体外利用双-3-氯哌啶对G-四链体DNA结构进行化学图谱分析

摘要

双--3-氯哌啶类化合物（B-CePs）是用于识别和表征DNA模板中G-四链体结构的有效化学探针 体外本方案详细描述了使用 B-CePs 进行探针反应的操作步骤，并通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应产物。

摘要

G-四链体（G4s）是一类具有重要生物学意义的非经典DNA结构，在基因表达和疾病发生中发挥关键作用，是极具潜力的治疗靶点。目前亟需开发简便易行的方法以研究 体外 潜在G-四链体形成序列（PQSs）中DNA的表征。B-CePs是一类烷基化试剂，已被证明是研究核酸高级结构的有用化学探针。本文描述了一种新的化学图谱分析方法，该方法利用B-CePs与 N7个鸟嘌呤，随后在烷基化的G位点发生直接链断裂。

具体而言，为了区分G4折叠结构与未折叠的DNA形式，我们使用B-CeP 1探针检测凝血酶结合适配体（TBA）——一种能够形成G4结构的15个核苷酸的DNA序列。B-CeP响应性鸟嘌呤与B-CeP 1反应后生成的产物，可通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在单核苷酸水平上进行分辨，从而定位单个烷基化加合物以及在烷基化鸟嘌呤位点发生的DNA链断裂。利用B-CePs进行图谱分析是一种简单而强大的工具，可用于体外（in vitro）表征能够形成G-四链体的DNA序列，精确定位参与G-四分体形成的鸟嘌呤位置。

引言

除了典型的沃森-克里克双螺旋结构外，由于富含鸟嘌呤的序列，核酸还能形成多种其他二级结构，例如G-四链体（G4）结构。G4结构基于平面四聚体（称为G-四联体）的形成，其中四个鸟嘌呤通过霍格斯滕氢键相互作用。G-四联体相互堆叠，并由位于鸟嘌呤核心中心的单价阳离子进一步稳定（图1）¹。

图1：G-四链体结构的示意图。（A）G-四分体的示意图。该平面结构通过Hoogsteen碱基配对以及中心阳离子（M⁺）稳定。 请点击此处查看此图的放大版本。

含有四个或更多个至少由两个连续鸟嘌呤核苷酸组成的串联重复序列，是潜在的G-四链体形成序列（PQSs），可折叠形成G-四链体结构。PQSs存在于多种不同的细胞环境中，例如端粒、基因启动子区、核糖体DNA以及重组位点，并参与调控多种生物学过程²。因此，对人类基因组中G-四链体（G4s）的识别与实验验证——目前主要依赖计算工具完成——是一个具有重要生物学意义的问题³。为了支持计算预测结果或检测未被预测到的G4结构，本文展示了一种基于化学图谱分析的可及性方法，用于鉴定DNA模板中G-四链体的形成，从而实现对构成G-四分体结构的鸟嘌呤残基的精确定位。

报道的化学图谱分析利用了不同反应活性的差异 二-3-氯哌啶（B-CePs）与G4结构形成后暴露的鸟嘌呤发生反应。由于其对亲核试剂具有高反应活性^4,5,6,7,8,9，B-CePs 是一类核酸烷基化试剂，能够非常高效地与 N鸟嘌呤核苷酸的7号位¹⁰烷基化作用随后会导致单链和双链DNA结构中的脱嘌呤及链断裂。相反，在G4结构中参与形成G-四联体的鸟嘌呤对B-CeP烷基化具有抗性，因为 N鸟嘌呤的7号位点参与形成Hoogsteen氢键。B-CePs的这一特异性反应性不仅可用于检测G-四链体结构，还可用于鉴定构成G-四联体的鸟嘌呤位点，因为这些位点相对于单链和双链DNA中的鸟嘌呤在烷基化反应中表现出特征性的保护效应，从而可据此推断其位置。

本文报道了使用B-CeP 1（图2A）作为探针，对凝血酶结合适配体（TBA）进行化学图谱分析的实验方案。TBA是一种由15个核苷酸组成的DNA序列，在钾阳离子存在下可形成G4结构^11,12。本研究将TBA的G4构象（G4-TBA）与两种对照形式直接比较：单链形式的TBA（ssTBA）以及与互补序列退火后形成的双链结构（dsTBA）（表1）。探针反应产物通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在单核苷酸水平上进行分离，依据为各个烷基化加合物的位置以及烷基化鸟嘌呤处的DNA链断裂。TBA寡核苷酸在3'端标记荧光染料，从而实现凝胶上的可视化检测（表1）。本方案详细描述了如何将TBA折叠成不同构象（G4及对照组），以及如何使用B-CePs进行探针反应并随后进行PAGE分析。

