小鼠心脏骤停模型用于缺血及复苏期间的脑成像与脑生理监测

摘要

本方案展示了一种独特的窒息性心脏骤停小鼠模型，该模型在复苏过程中无需胸外按压。该模型可用于监测和成像心脏骤停及复苏期间脑生理学的动态变化。

摘要

大多数心脏骤停（CA）幸存者会出现不同程度的神经功能缺损。为了阐明CA所致脑损伤的潜在机制，并进一步开发有效的治疗方法，开展实验性CA研究至关重要。为此，目前已建立了一些小鼠CA模型。在大多数模型中，小鼠需保持仰卧位，以便实施胸外按压进行心肺复苏（CPR）。然而，这种复苏操作使得在CA及复苏期间对脑生理学进行实时成像或监测变得困难。为了获取此类关键信息，本方案介绍了一种无需胸外按压CPR步骤的小鼠窒息性CA模型。该模型可用于研究从CA前基线状态到CA后早期再灌注阶段脑血流、血管结构、电位活动以及脑组织氧合的动态变化。尤为重要的是，该模型适用于老年小鼠。因此，这一小鼠CA模型有望成为解析CA对脑生理影响的关键工具。

引言

心脏骤停（CA）仍然是全球公共卫生领域的重大危机¹。仅在美国，每年就报告超过35.6万例院外和29万例院内心脏骤停病例，且大多数心脏骤停患者年龄超过60岁。值得注意的是，幸存者中普遍存在心脏骤停后神经系统功能障碍，这对心脏骤停的临床管理构成了主要挑战^2,3,4,5。为了理解心脏骤停后脑部的病理变化及其对神经功能预后的影响，已在患者中应用了多种神经生理监测和脑组织监测技术^{6,7,8,9,10,11,12}。利用近红外光谱技术，已在心脏骤停大鼠模型中开展实时脑部监测，以预测其神经功能预后¹³。

然而，在小鼠心脏骤停（CA）模型中，由于需要进行胸外按压以恢复自主循环，这一过程总会伴随显著的躯体运动，从而阻碍精细的成像操作，使得此类成像方法的应用变得复杂。此外，CA模型通常在小鼠仰卧位下进行，而许多脑成像技术则要求将小鼠转为俯卧位。因此，在许多情况下，需要建立一种在手术过程中体动最小化的小鼠模型，以便在整个CA过程中（从CA前到复苏后）实现对大脑的实时成像与监测。

此前，Zhang 等人报道了一种可用于脑成像的小鼠心脏骤停（CA）模型¹⁴。在该模型中，通过推注维库溴铵和艾司洛尔，随后停止机械通气来诱导心脏骤停。他们表明，在心脏骤停5分钟后，可通过输注复苏混合液实现复苏。然而值得注意的是，在该模型中，循环停止仅在艾司洛尔注射后约10秒内发生。因此，该模型无法重现患者窒息性心脏骤停的进展过程，包括停搏前期的高碳酸血症和组织缺氧。

本手术操作的总体目标是建立一种模拟临床窒息性心脏骤停的小鼠模型，并在无胸外按压的情况下进行复苏。因此，该心脏骤停模型可用于复杂成像技术，以研究小鼠脑生理学¹⁵。

方案

本研究中所述所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的指南进行，并经杜克大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。本研究采用8至10周龄的C57BL/6雄性和雌性 小鼠。

