左心房结扎在鸟类胚胎中作为早期血管发育期间改变血流动力学负荷的模型

摘要

本文介绍了一种在鸟类胚胎中实施左心房结扎（LAL）模型的详细可视化操作流程。LAL模型可改变心脏内的血流，从而改变壁面剪切应力负荷，模拟发育不全性左心发育不良综合征。本文提供了一种克服该复杂显微外科模型操作难点的技术方法。

摘要

由于鸟类胚胎具有四腔室的成熟心室结构，且易于培养、成像观察和操作高效，因此成为研究心血管发育的首选脊椎动物模型。该模型被广泛应用于探索正常心脏发育过程及先天性心脏病预后的相关研究。通过引入显微外科技术，可在特定胚胎发育时期改变其正常的机械负荷模式，并追踪下游的分子与遗传级联反应。最常见的机械干预方法包括左卵黄静脉结扎、动脉球束带术以及左心房结扎（LAL），这些操作可通过改变血流来调节血管壁内的压力和壁面剪切应力。in ovo条件下实施的LAL尤其具有挑战性，因其需要极其精细的连续显微手术操作，导致样本获得率极低。尽管如此，in ovo LAL在科学上具有重要价值，因为它能够模拟临床上与人类新生儿相关的复杂先天性心脏病——左心发育不良综合征（HLHS）的发病过程。本文详细记录了一种in ovo LAL的操作方案。简要而言，受精后的鸟类胚胎通常在37.5 °C、60%恒定湿度条件下孵育，直至达到Hamburger-Hamilton（HH）20至21期。随后打开蛋壳，去除外层和内层膜结构，轻柔旋转胚胎以暴露共同心房的左心房膨大部位。将预先制备好的10-0尼龙缝合线微结轻轻放置并结扎于左心房芽体周围。最后将胚胎恢复至原始位置，完成左心房结扎操作。正常组与实施LAL处理的心室在组织致密化程度上表现出统计学显著差异。建立高效的LAL模型构建流程，将有助于开展针对胚胎心血管组分发育过程中力学与遗传因素协同调控的研究。同时，该模型也可为组织培养研究及血管生物学提供受扰动的细胞来源。

引言

先天性心脏病（CHDs）是由于胚胎发育异常而导致的结构畸形¹。除了遗传因素外，其发病机制还受到机械负荷改变的影响^2,3。左心发育不全综合征（HLHS）是一种先天性心脏病，出生时表现为左心室/主动脉发育不良⁴，且死亡率较高^5,6。尽管近年来在临床管理方面取得了进展，但HLHS的血管生长与发育动态仍不明确⁷。在正常的胚胎发育过程中，随着早期胚胎心管的形成，左心室（LV）的内膜和心肌层来源于心脏前体细胞。已有研究报道，心肌逐渐出现小梁化、层次增厚以及心肌细胞增殖的现象²。对于HLHS，可观察到小梁重塑异常及左心室变平，这些进一步因心肌细胞迁移异常而导致心肌发育不全^2,8,9,10

在广泛用于研究心脏发育和理解血流动力学条件的模式生物中¹¹，由于鸟类胚胎具有四腔室的成熟心脏且易于培养，因此更受青睐^11,12,13,14另一方面，斑马鱼胚胎以及转基因/基因敲除小鼠的先进成像技术具有显著优势^11,12已针对禽类胚胎测试了多种机械干预方法，以改变发育中心血管结构的管壁压力和壁面剪切应力。这些模型包括左卵黄囊静脉结扎和动脉干束带法。¹⁵和左心房结扎（LAL）^11,12,16手术干预后约24-48小时，在关注早期预后的研究中即可观察到因机械负荷改变所致的表型变化^11,13LAL干预是一种通过在房室口周围放置缝合环来缩小左心房（LA）功能容积的常用技术。类似地，也有针对右心房结扎（RAL）的显微外科干预已开展。^17,18同样，一些研究人员使用微型夹夹闭左心耳（LAA），以减少左心房的容积^19,20在某些研究中，将外科尼龙线应用于房室结^19,21其中一种干预方法是左心室动脉结扎（LAL），该方法可模拟左心发育不全综合征（HLHS），但也是操作难度最大的模型，由于需要极其精细的显微外科手术，样本获取率非常低。在我们的实验室中，LAL操作如下进行 在卵内 在Hamburger-Hamilton（HH）20至21期之间，于共同心房完全分隔之前^6,14,22,23在LA周围放置外科缝线，以改变心内血流方向。在HLHS的LAL模型中，可观察到心室壁硬度增加、心肌纤维角度改变以及LV心腔尺寸减小。^14,24.

