本方案描述了可用于研究ATG9A生物学的多种方法，包括免疫荧光结合图像分析、瞬时过表达的注意事项，以及利用蛋白质印迹法检测ATG9A糖基化状态。
本文内容
摘要
摘要
自噬是一种高度保守的细胞通路，细胞利用该通路维持内环境稳定、降解受损细胞器、抵御入侵病原体，并在病理条件下存活。一组被称为ATG蛋白的蛋白质构成了自噬核心机制，并以特定的层级顺序协同作用。近年来的研究加深了我们对自噬通路的理解。最近有研究提出，ATG9A囊泡处于自噬过程的核心地位，因其能够调控自噬的快速启动 从头合成 合成一种称为吞噬泡（phagophore）的细胞器。ATG9A 的研究一直具有挑战性，因为 ATG9A 是一种跨膜蛋白，存在于不同的膜区室中。因此，理解其转运过程对于阐明自噬机制至关重要。本文介绍了可用于研究 ATG9A 的详细方法，特别是利用免疫荧光技术对其定位进行检测和定量分析。同时讨论了瞬时过表达可能带来的问题。准确表征 ATG9A 的功能，并标准化其转运分析技术，对于进一步阐明调控自噬起始的分子事件至关重要。
引言
ATG9A 是核心自噬机制中唯一的跨膜蛋白，可在高尔基体与细胞质中的 ATG9A 囊泡区室之间转运，并经过内体区室。1长期以来一直神秘的ATG9A最近被发现具有脂质翻转酶的功能，能够使脂质在膜双层之间达到平衡。2,3目前明确的是，ATG9A 位于自噬体形成层级的顶端，因此对其研究对于理解自噬过程至关重要。4,5因此，ATG9A 小泡最近被提出作为 "种子" 自噬体的6,7然而，先前的研究表明，ATG9A 仅在自噬体成熟的各个阶段短暂地与其相互作用，并不会整合到自噬膜中6,8,9,10,11因此，需要进一步研究以全面揭示ATG9A在自噬体形成中的作用及其潜在的多种功能。然而，当前模型与先前数据之间的差异只能通过有针对性的实验来解决，这些实验需采用经过验证的定量方法和细胞内标记物来研究ATG9A的转运过程。
目前有多种工具用于研究ATG9A，每种工具都有其优缺点，而ATG9A的结构、分子功能以及细胞内转运特性使得这些工具的应用变得复杂2,8,12。ATG9A可形成同源三聚体，具有糖基化修饰，并在细胞内广泛转运至高尔基体、内体及质膜等区室13,14。由于其转运路径复杂，在解释特定处理或刺激（如营养和血清饥饿）下ATG9A从高尔基体分散的现象时面临诸多挑战。ATG9A在囊泡转运方面极为动态；事实上，在饥饿诱导的自噬过程中，含有ATG9A的囊泡已被定义为ATG9A区室。由这些动态囊泡构成的ATG9A区室会短暂地与多种细胞器发生相互作用8,15,16,17。本文所描述的技术，包括免疫荧光、活细胞成像和糖基化检测，将有助于检测并深入理解ATG9A的生物学特性。特别是，本文介绍的方法将有助于解答关于ATG9A定位于特定细胞区室及其与特定蛋白伙伴和/或膜区室相互作用的问题。由于ATG9A的疏水性保守核心结构域（PFAM结构域PF04109）具有独特的拓扑结构，且ATG9A在多个膜区室之间循环，研究人员在瞬时过表达ATG9A时应警惕某些潜在陷阱和人为假象，包括但不限于内质网（ER）滞留。其他可能的问题还包括蛋白错误折叠、在正常培养条件下出现人为聚集，或因免疫荧光实验中通透化步骤不充分而导致囊泡区室信号检测不足。
在对内源性ATG9A进行成像时，必须谨慎进行样品制备和图像采集，以确保后续定量分析的质量以及对数据的正确解读。将本文所述技术与标准生化方法（如免疫共沉淀或未在此描述的pull-down实验）相结合，应有助于加深对ATG9A功能的理解。本实验工具包旨在帮助新进入该领域的研究人员顺利开展确定ATG9A在其生物体系中功能所需的各项检测。
方案
本研究中使用的所有试剂均可商业获取，ATG9A DNA 载体和自制的 STO-215 抗体除外（见材料表），后者可应要求提供。此处描述的分析工具基于开源软件（FIJI/ImageJ）18。
1. 细胞培养
- 在T150组织培养处理过的培养瓶中，使用高糖DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），添加10%胎牛血清（FBS）和4 mM L-谷氨酰胺（见材料表），将HEK293A细胞培养至80%-90%融合度。将细胞置于37 °C、10% CO2的加湿组织培养孵箱中孵育。