方案

1. 核酸与化学探针的制备

1. 核酸
   注意：名为 "TBA" 的寡核苷酸是一条15个碱基的DNA序列，序列为5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'，其3'端用荧光染料5-羧基荧光素（FAM）标记，以便在凝胶中可视化。未标记的寡核苷酸 "cTBA" 是其互补DNA序列，序列为5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'。TBA和cTBA用于获得三种不同的结构，如表1所示。
   1. 对枪头和0.5 mL离心管进行高压灭菌，以获得无菌耗材并避免污染。
   2. 将每种寡核苷酸溶于超纯水中，配制为终浓度100 µM的储备液。使用紫外-可见（UV-Vis）分光光度计测定寡核苷酸的确切浓度，并采用生产商提供的260 nm处的消光系数。
      注意：TBA和cTBA的消光系数分别为164,300 M^-1 cm^-1和138,600 M^-1 cm^-1。
   3. 将TBA和cTBA的储备液储存于-20 °C（在此条件下可保存数月）。
2. 化合物B-CeP 1
   注意：化合物B-CeP 1的合成方法如先前文献⁶所述。
   1. 配制浓度约为10 mM的B-CeP 1储备液。在通风橱内使用分析天平称取约1 mg冻干粉末，并用100%二甲基亚砜（DMSO）溶解。
   2. 根据实际使用的化合物质量和DMSO（密度d = 1.1 g/cm³）体积计算化合物的确切浓度。
      注意：操作该化合物时应始终佩戴手套（无论是冻干状态还是溶于DMSO后）^13,14。

表1：本实验方案中使用的寡核苷酸结构。 请点击此处下载该表格。

2. 核酸结构的折叠

1. 缓冲液的配制
   1. 配制BPE缓冲液（双磷酸盐-乙二胺四乙酸[EDTA]，5倍浓度：2 mM NaH₂PO₄、6 mM Na₂HPO₄、1 mM Na₂EDTA，pH 7.4）以及500 mM KCl的超纯水溶液。使用孔径为0.22 µm的滤膜过滤上述溶液。
      注意：为获得最佳效果，建议使用新鲜配制的溶液。BPE缓冲液可在4 °C下保存最多15天。
2. 通过热变性-复性程序折叠G4-TBA、ssTBA和dsTBA样品
   注意：钾离子对于G4结构（G4-TBA）的形成至关重要。在对照样品ssTBA和dsTBA的折叠溶液中不得添加钾离子。
   1. 在1倍BPE缓冲液和100 mM KCl中配制40 µL浓度为4 µM的G4-TBA溶液。将G4-TBA寡核苷酸溶液于95 °C加热5分钟以实现变性，随后缓慢冷却至室温（RT），使TBA折叠形成G-四链体结构。
   2. 在1倍BPE缓冲液中配制40 µL浓度为4 µM的ssTBA溶液。按照步骤2.2.1所述进行热变性-复性处理，使TBA保持单链构象。
   3. 在1倍BPE缓冲液中，将等摩尔量的TBA与cTBA混合，配制40 µL浓度为4 µM的dsTBA溶液。参照上述步骤2.2.1的热变性-复性程序，使TBA与其互补链cTBA退火，形成双链TBA结构。
      注意：每种折叠溶液的终体积应根据探针反应所需的样品数量确定，每个样品需5 µL的4 µM溶液。建议每种溶液额外多配制少量体积，以避免移液误差。

