左心房结扎在鸟类胚胎中作为早期血管发育期间改变血流动力学负荷的模型

摘要

本文介绍了一种在鸟类胚胎中实施左心房结扎（LAL）模型的详细可视化操作流程。LAL模型可改变心脏内的血流，从而改变壁面剪切应力负荷，模拟发育不全性左心发育不良综合征。本文提供了一种克服该复杂显微外科模型操作难点的技术方法。

摘要

由于鸟类胚胎具有四腔室的成熟心室结构，且易于培养、成像观察和操作高效，因此成为研究心血管发育的首选脊椎动物模型。该模型被广泛应用于探索正常心脏发育过程及先天性心脏病预后的相关研究。通过引入显微外科技术，可在特定胚胎发育时期改变其正常的机械负荷模式，并追踪下游的分子与遗传级联反应。最常见的机械干预方法包括左卵黄静脉结扎、动脉球束带术以及左心房结扎（LAL），这些操作可通过改变血流来调节血管壁内的压力和壁面剪切应力。in ovo条件下实施的LAL尤其具有挑战性，因其需要极其精细的连续显微手术操作，导致样本获得率极低。尽管如此，in ovo LAL在科学上具有重要价值，因为它能够模拟临床上与人类新生儿相关的复杂先天性心脏病——左心发育不良综合征（HLHS）的发病过程。本文详细记录了一种in ovo LAL的操作方案。简要而言，受精后的鸟类胚胎通常在37.5 °C、60%恒定湿度条件下孵育，直至达到Hamburger-Hamilton（HH）20至21期。随后打开蛋壳，去除外层和内层膜结构，轻柔旋转胚胎以暴露共同心房的左心房膨大部位。将预先制备好的10-0尼龙缝合线微结轻轻放置并结扎于左心房芽体周围。最后将胚胎恢复至原始位置，完成左心房结扎操作。正常组与实施LAL处理的心室在组织致密化程度上表现出统计学显著差异。建立高效的LAL模型构建流程，将有助于开展针对胚胎心血管组分发育过程中力学与遗传因素协同调控的研究。同时，该模型也可为组织培养研究及血管生物学提供受扰动的细胞来源。

引言

先天性心脏病（CHDs）是由于胚胎发育异常而导致的结构畸形¹。除了遗传因素外，其发病机制还受到机械负荷改变的影响^2,3。左心发育不全综合征（HLHS）是一种先天性心脏病，出生时表现为左心室/主动脉发育不良⁴，且死亡率较高^5,6。尽管近年来在临床管理方面取得了进展，但HLHS的血管生长与发育动态仍不明确⁷。在正常的胚胎发育过程中，随着早期胚胎心管的形成，左心室（LV）的内膜和心肌层来源于心脏前体细胞。已有研究报道，心肌逐渐出现小梁化、层次增厚以及心肌细胞增殖的现象²。对于HLHS，可观察到小梁重塑异常及左心室变平，这些进一步因心肌细胞迁移异常而导致心肌发育不全^2,8,9,10

在广泛用于研究心脏发育和理解....

方案

从可靠的供应商处获取受精的白来航鸡鸡蛋，并按照经大学批准的指南进行孵化。根据欧盟指令2010/63/EU以及美国机构动物护理与使用委员会（IACUC）指南，本论文所涉及的鸡胚发育阶段（第18阶段（第3天）至第24阶段（第4天））不被视为活体脊椎动物。鸡胚被视为 "活体动物" 根据美国法律，孵化第19天后不得进行相关操作，但欧盟无此限制。每个鸡蛋均标记有开始孵化的日期，并计划最迟不超过第10天孵化^th 孵育当天。鸡蛋孵化后，将雏鸡从孵育箱中取出。该实验方案在两个台式操作站（操作站1和操作站2）中进行，分别专注于特定模型构建的不同阶段。

1. 显微手术前的准备

1. 从具有无特定病原体（SPF）等级的疫苗研发中心，或通过可靠的商业供应商农场，使用干式聚苯乙烯容器经易碎品快递运输获取受精卵。在孵化前，用浸有70%乙醇的无绒布轻轻擦拭蛋壳，以去除污染。
2. 胚胎纳入/排除标准
   1. 运输过程中出现裂纹或破损的鸡蛋不得进行孵化。
   2. 若在LAL操作过程中或重新孵化后观察到出血现象，则不应使用该胚胎。
   3. 不应使用以左侧朝上位置发育的胚胎，因其血流动力学可能与正常方位不同。
   4. 在术前和术后均应剔除存在先天性缺陷的胚胎。
   5. 应纳入在原始位置发育并达到目标阶段、可模拟左心发育不全综合征（HLHS....

结果

可采用先进的时间分辨成像技术，观察因LAL干预引起的结构和形态学变化¹⁰。此外，LAL样本也适用于多种分子与生物学方法^19,28。表1中列出了采用LAL模型结果的一些研究实例。在此背景下，LAL干预操作在发育至HH20-21期的鸡胚中进行。在HH25-26期时，分别从鸡胚中取出对照组（健康）和LAL处理组的心脏样本，并在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）固定^6,15。取出的心脏样本随后依次在浓度递增的乙醇溶液（70%、96%和100%）中各脱水1小时。最后，样本在室温下置于二甲苯中处理0.5小时，随后进行石蜡包埋，并切片至10 µm厚度。转移至载玻片的样本使用Elastica van Gieson染色法染色。在体视显微镜下观察切片，并测量心室的横径。我们还在部分样本中采用了三维非侵入性成像方法——光学相干断层扫描（OCT.......

讨论

在左心发育不全综合征中，由于结构缺陷导致血流改变，引起左侧心脏形态异常^4,6该模型提供了一个实用的实验体系，有助于更好地理解左心发育不全综合征（HLHS）的进展过程，甚至可能模拟其发病机制。⁸然而，建立一个完全具有临床等效性的左心发育不全综合征（HLHS）动物模型是一项具有挑战性的任务。除了本文介绍的鸟类LAL模型外，近期在小鼠、胎羊和青蛙中的研究也尝试复制HLHS的形态学、血流动力学及病理生理学特征。在小鼠胚胎中，机械负荷被改变 通过 一种栓塞剂，在胚胎第14.5天（ED 14.5，相当于鸡胚HH40-41期）通过胎儿介入手段注入左心房（LA）³⁴共有48%的胎儿在成功栓塞后存活至妊娠晚期，表现为左心室较小及主动脉逆向血流。较长的妊娠周期、早期干预的技术难度以及复杂的胎儿手术可能限制该模型的可行性。此外，通过球囊导管向左心房注入硅橡胶，已在胎羊模型中成功模拟出左心室发育不全。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-0 尼龙外科缝线	Ethicon
Elastica van Gieson 染色试剂盒	Sigma-Aldrich	115974	用于组织学切片中结缔组织的染色
无水乙醇	Interlab	64-17-5	消毒步骤中，通过将无水乙醇用蒸馏水稀释配制 70% 乙醇
培养箱	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
吸水纸（Kimwipes）	Interlab	080.65.002
显微剪刀	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M 封口膜	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	用于卵再培养时的密封步骤
Paraplast 包埋介质（块状）	Leica Biosystems	39602012	组织包埋介质
体视显微镜	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	用于 1 号操作台
体视显微镜	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	用于 2 号操作台
镊子（Dumont 4 INOX #F4）	Adumont & Fils, Switzerland		用于将胚胎放回原位
镊子（超细 Dumont #5SF）	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	用于去除胚胎上的膜结构