注意：本研究使用HEK293A细胞，因其在氨基酸饥饿条件下可产生强烈的经典自噬反应，该反应尤其表现为脂化、膜结合型LC3水平升高1,9,19，且适用于成像分析。 - 使用移液管吸取培养瓶中的培养基进行传代。用15 mL 1× PBS（磷酸盐缓冲液）或类似溶液洗涤细胞一次，然后加入2 mL胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液以解离细胞。用8 mL DMEM收集解离的细胞，并重新接种适量细胞，使实验所述条件下2天后细胞融合度达到80%-90%。
2. ATG9A 的内源性染色
- 将HEK293A细胞（或其他选用细胞）接种于置于24孔板中的无菌1.5号玻璃盖玻片上，使细胞次日融合度约为80%。通常可获得7 x 10⁵4 每孔500 μL DMEM中接种细胞
注意：对于 HEK293A 细胞或其他贴壁性较弱的细胞系，需使用浓度为 0.1 mg/mL 的聚-D-赖氨酸（溶于去离子水）对盖玻片进行包被。加入 500 μL 聚-D-赖氨酸（参见 材料表将盖玻片放入孔板中，于室温（RT）下在盖玻片上表面孵育10分钟，随后用去离子水洗涤三次，最后用DMEM洗涤一次。包被完成后立即进行细胞接种，并确保细胞在培养皿中均匀分布。 - 根据特定实验条件处理细胞（例如，在EBSS [Earle's Balanced Salt Solution] 中饥饿处理2小时）。
注意：EBSS 的成分为 1 g/L D-葡萄糖、6.8 g/L NaCl、0.4 g/L KCl、0.151 g/L CaCl₂2.2H2O，0.2 g/L mM MgSO₄4.7H2O，0.124 g/L NaH2HPO4.2H2O，以及 2.2 g/L NaHCO₃3 （参见 材料表) 溶于蒸馏水中。 - 吸弃培养基，小心加入500 μL含0.1 mM CaCl₂的4%多聚甲醛PBS溶液2 和 0.1 mM MgCl2 在室温下孵育20分钟以固定细胞。
- 吸去每孔中的4%甲醛溶液，替换为500 μL PBS。重复此洗涤步骤三次。切勿让盖玻片干燥或暴露于无液体环境中。
- 使用500 μL 50 mM NH₄Cl溶液淬灭游离醛基4在室温下用 PBS 配制的 Cl 溶液孵育 10 分钟。
- 吸弃 PBS，加入 500 μL 含 50 μg/mL 皂苷的 PBS 溶液（储存液为 1 mg/mL 溶于去离子水，参见 材料表在室温下孵育5分钟，以透化细胞。
- 吸出每孔中的皂苷溶液，加入 500 μL PBS。重复洗涤步骤三次。
- 吸去每孔中的 PBS，加入 500 μL 封闭液（5% BSA [牛血清白蛋白] 溶于 PBS），室温孵育 30 分钟。
- 吸除封闭液，加入 500 μL PBS 替代。
- 使用镊子从孔中取出盖玻片，用细的纸巾或纤维素滤纸小心吸去多余的 PBS 溶液，然后将每张盖玻片细胞面朝下轻轻放置于 50 μL 一抗溶液液滴中（例如，将 Armenian Hamster 14F2 用 1% BSA/PBS 溶液稀释至 0.9 μg/mL，参见 材料表在湿盒中于室温孵育1小时。
注意：为便于操作，可将抗体溶液滴加在自封式热塑性薄膜上（参见 材料表）置于另一个容器内，而非直接放置于固体表面。 - 使用镊子收集盖玻片，用薄纸巾轻轻吸去多余的初级抗体溶液后，将盖玻片（细胞面朝上）放回24孔板中，并用PBS洗涤三次。
- 重复步骤2.10。使用镊子从每个孔中取出盖玻片，用细小的纸巾轻轻吸去多余的PBS，然后将每张盖玻片（细胞面朝下）轻轻放置于50 μL二抗溶液液滴中，该溶液用1% BSA/PBS按1:1,000稀释（例如Cy3标记的山羊抗 Armenian Hamster IgG，其与牛、人、小鼠、兔和大鼠血清蛋白的交叉反应性极低，参见 材料表在湿盒中于室温孵育1小时。
注意：可选：在后续图像分析中，除二抗外还可使用细胞骨架标记物（例如，1:1,000 稀释的 Alexa Fluor 647 Phalloidin，参见 材料表为便于操作，可将抗体溶液滴加在另一容器内的封口膜上，而非直接滴在固体表面。 - 使用镊子收集盖玻片，沥干多余的二抗溶液后，将盖玻片放入24孔板中（细胞面朝上），用500 μL PBS洗涤3次。
- 使用镊子夹取盖玻片，用细小的纸巾轻轻吸去多余的 PBS，然后将每张盖玻片（细胞面朝下）小心地放置于载玻片上含有 50 μL PBS 配制的 1:4,000 Hoechst 溶液（Hoechst 33342）的液滴中。于室温下在湿盒中孵育 5 分钟。