1. 手术准备

1. 使用电子天平称量小鼠体重，并将其放入一个 4 英寸 × 4 英寸 × 7 英寸的亚克力麻醉诱导箱中。
2. 将麻醉蒸发器调节至 5% 异氟烷，氧气流量计调节至 30，氮气流量计调节至 70（参见材料表）。
3. 当小鼠呼吸频率降至每分钟 30–40 次时，将其从诱导箱中取出，并仰卧置于手术台上。
4. 用钝头镊子拉出舌头，并用非优势手固定。使用优势 手持喉镜（参见材料表）插入小鼠口腔，观察声带。
5. 用非优势 手将导丝和 20 G 静脉导管插入口腔，轻柔地将导丝插入气管。
6. 将导管推入气管，直至导管的翼状部分与鼻尖齐平。
   注意：切勿对未完全麻醉的小鼠进行插管，以免损伤气管并导致气道出血。
7. 将插管后的小鼠连接至小型动物呼吸机（参见材料表），并将异氟烷浓度降低至 1.5%。
8. 将小鼠体重输入呼吸机控制面板，以确定潮气量和呼吸频率。
9. 将小鼠仰卧置于加热灯下，并使用温度控制器维持直肠温度在 37 °C。
10. 剃除腹股沟区域毛发，使用碘伏和酒精对手术区域至少消毒三次 （参见材料表）， 并用无菌手术巾覆盖该区域。
11. 术前在双眼涂抹眼膏，并皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。
12. 打开无菌手术器械包。使用手术剪做一长约 1 cm 的皮肤切口，暴露双侧股动脉。用单股 4-0 丝线结扎远端股动脉（参见 材料表），并在局部滴加一滴利多卡因。
13. 在近端股动脉放置动脉瘤夹 ，并在夹子远端的动脉上做一小切口。将聚乙烯 10（PE-10，参见材料表）导管分别插入左侧和右侧股动脉。
    注意：左侧动脉导管用于血压监测，右侧导管用于采血及复苏液输注。
14. 向每条动脉导管内注入 50 µL 1:10 肝素化生理盐水，以防止导管内凝血。
15. 将小鼠转为俯卧位，并固定于立体定位仪头架上。
16. 将三个针状电极（红色、绿色和黑色）分别连接至左前肢、左后肢和右前肢，用于心电图（ECG，参见材料表）监测。
17. 通过一个 0.5 cm 的皮肤切口，将柔性塑料光纤探头粘附于完整的颞骨颅骨上，用于监测脑血流。此步骤为可选操作。
18. 剃除头部顶部毛发， 使用碘伏和酒精对手术区域至少消毒三次，并用无菌手术巾覆盖该区域。
19. 做一条长约 2.5 cm 的正中皮肤切口，使用四个小型牵开器暴露整个颅骨表面，以便进行脑成像。
20. 将监测成像仪（例如激光散斑对比成像仪，参见材料表）置于头部上方。
    注意：可在颅骨表面滴加数滴生理盐水，以利于激光散斑对比成像。

2. 诱导心脏停搏

1. 用1 mL塑料注射器吸取26 µL复苏混合液原液。
   注意：每毫升该溶液包含 400 µL 的 1 mg/mL 肾上腺素、500 µL 的 8.4% 碳酸氢钠、50 µL 的 1,000 U/mL 肝素和 50 µL 的 0.9% 氯化钠（参见 材料表).
2. 待体温升至37 °C后，将氧浓度调节至100%，持续氧合血液2分钟。
3. 抽出含氧动脉血至多 200 µL 通过 将右股动脉插入已备好的塑料注射器中，注射器内含26 µL复苏鸡尾酒储备液。
4. 关闭氧气，将氮气调至100%以诱导缺氧环境。
   注意：大约45秒后，心脏将失去功能，心率迅速下降，提示心脏骤停（CA）的发生。约2分钟缺氧后，心电图监测将显示心电静止，此时无法测得全身血压，脑血流量亦可忽略不计。
5. 关闭呼吸机、异氟烷挥发罐、温度控制器和氮气流量计。将氧气调节至100%，以备复苏使用。

3. 复苏操作步骤

1. 在心脏骤停发生后8分钟开启呼吸机。
2. 立即开始将抽出的含复苏鸡尾酒的氧合血液注入血液循环中 通过 1分钟内右侧股动脉
   注意：输注会导致心率逐渐增加并恢复血液灌注；最终实现自主循环恢复（ROSC）。