3. 探测反应

注意：探针反应必须在热复性程序完成后立即进行。

1. 当 G4-TBA、ssTBA 和 dsTBA 的折叠溶液冷却至室温后，进行短时离心（室温下 7,000 × g 离心 5–8 秒），然后开始探针反应。
2. 准备 21 个空的 0.5 mL 灭菌离心管，按照 表 2 所示，在实验样品架上分为三组，每组七管。
   注意：每列对应三种不同的 TBA 折叠条件，即 G4-TBA、ssTBA 和 dsTBA；每行对应三个不同的孵育时间；每列中的每个管对应最终的 B-CeP 1 探针浓度（表 2）。请确保对各管进行清晰标记。
3. 向每个管中加入 3 µL 超纯水。
4. 向第一组各管（步骤 3.2）中加入 5 µL 折叠后的 G4-TBA；向第二组各管中加入 5 µL 折叠后的 ssTBA；向第三组各管中加入 5 µL 折叠后的 dsTBA。
5. 用超纯水将 B-CeP 1 储存液稀释至 250 µM 和 25 µM。
   注意：B-CeP 1 化学探针的稀释液必须现配现用，并立即与 DNA 底物反应，以避免与水发生竞争性反应。
6. 向样品中加入 2 µL 相应的 B-CeP 1 稀释液（25 µM 或 250 µM）；在三个对照样品（C）中用超纯水替代该化合物，用于分析无化合物存在时不同折叠状态的 TBA。将所有样品在 37 °C 下孵育。
7. 孵育 1 h、4 h 和 15 h 后，将离心管置于 -20 °C 以终止反应，直至进行下一步操作。
   注意：样品在此条件下可保存数天。
8. 使用真空离心浓缩仪将样品干燥。
   注意：干燥后的样品可在 -20 °C 下保存数周，之后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析。

表2：探针反应的样品（结构、探针浓度和孵育时间）。每组列对应三种不同的TBA折叠条件（G4-TBA、ssTBA和dsTBA）。每行对应三种不同的孵育时间（1、4、15小时）。每列中的每个单元格对应B-CeP 1探针的最终浓度（5或50 µM）。每组的对照（C）为在无化合物存在下、经最长孵育时间（15小时）孵育的不同折叠状态的TBA样品。请点击此处下载该表格。

4. 高分辨率PAGE

1. 变性聚丙烯酰胺溶液的制备
   注意：提前配制500 mL的20%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液。每次实验约使用80 mL该溶液。使用棕色玻璃瓶或将玻璃瓶用铝箔包裹，于室温（RT）下储存该溶液。
   警告：聚丙烯酰胺具有神经毒性。在凝胶制备和灌注的所有步骤中，均需佩戴手套和实验服。聚合后的丙烯酰胺应丢弃至适当的污染材料专用容器中。
   1. 在1 L烧杯中称取210 g尿素，加入250 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）溶液和50 mL 10×TBE（890 mM Tris-HCl，890 mM 硼酸，20 mM EDTA，pH 8）。
   2. 将烧杯置于磁力搅拌器上，用玻璃棒搅拌溶液。搅拌过程中用铝箔覆盖烧杯，以防止溅出和污染。
   3. 持续搅拌至尿素完全溶解，溶液澄清透明。
      注意：此步骤可能需要数小时。为促进尿素溶解，可加入少量水，但不得超出最终所需体积。
   4. 取出玻璃棒，将溶液倒入量筒中，并加水定容至500 mL。
2. 凝胶装置的组装
   1. 用70%乙醇清洗两块玻璃板（一块带缺口，一块无缺口），晾干后用二甲基二氯硅烷溶液处理玻璃板。
      注意：硅烷化步骤可省略，但该处理有助于在拆卸凝胶夹心结构时使凝胶从其中一块玻璃板上顺利脱离。
      警告：操作硅烷化溶液时需佩戴手套，并在通风橱内进行玻璃板处理。
   2. 将0.4 mm厚度的垫片沿较长玻璃板的长边放置，将较短的玻璃板叠放在其上，并在底部对齐两块玻璃板。
   3. 除顶部外，在其余所有边缘贴上多层纸胶带。
   4. 为防止灌胶时漏液，可在凝胶底部额外加贴一层胶带。
   5. 按照供应商说明，使用洁净的夹子固定玻璃板夹心结构的两侧（不同供应商使用的装置、夹子和密封垫略有差异）。
3. 灌注凝胶
   注意：应在室温（25 °C）下灌胶，因为聚丙烯酰胺的聚合对温度敏感。
   1. 在烧杯中加入80 mL预先配制的变性聚丙烯酰胺溶液（步骤4.1），临用前立即加入450 µL 10% m/V过硫酸铵（APS）溶液和45 µL四甲基乙二胺（TEMED）。
   2. 混合均匀后，使用50 mL注射器迅速将溶液沿两块玻璃板之间注入。插入带有所需孔数的梳子，避免产生气泡。如有必要，补充凝胶溶液以完全充满夹心结构。在梳子上放置四个夹子压紧，以确保各加样孔分布均匀。
   3. 让凝胶聚合至少45分钟。
4. 电泳运行
   1. 聚合完成后，移除所有夹子和纸胶带层。缓慢取出梳子，并用蒸馏水彻底冲洗加样孔。
   2. 根据特定供应商的说明，正确将凝胶夹心结构安装到垂直板凝胶电泳装置中。
   3. 用去离子水配制TBE电泳缓冲液（1×：89 mM Tris-HCl，89 mM 硼酸，2 mM EDTA，pH 8），并加满上下两个缓冲液槽。
   4. 通过预电泳（50 W，至少30分钟）对玻璃板进行预热。
   5. 用超纯水配制变性上样缓冲液（DGLB：1 M Tris-HCl，80%甲酰胺，50%甘油，0.05%溴酚蓝）。
      注意：上样缓冲液有助于追踪寡核苷酸样品在凝胶中的迁移情况，并便于将样品加载至凝胶加样孔中。其中的变性剂甲酰胺可使DNA分子按大小分离，即使在非变性PAGE中也能实现。
   6. 将干燥的样品（步骤3.8所得样品）重悬于5 µL DGLB中。
   7. 上样前，使用小注射器及上层缓冲液槽中的TBE缓冲液冲洗加样孔，以去除孔内的尿素。
      注意：重复此步骤数次，确保加样孔清洁，避免出现难以解析的条带。
   8. 将样品加入洁净的加样孔中，并记录加样顺序。
   9. 以50 W恒功率电泳2小时，或至少运行至溴酚蓝染料迁移至凝胶长度的2/3处。
5. 凝胶成像
   1. 电泳结束后，关闭电源，取出玻璃板夹心结构，并清洁玻璃表面。
   2. 使用凝胶成像系统扫描，检测FAM标记的寡核苷酸条带的荧光信号。