注意：为便于操作，可将抗体溶液滴加在另一容器内的封口膜上，而非直接滴在固体表面。 - 使用镊子取出盖玻片，用细小的擦拭纸轻轻吸去多余的 Hoechst 溶液后，将盖玻片放回 24 孔板中，用 PBS 洗涤三次，再用去离子水洗涤一次（每次 500 μL）。
- 使用薄纸巾小心吸去多余的去离子水，然后将每张盖玻片（细胞面朝下）轻轻放置于 10–20 μL 封片液液滴上（参见 材料表点样至显微镜载玻片用于免疫荧光检测，避免产生气泡。
注意：此处使用的封片剂与浸油的折射率相同，在室温下数小时或4 °C过夜后会硬化。也可使用非硬化型封片液，但需用指甲油仔细封固盖玻片。 - 用移液法除去多余的封片液，将样本在室温避光条件下平放过夜干燥，可置于载玻片盒中或用铝箔覆盖。
3. 图像采集
- 打开共聚焦显微镜。启动成像软件（参见材料表），开始设置图像采集参数。
- 在功能选项卡中，选择Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27物镜用于采集分析所需的图像。
- 在采集功能选项卡的控制面板中激光区域，开启相应的激光器（Argon、Diode-405-30、DPSS 561-10 和 HeNe633）。
- 在控制面板的成像设置区域，创建四个轨道，每个轨道对应一个通道，以实现顺序采集。
- 在采集模式窗口中设置合适的图像分辨率。将分辨率设为1,024 × 1,024（帧大小），并选择16位的位深度。
- 针对每个通道，调节激光功率和增益，以获得良好的信号，同时避免像素饱和，否则将影响图像强度分析。使用实时按钮，设置激光输出水平和增益（主控）。
注意：建议启用范围指示器功能以检测饱和像素。为避免背景噪声，应将激光功率保持在1%至10%之间，增益（主控）低于850。 - 在控制面板的通道区域，为每个通道设置相同的针孔孔径，对于波长最高的通道，建议采用1艾里单位（AU）。
- 随机采集10个包含相似细胞数量的视野（每个视野含20–30个细胞）。每种实验条件下采集100–200个细胞，可为后续图像分析提供足够的统计效力。
4. ATG9A 分散的图像分析
- 从互联网下载 FIJI 软件（参见材料表）。通过点击 Plugins > Bio-Formats > BioFormats Importer，在 FIJI 中打开图像。
- 点击 Analyse > Set measurements，在测量窗口中选择Mean gray value，用于强度分析。
- 点击 Image > Color > Split Channels，将通道分离为三幅图像（高尔基体标记、细胞骨架、ATG9A 信号）。
- 进入 Image > Adjust > Threshold，在对应于高尔基体标记的通道中设定阈值。
- 点击 Edit > Selection > Create Selection，从二值图像创建选区。
- 进入 Edit > Selection > Add to Manager > Rename（Golgi），将选区保存至 ROI 管理器，并将其重命名为 Golgi。
- 点击 Image > Adjust > Threshold，在对应于细胞骨架标记的通道中设定阈值，以定义细胞轮廓。
- 进入 Edit > Selection > Create Selection，从二值图像创建选区。
- 点击 Edit > Selection > Add to Manager > Rename （Total），将选区保存至 ROI 管理器，并将其重命名为 Total。
- 选择对应于 ATG9A 染色的图像。
- 在 Analyse > Measure 中，通过点击 ROI Golgi 应用该选区，并测量高尔基体区域的强度。
- 点击 Analyse > Measure，通过点击 ROI Total 应用该选区，并测量 Total 区域的强度。
- 在所有图像中重复上述步骤，将结果保存为 .csv 文件，并使用以下公式处理数据：
ATG9A 分散率 = 高尔基体强度 / 总强度
5. ATG9A 构建体的活细胞成像
- 将 HEK293A 细胞（或其他选定细胞）以 2 mL 培养基接种至 60 mm 组织培养皿中，使其在次日达到约 65%-70% 的汇合度；通常可获得 1 × 106-2 × 106 个细胞。
- 次日，按以下步骤配制 Lipofectamine:DNA 混合物（或使用合适的替代性 DNA 转染试剂，参见材料表）：
