体冷冻，解冻后获得有活力的单细胞将更加困难。然而，如果组织解离方案未经过优化，则整体速冻组织可能是更优选择。优先推荐解离后冷冻保存，因为该组织解离方案可获得>90%的新鲜有活力细胞，且无细胞类型偏好性。

这种方法具有多个优势，例如可使用冻存细胞，从而无需新鲜组织；同时采用单细胞解...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了ERA-CVD-2019和ANR-JCJC-2020对SS的资助。我们感谢马赛医学遗传学实验室U 1251/基因组学与生物信息学平台（GBiM）以及匿名审稿人提供的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2100 生物分析仪Agilent无目录编号
5M 氯化钠 (NaCl)Sigma59222C-500ML 
10% BSA SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM 芯片 J 单细胞试剂盒，16 次反应10X Genomics1000230
Chromium Next GEM 单细胞多组学 ATAC + 基因表达试剂套装，4 次反应（含 20X 细胞核缓冲液）10X Genomics1000285
Countess 细胞计数板载玻片InvitrogenC10283
Countess III FLThermofisher无目录编号
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind 管 Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094无菌且无 RNase
双索引试剂盒 TT Set A，96 次反应10X Genomics1000215
Falcon 15 mL 圆锥形离心管 Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL 圆锥形离心管 Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001热灭活
高灵敏度 DNA 试剂盒Agilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒ThermofisherL3224
MACS 死细胞去除试剂盒：死细胞去除 MicroBeads，结合缓冲液 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
氯化镁 (MgCl2)SigmaM1028-100ML
McCoy 5A 培养基 Thermofisher16600082
MS 柱Miltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2Illumina无目录编号
青霉素-链霉素 (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
ROCK 抑制剂Enzo Life SciencesALX-270-333-M005
单索引试剂盒 N Set A，96 次反应10X Genomics1000212
标准 90 mm 无菌培养皿 SterilinThermofisher101R20
无菌双蒸水ThermofisherR0582
Trizma 盐酸溶液 (HCl)SigmaT2194-100ML 
台盼蓝染液 (0.4%)InvitrogenT10282
0.05% 胰蛋白酶 - 1X EDTAThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
宽口滤芯移液器吸头 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISS无目录编号

参考文献

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124(2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130(2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480(2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810(2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877(2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211(2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820(2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121(2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097(2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42(2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361(2022).

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RNA ATAC
从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析
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