结果

图2 展示了按照本方案所述，使用B-CeP 1对TBA寡核苷酸在三种不同结构折叠状态下的化学图谱分析实验的代表性结果。TBA的G-四链体构型（G4-TBA）是通过在BPE缓冲液中并存在K⁺阳离子的条件下使寡核苷酸折叠而获得的，而相同TBA序列的单链形式（ssTBA）则是在无钾离子条件下折叠形成的。双链结构（dsTBA）是通过将TBA与其互补序列在BPE缓冲液中退火制备而成。将B-CeP 1以5 µM或50 µM的终浓度分别与2 µM的G4-TBA（图2B左侧泳道）、ssTBA（图2B中间泳道）和dsTBA（图2B右侧泳道）反应1小时、4小时和15小时。额外的对照组为未与探针反应的DNA结构。对三种不同TBA折叠构型的圆二色性（CD）分析证实了其正确的二级结构（补充图S1）。事实上，dsTBA的CD谱图表现出B型DNA双螺旋的典型特征，即在约260...

讨论

G-四链体是一类通常在富含鸟嘌呤的DNA序列中折叠形成的核酸二级结构，因其与基因调控及疾病密切相关，已成为重要的研究对象。利用B-CePs进行化学图谱分析是一种用于表征DNA G-四链体的有效方法，可在生理盐条件下鉴定参与G-四分体形成的鸟嘌呤碱基。

本方案中使用的化学探针为 B-CeP 1（图 2A），该探针可特异性地与鸟嘌呤碱基的 N7 位点发生反应，从而区分参与形成 G-四链体四联体结构的鸟嘌呤与未参与此类结构的鸟嘌呤。事实上，G-四联体中鸟嘌呤之间的 Hoogsteen 氢键作用（图 1）会阻碍探针与其发生反应。探针反应产物通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离（图 2B），这是一种实验室常规可及的方法，广泛用于检测 DNA 序列中的烷基化加合物及切割位点。此外，使用荧光标记的 DNA 序列可使实验在安全条件下进行，避免使用放射性标记的核酸以及传统的嵌入染料染色步骤。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
过硫酸铵（APS）	Sigma Aldrich	A7460
分析天平	Mettler Toledo
高压灭菌器	pbi international
硼酸	Sigma Aldrich	B0252
溴酚蓝 亮蓝 R	Sigma Aldrich	B0149
十二水合磷酸氢二钠	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA 寡核苷酸	Integrated DNA Technologies	定制序列合成
乙二胺四乙酸二钠	Sigma Aldrich	E5134
甲酰胺	Fluka	40248	H351-360D-373
凝胶成像系统	GE Healtcare	STORM B40
甘油	Sigma Aldrich	G5516
0.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72.704
氯化钾	Sigma Aldrich	P9541
测序仪	Biometra	Model S2
硅烷化溶液 I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
磷酸二氢钠	Carlo Erba	480086
真空浓缩仪	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
尿素	Sigma Aldrich	51456
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	Nanodrop 1000