- 根据质粒表达效率，将 0.5-2 µg 质粒 DNA 溶于 100 µL 无血清培养基中，通过上下吹打轻轻混匀溶液。室温孵育 5 分钟。
注：质粒 DNA 构建体因实验而异。研究人员可自行克隆，或根据请求向作者索取。 - 按 3:1 的 Lipofectamine:DNA 比例，将 Lipofectamine 2000 转染试剂溶于 100 µL 无血清培养基中，通过上下吹打轻轻混匀。室温孵育该混合物 5 分钟。
- 将上述两种溶液混合，轻轻吹打混匀，并在室温下孵育 20 分钟。
- 根据质粒表达效率，将 0.5-2 µg 质粒 DNA 溶于 100 µL 无血清培养基中，通过上下吹打轻轻混匀溶液。室温孵育 5 分钟。
- 将 Lipofectamine:DNA 混合物加入含 4 mL 生长培养基的各细胞培养皿中，轻轻前后摇晃培养皿以使混合物均匀分布。将细胞置于 37 °C、10% CO2 的湿润细胞培养箱中孵育。
- 转染后 4 小时更换为新鲜生长培养基，并在 37 °C、10% CO2 的湿润细胞培养箱中继续孵育过夜。
- 次日，用胰酶消化细胞，计数后将细胞重新接种至适用于活细胞显微成像的培养皿中（含 No. 1.5 玻璃盖玻片的培养皿，参见材料表）。每皿接种 0.4 × 106-0.7 × 106 个细胞，以确保成像时盖玻片上细胞汇合度约为 60%-75%。
注：建议对 HEK293A 细胞按步骤 2.1 所述使用多聚-D-赖氨酸包被。 - 再过一天（转染后 48 小时），对细胞进行成像。
6. 研究ATG9A的糖基化状态
- 在10 cm组织培养皿中接种HEK293A细胞（或其他选择的细胞），使其在次日达到约80%融合度，用于检测内源性ATG9A，此时通常在10 mL培养基中获得1.5 × 106–2.5 × 106个细胞。若计划转染ATG9A构建体，则接种细胞使其在次日达到约65%–70%融合度，此时通常在10 mL培养基中获得1 × 106–1.5 × 106个细胞。
- 次日，用100 µg/mL环己酰亚胺（CHX，参见材料表）或溶剂处理细胞。在37 °C孵育24 h（或至预定时间点）。
- 将细胞从培养箱中取出，吸除培养基，并将培养皿置于冰上。加入5 mL预冷的1× PBS。使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，用移液器将PBS-细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中。在4 °C下以800 × g离心5 min，收集细胞沉淀。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于约100 µL（根据细胞沉淀大小调整）预冷的TNTE裂解缓冲液（1% Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 mM EDTA）中，并加入蛋白酶抑制剂混合片剂（参见材料表），然后转移至1.5 mL微量离心管中。
- 将裂解液置于冰上孵育15 min。随后在4 °C下以20,000 × g离心10 min，沉淀细胞核及不溶性碎片，将上清液转移至新的微量离心管中。
- 使用Bradford法20和可在595 nm波长下测定吸光度的分光光度计测定裂解液的蛋白浓度。
- 调整蛋白量至一致，取16 µL裂解液（总蛋白量不超过100 µg），根据PNGase F（肽：N-糖苷酶F）试剂说明书加入5× PNGase F缓冲液，并加入1 µL PNGase F酶（参见材料表）。按照PNGase F试剂说明书推荐条件进行孵育。
- 加入适量3× Laemmli上样缓冲液，使终浓度为1×，在65 °C孵育5 min，随后使用Tris-乙酸凝胶进行电泳，以实现蛋白质的最佳分离。按照标准Western blot操作流程21（参见材料表）将凝胶中的蛋白质转移至合适的膜上（如PVDF[聚偏二氟乙烯]膜）。
注意：在95 °C煮沸样品会导致ATG9A发生聚集，从而降低ATG9A的检测信号。 - 使用针对ATG9A的特异性抗体（STO-215抗体，实验室自制1）进行Western blot检测（参见材料表）。保留膜上较高分子量区域不剪裁，以便观察较高分子量的ATG9A蛋白形式。
结果