在本视频文章中，我们详细介绍了一种方案和方法 在卵内 LAL 操作步骤如下：首先对受精的禽类胚胎进行孵育以备显微手术，随后打开蛋壳并清除外层和内层膜。然后缓慢旋转胚胎，使左心房（LA）暴露可及。使用10-0尼龙外科缝线结扎心房芽，再将胚胎恢复至原始位置，完成LAL手术。²⁵比较LAL与正常脑室的组织致密程度及脑室容积 通过 光学相干断层扫描和基础组织学

如文中所述，成功实施的LAL模型流程将有助于以心血管系统胚胎发育为核心的基础研究。该模型还可与基因操作技术及先进成像方法联合使用。同样，急性LAL模型可为组织培养实验提供稳定的病变血管细胞来源。

方案

从可靠的供应商处获取受精的白来航鸡鸡蛋，并按照经大学批准的指南进行孵化。根据欧盟指令2010/63/EU以及美国机构动物护理与使用委员会（IACUC）指南，本论文所涉及的鸡胚发育阶段（第18阶段（第3天）至第24阶段（第4天））不被视为活体脊椎动物。鸡胚被视为 "活体动物" 根据美国法律，孵化第19天后不得进行相关操作，但欧盟无此限制。每个鸡蛋均标记有开始孵化的日期，并计划最迟不超过第10天孵化^th 孵育当天。鸡蛋孵化后，将雏鸡从孵育箱中取出。该实验方案在两个台式操作站（操作站1和操作站2）中进行，分别专注于特定模型构建的不同阶段。

1. 显微手术前的准备

1. 从具有无特定病原体（SPF）等级的疫苗研发中心，或通过可靠的商业供应商农场，使用干式聚苯乙烯容器经易碎品快递运输获取受精卵。在孵化前，用浸有70%乙醇的无绒布轻轻擦拭蛋壳，以去除污染。
2. 胚胎纳入/排除标准
   1. 运输过程中出现裂纹或破损的鸡蛋不得进行孵化。
   2. 若在LAL操作过程中或重新孵化后观察到出血现象，则不应使用该胚胎。
   3. 不应使用以左侧朝上位置发育的胚胎，因其血流动力学可能与正常方位不同。
   4. 在术前和术后均应剔除存在先天性缺陷的胚胎。
   5. 应纳入在原始位置发育并达到目标阶段、可模拟左心发育不全综合征（HLHS）的LAL模型胚胎。
3. 将白来航鸡受精蛋（Gallus gallus domesticus L.）钝端朝上放入孵育器，孵育至目标阶段，通常为HH20-21¹⁵阶段（37.5 °C，60%湿度，3.5天）（图1）。
   注：保持恒定的温度和湿度对提高孵化率至关重要。根据孵育器型号，可在内部放置盛有蒸馏水的托盘以维持稳定的湿度。作者已设计出适用于大多数孵育器的附加/辅助温湿度控制系统蓝图，并推荐使用。该自制传感器/控制单元的电子元件、硬件及代码详情已存入数据仓库²⁶。在孵育期间对鸡蛋进行持续轻柔振荡（旋转），有助于胚胎处于最佳位置，从而提高"可手术"胚胎的比例。若孵育器具备此功能，振荡还可进一步提升工作效率。
4. 在开始操作前，预先制备所需数量的结扎结：取一段1.5 cm长的10-0缝合线，打一个松散的单结。确保结扎结不过紧，且体积足够大，以便在手术中能轻松套住心房（图2）。
   注：应提前打好结扎结，并在使用前保存于无菌的鸡林格液中。打结操作需双手同步使用镊子完成。由于这是本方案中的关键步骤，建议使用橡皮泥制作心房模型进行练习（图3），以提升在2号工作站执行步骤3.2.3所需的三维显微外科操作技能（图4）。