4. 心脏骤停后复苏

1. 将小鼠从立体定位仪中取出后，置于仰卧位，并移除 股动脉中的PE-10导管。
2. 将0.25%布比卡因应用于皮肤切口，并使用6-0尼龙缝线缝合皮肤切口（参见 材料表）。将抗生素软膏涂抹于皮肤切口表面。
3. 当自主呼吸恢复后，断开小鼠呼吸机。
4. 将小鼠转移至温度控制在32 °C的恢复室中。
5. 恢复2小时后，拔除小鼠气管插管，并将其放回饲养笼。皮下注射0.5 mL生理盐水以防止脱水。

结果

为诱导心脏骤停（CA），小鼠使用1.5%异氟烷麻醉，并通入100%氮气进行通气。该条件下，小鼠在45秒内出现严重的心动过缓（图1）。在缺氧2分钟后，心率显著下降（图2），血压降低至20 mmHg以下，脑血流完全停止（图1）。当停止异氟烷供应后，体温不再受控，逐渐下降，至CA结束时约为32 °C（图1）。

心脏骤停8分钟后立即启动呼吸机，并为小鼠提供100%氧气。通过动脉导管将血液复苏混合液注入循环系统。via 注入血液复苏混合液后不久，心脏功能开始恢复。经过短暂间隔后，全身和脑部血流恢复，自主循环恢复（ROSC）得以建立。在我们实验室中，ROSC的成功率接近100%。该模型已在年轻和老年小鼠中成功实施。

基于此模型，本研究采用了两种成像方式，包括激光散斑对比成像（LSCI）...

讨论

在实验性心脏骤停（CA）研究中，曾采用窒息、氯化钾注射或电流诱导的心室颤动等方法来诱发CA^{16,17,18,19,20,21,22,23}。通常情况下，这些CA模型（尤其是小鼠模型）需要心肺复苏（CPR）进行抢救。我们已配制出一种复苏混合物，可在小鼠窒息性CA后实现自主复苏。省去CPR步骤为利用现有成像技术在CA及复苏期间监测脑生理活动提供了更多机会。

这种复苏鸡尾酒储备液包含碳酸氢钠、肝素、氧合动脉血和肾上腺素。众所周知，心脏骤停（CA）可同时引发代谢性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肾上腺素	Par制药	NDC 42023-159-01
酒精棉片	BD	326895
动物生物放大器	ADInstruments	FE232
血压换能器	ADInstruments	MLT0699
桥式放大器	ADInstruments	FE117
肝素钠注射液，USP	Fresenius Kabi	NDC 63323-540-05
异氟烷	Covetrus	NDC 11695-6777-2
激光多普勒血流监测仪	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
激光散斑成像系统	真实世界数据	RFLSI III
润滑性眼膏	博士伦	339081
微型夹子	Roboz	RS-5431
小鼠直肠探针	Physitemp	RET-3
针电极	ADInstruments	MLA1213	29 号针头，1.5 毫米套管
氮	Airgas	UN1066
光学塑料光纤	Moor Instruments	POF500
耳镜	韦尔查林	728	2.5 mm 阴道窥器
氧气	Airgas	UN1072
PE-10 导管	BD	427401	聚乙烯管
聚维酮碘	绒毛膜绒毛取样术	955338
PowerLab 8/35	ADInstruments
瑞马度（卡洛芬）	硕腾	6100701	可注射用 50 mg/ml
小型动物呼吸机	Kent Scientific	RoVent Jr.
温度控制器	Physitemp	TCAT-2DF
三联抗生素 &镇痛与疼痛缓解	绒毛膜绒毛取样术	NDC 59770-823-56
蒸发器	真实世界数据	R583S
0.25% 布比卡因	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% 氯化钠	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
1 mL 塑料注射器	BD	309659
4-0 丝线缝合线	看	SP116	黑色编织丝绸
6-0 尼龙缝线	Ethilon	1698G
8.4% 碳酸氢钠注射液，USP	Hospira	NDC 0409-6625-02
20 G IV 导管	BD	381534	20GA 1.6 英寸
30 G PrecisionGlide 针头	BD	305106	30 G × 1/2