ATG9A 是一种跨膜蛋白，与多种细胞内膜区室相关8,17,22,23,24。在基础状态下，ATG9A 主要定位于反式高尔基网络（TGN），这可通过内源性蛋白的免疫荧光以及其与顺式高尔基标志物 GM130 的共定位来证实（图 1A），此外也存在于部分与胞内吞循环区室（ERC）共定位的小囊泡中23。可采用不同的免疫荧光方案检测 ATG9A 在高尔基体的定位。然而，ATG9A 的囊泡组分及其定位变化——特别是响应特定刺激（如营养和血清饥饿）时囊泡池的增加——在强度上可能具有较大变异性，使用常规成像方法较难清晰观察。ATG9A 在高尔基体与囊泡组分之间的分布比例被称为 ATG9A 分散率。为检测 ATG9A 分散率的变化（例如经 EBSS 处理后，该处理用于去除血清和氨基酸），使用高尔基体标志物（如 GM130 或 TGN46）以及细胞骨架标志物（如 Phalloidin，用于标记细胞轮廓）25，有助于快速量化 ATG9A 的分散情况（图 1B）。重要的是，平均荧光强度比值分析仅可作为不同实验条件间的相对比较指标，而不能视为固定的分散速率。该比值高度依赖于多种生物学和非生物学因素，例如所用细胞系、染色质量或所采用的阈值设定方法（图 1B）。因此，研究人员需建立一套适用于其特定实验条件的分析流程，以准确识别 ATG9A 在高尔基体的富集状态，并在后续分析中使用相同参数对整套图像进行统一处理。代表性二值化图像及用于分析 ATG9A 平均荧光强度的选定区域在 图 1B 中作为示例提供。
ATG9A 含有多个跨膜结构域，其两侧为两个相对灵活且无固定结构的 N 末端和 C 末端结构域，其中 C 末端序列几乎占整个蛋白的一半12。重要的是，过表达 ATG9A 的定位模式会受到所标记蛋白末端的影响（图 2A）。特别是，在使用瞬时表达系统时，若将荧光标签（如 eGFP、mRFP 或其衍生物）直接连接至 ATG9A 的 N 末端，其高尔基体定位可能部分受损，在基础状态（即营养充足条件下）下的富集程度降低，尽管 ATG9A 囊泡仍清晰可见（图 2A）。而在 C 末端标记 ATG9A 则似乎会轻微诱导形成较大的 GFP 阳性簇状结构，可能发生聚集。最后，单体形式的 mRFP-ATG9A 在过表达细胞中也表现出类似的囊泡荧光簇，且高尔基体染色较弱（图 2A）。
ATG9A 在被转运至高尔基体和 ATG9A 囊泡之前，首先在内质网膜上折叠。在内质网停留期间，ATG9A 的第99位天冬酰胺（Asparagine 99）会发生 N-连接糖基化修饰；随后当其到达高尔基体时，会进一步获得复杂的成熟型 N-连接糖链1,14。这种糖基化修饰可通过 Western 印迹中出现的双条带加以检测14。与其细胞内定位一致，大多数内源性 ATG9A 均携带复杂的 N-连接糖链，因此在电泳图谱中以较高分子量的条带为主，同时可观察到一条较弱的低分子量条带（图 2B）。当使用 Tris-乙酸凝胶以提高高分子量蛋白的分辨率时，双条带现象最为明显（图 2B，对照组，t = 0）。当内源性蛋白经 PNGase F（肽：N-糖苷酶 F）处理后，大部分复杂的 N-连接糖链被去除，此时蛋白仅呈现为单一的条带（图 2B，PNGase F 处理组，t = 0）。因此，ATG9A 的 N-连接糖基化状态可作为监测其从内质网向高尔基体转运的间接指标，该过程可通过两条带之间的相对比例来反映。
当瞬时转染mRFP-ATG9A质粒时，过表达的蛋白最初在内质网中积累，可能是因为运输机制无法正确折叠和转运全部的ATG9A蛋白，此时较低分子量的条带占主导地位（图2C对照组 t = 0）。值得注意的是，在表达 mRFP-ATG9A 24 小时后，上下两条带的分布大致相等，表明 mRFP-ATG9A 蛋白池正在进入高尔基体图2C，对照组，t = 24）。若用环己酰亚胺（CHX）处理细胞，该药物可阻断 从头合成 蛋白质合成26，可以阐明ATG9A从内质网的折叠和转运过程。由于内源性蛋白在高尔基体中折叠并发生糖基化，因此使用CHX处理不会显著改变低分子量和高分子量条带的比例图2B，对照组）。然而，通过瞬时表达mRFP-ATG9A发现，CHX处理促进了高分子量条带的积累（图2C对照，CHX t = 24）。经PNGase F处理后，较高分子量的过表达mRFP-ATG9A条带消失，转变为较低分子量条带图 2C，PNGase F，t = 24）。这些数据表明，内源性蛋白迅速获得成熟糖链，表现为高分子量条带占主导地位，且CHX追踪不影响双条带的比例。图2B）。对于瞬时过表达的mRFP-ATG9A，CHX处理导致上层条带的累积，表明随着内质网池的折叠并从内质网转运至高尔基体，其获得了更成熟的糖基修饰。图2C).