2. 1号站操作（图4A）

1. 从鸡蛋的钝端开口，并移除外层和内层膜¹⁵ (图 5A-D).
2. 用镊子的反向末端轻轻敲击蛋壳使其裂开，同时用空着的手指牢固支撑鸡蛋，以减少不必要的裂纹扩展。
3. 由于LAL操作耗时较长，需保持胚胎的温度和湿度，因为心率受温度影响。因此，应尽量缩小初次开窗的壳膜面积，仅需足够完成操作即可。
   注意：操作过程中未使用湿度或温度控制系统，但若具备此类系统，将有助于提高产量。如条件允许，应关闭实验室的空调系统，并在尽可能高的室温（RT）下进行操作。建议在操作期间优化胚胎心率，而心率可通过温度进行调控。部分实验室将心率维持在略低于120次/分钟的水平 通过 LAL 操作过程中的温度控制。因此，在手术区域周围采用湿度控制可进一步提高实验成功率。蛋壳开窗应尽可能小，仅需足够手术操作即可。这一原则同样适用于外层厚膜，其开窗通常仅比胚胎周长略小。这些措施有助于维持胚胎的温度和湿度。从蛋的钝端开窗时，需清除细小的蛋壳碎片，以避免损伤卵黄囊血管的完整性或产生不必要的假象。此外，其他实验室常使用带微锯齿的弯头显微剪进行开窗。也可使用两条宽度适宜的透明胶带固定蛋壳，以控制裂纹扩展。
4. 使用显微剪仅去除必要的卵黄膜（补充视频 1).
5. 正常胚胎发育为腹侧朝上。一旦胚胎脱离卵黄膜，将镊尖闭合的镊子置于胚胎背侧段下方，轻轻翻转胚胎以暴露其左侧（即左侧朝上构型）。图6A，B; 补充视频 2).
6. 确保左心房芽体现已暴露，但仍被一层复杂的膜系统覆盖，该膜系统通常由心包的双层结构组成。
7. 去除心房芽周围包括细膜在内的所有膜组织。这是另一个关键步骤；应先从粗膜开始去除，逐步过渡到左心房芽周围的细膜。使用最精细的镊子来去除细膜补充视频 3).
8. 在去除膜的过程中，将胚胎调整为左侧朝上的位置，以便在步骤3.2中进行打结操作时无需再次调整胚胎方位。为实现此操作，在步骤2.6中利用膜将胚胎提起，并悬挂在蛋壳上，确保胚胎左侧朝上。
   ​注意：部分胚胎可能位于蛋壳边缘附近，操作难度较大。尽管如此，这些胚胎通常仍保持正常朝上方向并表现出正常行为，因此可纳入研究。若需要，可使用#4精细镊子轻轻清理心包膜，并反向（朝向蛋壳开口方向）移除部分蛋壳，以更清楚地暴露被遮挡的心房。此外，也可利用部分胚外膜将此类胚胎轻轻提起，并通过将膜的一端（镊子夹持端）利用其天然黏性固定于蛋壳上，以调整至理想位置。同时，可借助镊子扩大胚胎头部与脊髓区域之间的空间，以暴露被遮挡的心房。

