一种改良的经颅大脑中动脉阻塞模型用于研究老年小鼠的中风结局

摘要

本方案展示了一种具有中等大小梗死灶且存活率极佳的独特小鼠卒中模型。该模型可使临床前卒中研究者延长缺血时间、使用老龄小鼠，并评估长期功能学结果。

摘要

在实验性脑卒中研究中，通过血管内细丝阻塞大脑中动脉（MCAO）被广泛用于建立小鼠缺血性脑卒中模型。在C57Bl/6小鼠中，细丝法MCAO模型通常引起大面积脑梗死，有时甚至累及大脑后动脉供血区域的脑组织，这主要归因于后交通动脉闭锁的发生率较高。这一现象被认为是C57Bl/6小鼠在细丝法MCAO后长期脑卒中恢复过程中死亡率较高的主要原因。因此，许多慢性脑卒中研究采用远端MCAO模型。然而，这些模型通常仅在皮层区域产生梗死，因而对脑卒中后神经功能缺损的评估可能具有挑战性。本研究建立了一种改良的经颅MCAO模型，通过一个小的颅窗对大脑中动脉主干进行永久性或短暂性部分阻塞。via该方法。由于阻塞部位相对接近大脑中动脉的起始处，该模型可在皮层和纹状体均引起脑损伤。对该模型的系统表征表明，即使在老年小鼠中也具有极佳的长期生存率，并且神经功能缺损易于检测。因此，本文所述的MCAO小鼠模型为实验性脑卒中研究提供了一个有价值的工具。

引言

每年，美国约有80万人遭受中风，其中大多数为缺血性中风¹。目前，对中风患者最有效的治疗方法是及时使用组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和/或进行血栓切除术以恢复脑血流；然而，患者长期神经功能的完全恢复仍然十分罕见^2,3。因此，寻找以功能改善为目标的新型中风疗法成为研究热点，这需要采用与临床相关的中风动物模型。

在啮齿类动物中，最常见的缺血性脑卒中模型是通过血管内闭塞大脑中动脉（MCAO）来诱导脑卒中。该模型最初由Zea Longa于1989年建立，其方法是将一根尼龙线插入颈内动脉（ICA），以阻断大脑中动脉（MCA）的血流⁴。然而，该模型存在一些局限性。首先，当尼龙线插入ICA时，可能会同时部分阻断大脑后动脉（PCA）的血流，尤其是在小鼠中。关键在于，连接大脑前循环与后循环的小血管——后交通动脉（PcomA）——在某些小鼠品系（如实验性脑卒中研究中最常用的C57Bl/6品系）中常常发育不全。PcomA的通畅性被认为会影响脑卒中后小鼠脑梗死体积的变异性⁵。事实上，当MCAO期间PCA血流急剧下降，而PcomA无法提供足够的侧支血流时，脑梗死区域可能扩展至PCA供血区域。此外，在该模型中，长时间的缺血会导致小鼠死亡率升高。因此....

方案

本研究中描述的所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于科研中动物护理与使用的指南，并已获得杜克大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。本研究使用了年轻的（8-10周龄）和老龄的（22月龄）雄性C57Bl/6小鼠。该方案的总体流程如图1所示。

1. 手术准备

1. 检查小鼠是否存在明显的异常和行为缺陷。
   注意：手术前，外科医生必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括外科口罩、帽子、手套和手术服。
2. 称量小鼠体重；根据体重设定呼吸机（见材料表）参数。
3. 将小鼠放入一个 4 英寸 × 4 英寸 × 7 英寸的麻醉诱导箱中。打开氧气流量计（见材料表），设定为 30，同时打开一氧化二氮流量计，设定为 70。开启蒸发器，异氟烷浓度设为 5%。
4. 将导丝插入 20 G 静脉（IV）导管中。
5. 当小鼠呼吸频率降至每分钟 30–40 次时，将其从诱导箱中取出。
6. 将小鼠仰卧位放置于手术台上。拉出小鼠舌头并用左手手指固定。将喉镜（见材料表）插入动物口腔以观察声带。
7. 用右手的中指固定小鼠下巴于喉镜上，释放左手以持握 20 G 静脉导管。
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结果

在手术显微镜直视下，可直观确认大脑中动脉血流在缺血期间被阻断。我们之前的研究表明 >使用激光多普勒监测仪实现缺血区域80%的血流减少⁶为了确定MCAO后血流变化，可使用LSCI进一步确认缺血损伤及再灌注情况（图1）。事实上，在 图3A，观察到右侧大脑中动脉（MCA）供血区域的血流减少。对于短暂性MCAO，在缝线移除后，脑血流再灌注明显（图3B），并在24小时后进一步改善（图3C）。脑卒中脑组织可在24 h后进行切片并用TTC染色。坏死组织不与TTC发生反应，保持白色（图1）。TTC 染色显示，该模型可在皮层和外侧纹状体区域均产生梗死组织，且与线栓法大脑中动脉阻塞（filament MCAO）相比，梗死体积适中。图4）。该模型已应用.......

讨论

首个经颅大脑中动脉（MCA）阻塞模型于1981年在大鼠中建立^11,12，并于1989年被无开颅MCAO模型所取代⁴。最初的经颅MCA阻塞手术视野较广，需切除整个颧弓并将肌肉向侧方牵拉。术后局部组织出现肿胀，导致动物应激反应及摄食量下降。在我们改良的经颅MCAO模型中，切口创伤更小，仅需切除一小段颧弓。手术视野通过四个小型针式牵开器暴露，未损伤任何血管或神经。由于使用8-0外科缝合针将MCA主干抬起，仅需形成一个小的颅骨窗，且缝合针无需完全穿过MCA下方。术后未观察到局部组织肿胀⁶。

该模型具有多个优点。首先，它产生的梗死区域包含皮层和皮层下区域，因此可方便地评估神经功能缺损。其次，该模型可诱导短暂性和永久性缺血性脑卒中。重要的是，可通过延长缺血时间来模拟晚期再灌注。例如，在我们之前的脑卒中研究中，成功实施了6 h的MCAO⁹.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 布比卡因	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% 氯化钠	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）	Sigma 或任意可获取的供应商
20 G IV 导管	BD	381534	20 GA 1.6 IN
30 G针头	BD	305106
4-0 丝线缝合线	看	SP116	黑色编织丝绸
8-0 缝合线带针	Ethilon	2822G
酒精棉片	BD	326895
麻醉诱导箱	任何合适的供应商		Pexiglass 制作
电动研磨机	JSDA	JD 700
高温电灼环头	Bovie	AA03
异氟烷	Covetrus	NDC 11695-6777-2
激光多普勒血流监测仪	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
润滑性眼膏	博士伦	339081
小鼠直肠探针	Physitemp	RET-3
一氧化二氮	Airgas	UN1070
耳镜	Welchallyn	728	2.5 mm 耳镜用作喉镜以观察小鼠的声带
氧气	Airgas	UN1072
聚维酮碘	绒毛膜绒毛取样术	955338
回收箱	Brinsea	薄层色谱环保法
瑞马度（卡洛芬）	硕腾	6100701	可注射用 50 mg/mL
啮齿类动物呼吸机	Kent Scientific	啮齿类动物 Jr.
温度控制器	Physitemp	TCAT-2DF
三联抗生素 &和镇痛	绒毛膜绒毛取样术	NDC 59770-823-56
蒸发器	真实世界数据	R583S