在ATG9A序列与荧光标签之间添加连接序列有助于促进该蛋白更接近生理状态的定位和转运。在N端荧光蛋白与ATG9A之间融合一段3x-FLAG序列（24个氨基酸），可使过表达的蛋白行为更类似于内源性蛋白（图3）。事实上，在营养充足条件下，过表达的mCherry-3xFLAG-ATG9A与高尔基体标志物GM130共定位（图3A）。重要的是，这种定位特征以及ATG9A囊泡区室在时间进程中保持稳定，从而允许对ATG9A的转运进行时空动态研究（图3B）。
图1：内源性ATG9A定位的图像分析。（A）内源性ATG9A（红色）、高尔基体标志物GM130（绿色）以及用于显示肌动蛋白细胞骨架的鬼笔环肽（青色）的代表性免疫荧光图像。比例尺 = 10 μm。（B）用于确定定位于高尔基体区域的内源性ATG9A比例的图像分析流程。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：通过定位与糖基化分析荧光标记的 ATG9A 构建体。 （A）N 端标记 eGFP 的 ATG9A 在高尔基体中的定位较少，主要存在于囊泡中。C 端标记 eGFP 的 ATG9A 在细胞内形成聚集体（部分示例以白色箭头标出；eGFP-ATG9A 和 ATG9A-eGFP 显示为绿色）。N 端标记 mRFP 的 ATG9A 在高尔基体中的定位也较少，主要存在于囊泡中。N 表示细胞核的大致位置，mRFP-ATG9A 显示为红色。比例尺 = 5 μm。（B）内源性 ATG9A 在 Western 印迹分析中呈现两条条带（箭头所示）：上条带（具有复杂的 N-连接糖链）和下条带（无成熟 N-连接糖链）。环己酰亚胺（CHX）处理不影响上下条带之间的比例。PNGase F 处理导致上条带消失。（C）在 HEK293A 细胞中瞬时转染 mRFP 标记的 ATG9A 后，Western 印迹上可见两条明显条带（箭头所示）。PNGase F 处理导致上条带消失。转染后使用 CHX 处理导致糖基化增加，这是因为转染的 ATG9A 蛋白从内质网向高尔基体转运。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：通过免疫荧光和活细胞成像分析 mCherry-3xFLAG-ATG9A 的定位。 （A）瞬时过表达 mCherry-3xFLAG-ATG9A 的 HEK293A 细胞的免疫荧光实验，使用高尔基体标志物 GM130 进行染色。比例尺 = 10 μm。mCherry-3xFLAG-ATG9A 显示为红色，GM130 高尔基体标志物显示为绿色。（B）在瞬时过表达 mCherry-3xFLAG-ATG9A 的 HEK293A 细胞中进行的活细胞成像实验的图像拼接。N 表示细胞核的大致位置。时间帧 = 1 fps。比例尺 = 10 μm。mCherry-3xFLAG-ATG9A 显示为红色。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本研究介绍了可用于研究ATG9A定位的各种工具。首先，描述了如何通过免疫荧光技术对ATG9A进行可视化以及如何对其进行定量分析。其次，比较了在固定细胞或活细胞中使用荧光标记物标记ATG9A以实现其可视化的不同策略。最后，阐述了如何利用ATG9A的糖基化状态来判断其是否已离开内质网并经高尔基体转运。
关于通过免疫荧光检测内源性ATG9A定位，实验中所采用的固定和通透方法需格外注意。根据本文所述的标准操作流程，多聚甲醛固定结合皂苷通透是观察高尔基体相关ATG9A以及ATG9A阳性囊泡的良好条件7。除了固定和通透方法外，一抗孵育时间也至关重要。我们曾观察到（但未正式记录）较高浓度的一抗溶液和较长的孵育时间可能导致ATG9A在高尔基体的染色信号被错误放大，最终影响对ATG9A向其他膜区室再分布的检测。此外，由于ATG9A存在于多种细胞内区室中1,13,17,22,23,24,27,28，因此联合使用特异性膜标记物与ATG9A共染，以明确其定位位置尤为重要。过去已有多种方法用于量化ATG9A的定位，包括使用Pearson相关系数评估共定位29。然而，由于ATG9A与高尔基体及不同囊泡区室之间仅存在部分重叠，导致像素异常值较多，可能对相关系数的解读产生偏差。因此，更推荐采用一种较为简化的分析方法，即计算待分析两个区室中平均荧光强度的比值，该方法对细胞间变异的敏感性较低。有关显微镜图像分析的更多详细信息，读者可参考本章节所引述的书籍章节30。
在研究ATG9A的糖基化状态时，选择用于进行蛋白质印迹的凝胶至关重要。本方案推荐使用3%-8%的Tris-乙酸盐凝胶，因为此类凝胶对大分子量蛋白质具有最高的分辨率；但也可使用其他凝胶体系或电泳缓冲液，只要其能有效分离高分子量蛋白质即可。实验者可通过延长电泳时间，以确保蛋白质达到最大程度的分离。