2号工作站操作（图4B）

1. 在体视显微镜下，将步骤1.4中预先制备好的结放置到位。 靠近胚胎的可及位置（图6B）。心房芽现已准备就绪，可以结扎（补充视频 4).
2. 取出预先准备好的开放结，并将其置于左心房芽上方。为了使左心房环化（LAL）成功，需将卵置于一种独特倾斜的三维方向。
   1. 正确调整结的方向，以便在不损伤胚胎的情况下完成收紧过程。
   2. 在步骤 2.7 中彻底清除细膜，以减少心跳搏动的影响。
   3. 收紧缝线（图6C）。此步骤中，使用橡皮泥进行练习非常有帮助。对于假手术组胚胎，打结时只需足够收紧以固定结即可。
3. 接下来，使用显微剪刀将缝线多余的末端尽可能靠近芽体处剪除。补充视频 5).
4. 务必小心，确保打结后缝线新剪断的末端在旋转过程中或由于心跳影响，不会刺破附近的血管。
5. 使用镊子移除在步骤 3.3 中剪下的多余缝线碎片。
6. 最后，使用闭合的镊子将胚胎放回其原始位置，如步骤2.5所述。 (补充视频 6).
7. 完成LAL过程后，用双层封口膜覆盖鸡蛋，再次孵育。确保鸡蛋封闭严密且无菌，这对胚胎存活至关重要，尤其是在孵育超过24小时后。若需观察，可使用石蜡密封并加盖盖玻片。
   注意：研究早期胚胎阶段时，通常将鸡蛋孵化24-48小时，直至达到约HH25或HH27期。然而，并无严格限制，其他研究者亦曾尝试研究更晚的发育阶段。为提高手术操作速度，建议至少由两人组成团队协作完成。其中一人应接受专门训练，负责开蛋、初步膜组织清理、胚胎旋转以及左心房芽周围膜组织的清除。另一人则专门负责结的初步制备、结的放置及收紧。最终的胚胎旋转可由第一人完成。单个胚胎的手术操作时间约为4-5分钟。
8. 手术前后，使用乙醇清洁台面和器械。确保使用新鲜的鸡林格氏液（NaCl, KCl, CaCl₂）₂，和 NaHCO₃₃)^16,27 避免金属器械接触胚胎组织。

结果

可采用先进的时间分辨成像技术，观察因LAL干预引起的结构和形态学变化¹⁰。此外，LAL样本也适用于多种分子与生物学方法^19,28。表1中列出了采用LAL模型结果的一些研究实例。在此背景下，LAL干预操作在发育至HH20-21期的鸡胚中进行。在HH25-26期时，分别从鸡胚中取出对照组（健康）和LAL处理组的心脏样本，并在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）固定^6,15。取出的心脏样本随后依次在浓度递增的乙醇溶液（70%、96%和100%）中各脱水1小时。最后，样本在室温下置于二甲苯中处理0.5小时，随后进行石蜡包埋，并切片至10 µm厚度。转移至载玻片的样本使用Elastica van Gieson染色法染色。在体视显微镜下观察切片，并测量心室的横径。我们还在部分样本中采用了三维非侵入性成像方法——光学相干断层扫描（OCT...

讨论

在左心发育不全综合征中，由于结构缺陷导致血流改变，引起左侧心脏形态异常^4,6该模型提供了一个实用的实验体系，有助于更好地理解左心发育不全综合征（HLHS）的进展过程，甚至可能模拟其发病机制。⁸然而，建立一个完全具有临床等效性的左心发育不全综合征（HLHS）动物模型是一项具有挑战性的任务。除了本文介绍的鸟类LAL模型外，近期在小鼠、胎羊和青蛙中的研究也尝试复制HLHS的形态学、血流动力学及病理生理学特征。在小鼠胚胎中，机械负荷被改变 通过 一种栓塞剂，在胚胎第14.5天（ED 14.5，相当于鸡胚HH40-41期）通过胎儿介入手段注入左心房（LA）³⁴共有48%的胎儿在成功栓塞后存活至妊娠晚期，表现为左心室较小及主动脉逆向血流。较长的妊娠周期、早期干预的技术难度以及复杂的胎儿手术可能限制该模型的可行性。此外，通过球囊导管向左心房注入硅橡胶，已在胎羊模型中成功模拟出左心室发育不全。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-0 尼龙外科缝线	Ethicon
Elastica van Gieson 染色试剂盒	Sigma-Aldrich	115974	用于组织学切片中结缔组织的染色
无水乙醇	Interlab	64-17-5	消毒步骤中，通过将无水乙醇用蒸馏水稀释配制 70% 乙醇
培养箱	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
吸水纸（Kimwipes）	Interlab	080.65.002
显微剪刀	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M 封口膜	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	用于卵再培养时的密封步骤
Paraplast 包埋介质（块状）	Leica Biosystems	39602012	组织包埋介质
体视显微镜	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	用于 1 号操作台
体视显微镜	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	用于 2 号操作台
镊子（Dumont 4 INOX #F4）	Adumont & Fils, Switzerland		用于将胚胎放回原位
镊子（超细 Dumont #5SF）	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	用于去除胚胎上的膜结构