在制备用于Western blot检测ATG9A的样品时，加入Laemmli缓冲液后切勿煮沸样品；95 °C的煮沸会导致ATG9A形成聚集体，从而使其无法有效迁移进入凝胶1。建议将样品在65 °C加热5分钟27。
较高的转染水平通常会导致ATG9A在内质网中大量积累，而适度的表达水平则有助于该蛋白的生理定位。据经验，将孵育时间从48小时延长至72小时通常有助于减少内质网定位的人工假象。值得注意的是，如果通过控制表达水平或使用稳定细胞系来调控表达量，mRFP-ATG9A能够准确反映ATG9A的转运过程及其功能8,9,22,27。
过表达的ATG9A蛋白群体无法获得成熟的N-连接聚糖，可作为ATG9A转运受阻的检测指标。当对ATG9A的某些区域进行突变或删除时，可能存在内质网滞留增加的风险，这会导致ATG9A无法获得成熟的N-连接聚糖，从而在Western blot中表现为迁移速度更快的ATG9A条带。使用截短型ATG9A构建体的研究人员应检测其内质网滞留情况、糖基化状态以及高尔基体定位。
对于ATG9A的活细胞成像，使用依赖快速Airyscan功能的Airyscan显微镜可提供约120 nm的最优分辨率。在定位精度方面，超分辨率模式下每秒1-2帧（fps）的帧速率最为理想，具体取决于成像的通道数量。其他可高速成像的类似共聚焦显微镜也可用于ATG9A囊泡的成像；但需要注意，成像速度可直接影响事件的检测，从而影响数据的解读。
综上所述，本文所述方案介绍了通过免疫荧光、活细胞显微镜以及糖基化状态分析来定量和表征ATG9A定位的方法。这些方案可为研究ATG9A的研究人员提供帮助，并有助于避免一些常见问题。
披露
S.A.T. 在Casma Therapeutics公司担任科学咨询委员会成员。
致谢
作者感谢 Rocco D'Antuono 对稿件部分的校对，以及自噬分子细胞生物学（MCBA）实验室所有现任和前任成员的讨论，这些讨论促进了本实验方案的完善。 A. v.V.、S.d.T.、E.A.、S.A.T. 由弗朗西斯·克里克研究所资助，该研究所的核心资金来自英国癌症研究会（CC2134）和英国医学研究理事会（CC2134）。本研究全部或部分由惠康信托基金（CC2134）资助。 为实现开放获取，作者已对由此投稿产生的任何作者接受稿件版本申请了CC BY公共版权许可。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 孔板 | Falcon | 353047 | 用于组织培养 |
| 35 mm 培养皿 | No. 1.5 盖玻片 | 14 mm 玻璃直径 | 未包被 | MATTEK | P35G-1.5-14-C | 用于活细胞显微镜观察的细胞培养皿 |
| 4× Laemmli 上样缓冲液 | Bio-Rad | 1610747 | |
| 60 mm 组织培养皿 | Thermofisher Scientific | 10099170 | 用于组织培养 |
| Alexa Fluor 647 鬼笔环肽 | Thermofisher Scientific | A22287 | 肌动蛋白染色剂 |
| 抗 ATG9A 抗体 | 自制 | STO-215 | 兔源抗 ATG9A N 端肽抗体 |
| 抗兔 IgG，辣根过氧化物酶标记 | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | 用于兔多克隆抗体 STO-215 的二抗 |
| 抗 RFP 抗体 | Evrogen | AB233 | 用于 Western 印迹 |
| ATG9A 单克隆抗体 (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | 用于免疫荧光的抗体 |
| ATG9A-eGFP | 自制 | 表达带标签 ATG9A 的质粒构建体 | |
| Bemis 封口膜 | Thermofisher Scientific | 11747487 | 自封型热塑性薄膜 |
| Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液 | Bio-Rad | 5000006 | 用于测定蛋白浓度 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Merck | 10735086001 | 用于封闭非特异性结合位点 |
| CaCl2.2H2O | / | 用于 PBS 和 EBSS 配制 | |
| cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11697498001 | 裂解缓冲液添加剂，防止蛋白降解 |
| Cy3 标记的 AffiniPure 山羊抗仓鼠 IgG 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | 用于免疫荧光实验中 14F2 8B1 抗体的二抗 |
| 放线菌酮 | Sigma Aldrich | 66-81-9 | 用于抑制蛋白质翻译 |
| D-葡萄糖 | / | 用于 EBSS 配制 | |
| 皂苷 | Merck | 300410 | 用于细胞通透处理 |
| DMEM 培养基 | Merck | D6546-6x500ml | 用于组织培养 |
| eGFP-ATG9A | 自制 | 表达带标签 ATG9A 的质粒构建体 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | DMEM 培养基的添加物，用于细胞培养 |
| FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | 开源图像分析软件 |
| Hoechst 染料 | Thermofisher Scientific | H3570 | 细胞核染色剂 |
| KCl | / | 用于 EBSS 配制 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | 67513 | 用于组织培养 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | 用于细胞转染 |
| LSM880 Airyscan 显微镜 | Zeiss | / | 共聚焦显微镜 |
| MgCl2 | / | 用于 PBS 配制 | |
| MgSO4.7H2O | / | 用于 EBSS 配制 | |
| Mowiol 封片液 | Millipore | 475904 | 用于永久性封固盖玻片 |
| NaCl | / | 用于 EBSS 配制 | |
| NaH2PO4.2H2O | / | 用于 EBSS 配制 | |
| NaHCO3 | / | 用于 EBSS 配制 | |
| NuPAGE 3 至 8%，Tris-乙酸盐，1.5 mm，小型蛋白凝胶 | Thermofisher Scientific | EA0378BOX | 用于 Western 印迹 |
| NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液 (20×) | Life Tech | NP0002 | 用于 Western 印迹 |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Thermofisher Scientific | 31985062 | 用于细胞转染 |
| 多聚甲醛 | Agar Scientific | R1026 | 用于固定细胞 |
| pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | 自制 | 表达带标签 ATG9A 的质粒构建体 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | / | 用于组织培养 | |
| PNGaseF | NEB | P0710S | 用于去除 N-连接糖链 |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐，分子量 70,000–150,000 | Merck | P0899 | 用于盖玻片包被 |
| 快速 PNGase F 酶 | NEB | P07105 | 用于去除 N-连接糖链 |
| RFP-ATG9A | 自制 | 表达带标签 ATG9A 的质粒构建体 | |
| Triton X-100 | Thermofisher Scientific | 13454259 | 用于细胞裂解的去垢剂 |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma | T4049 | 用于组织培养 |
| Whatman 滤纸 | Merck | WHA1001325 | 用于 Western 印迹和免疫荧光 |
| XCell SureLock 小型电泳系统 | Invitrogen | EI0001 | 用于 Western 印迹 |
| Zen Black 版本 | Zeiss | / | 用于操作 LSM 880 显微镜 |
参考文献
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