Method Article

体外研究双-3-氯哌啶对G-四链体DNA结构的化学定位

DOI:

10.3791/65373

⸱

May 12th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2Institute of Organic Chemistry, Justus Liebig University Giessen

In This Article

Summary

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双-3-氯哌啶 （B-CePs） 是有用的化学探针，用于在体外鉴定和表征 DNA 模板中的 G-四链 体结构。该协议详细介绍了用B-CeP进行探测反应和通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应产物的过程。

Abstract

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G-四链体 （G4s） 是生物学相关的非典型 DNA 结构，在基因表达和疾病中起重要作用，代表重要的治疗靶点。在潜在的 G 四链体形成序列 （PQS） 中对 DNA 进行 体外 表征需要可用的方法。B-CeP是一类烷化剂，已被证明是研究核酸高级结构的有用化学探针。本文描述了一种新的化学定位分析方法，利用 B-CePs 与鸟嘌呤 N7 的特异性反应性，然后在烷基化 Gs 处直接链裂解。

也就是说，为了区分 G4 折叠和未折叠的 DNA 形式，我们使用 B-CeP 1 探测凝血酶结合适配体 （TBA），这是一种能够承担 G4 排列的 15 聚体 DNA。B-CeP 响应鸟嘌呤与 B-CeP 1 的反应产生的产物可以通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 在单核苷酸水平上解析，方法是在烷基化鸟嘌呤上定位单个烷基化加合物和 DNA 链切割。使用 B-CePs 进行定位是一种简单而强大的工具，用于体 外 表征 G-四链体形成的 DNA 序列，能够精确定位参与 G-四链体形成的鸟嘌呤。

Introduction

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除了典型的 Watson-Crick 双螺旋结构外，核酸还可以采用各种二级结构，例如替代的 G-四链体 （G4） 形式，因为它们富含鸟嘌呤的序列。G4 结构基于平面四聚体的形成，称为 G-四聚体，其中四个鸟嘌呤通过 Hoogsteen 氢键相互作用。G-四分体通过在鸟嘌呤核心中心配位的一价阳离子堆叠并进一步稳定（图1）1。

figure-introduction-1
图 1:G 四链体结构的示意图。 （A） G-四联体的示意图。平面阵列通过Hoogsteen碱基配对和中心阳离子（M +）稳定。请点击这里查看此图的较大版本.

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Protocol

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1.核酸及化学探针制备

  1. 核酸
    注:名为"TBA"的寡核苷酸是 15-mer DNA 序列 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-TGG-3'，由荧光基团 5-羧基荧光素 （FAM） 在 3'-末端标记，以实现凝胶上的可视化。未标记的寡核苷酸"cTBA"是其DNA互补序列5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'。采用TBA和cTBA获得三种不同的结构，如 表1所示。
    1. 高压灭菌器吸头和 0.5 mL 试管，以获得无菌一次性用品并避免污染。
    2. 制备将每种寡核苷酸溶解在超纯水中至终浓度为100μM的储备溶液。 使用制造商提供的260nm处的消光系数，使用紫外可见（UV-Vis）分光光度计确定确切的寡核苷酸浓度。
      注:消光系数:TBA 和 cTBA 分别使用 164,300 M-1 cm-1 和 138,600 M-1 cm-1。
    3. 将TBA和cTBA储备溶液储存在-20°C（在这些条件下储存数月）。
  2. 化合物 B-CeP 1
    注:化合物 B-CeP 1 的合成如前所述6.
    1. 制备~10mM的B-CeP 1储备溶液。使用位于通风橱中的分析天平称取~1mg冻干化合物，并将其溶解在1....

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Results

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图2显示了在折叠成三种不同结构的TBA寡核苷酸上进行化学定位测定的代表性结果，如方案中所述的B-CeP 1。TBA 的 G-四链体排列 （G4-TBA） 是通过在 BPE 中折叠寡核苷酸并在 K+ 阳离子存在下获得的，而同一 TBA 序列的单链形式 （ssTBA） 是在无钾的情况下折叠的。通过在BPE缓冲液中将TBA退火至其互补序列来制备双链构建体（dsTBA）。将终浓度为5或50μM的B-CeP 1与2μM的G4-TBA（图2B的左泳道）、ssTBA（图2B的中央泳道）和dsTBA（图2B的右泳道）样品反应1小时、4小时和15小时。其他对照是未与探针反应的 DNA 构建体。对三种不同的TBA褶皱进行圆二色性（CD）分析，证实了它们的正确结构（补充图S1）。dsTBA 的 CD 光谱实际上具有 ~260-280 nm 的正长波段和 ~245 nm.......

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Discussion

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G-四链体是核酸二级结构，通常折叠在富含鸟嘌呤的DNA序列中，并且由于它们与遗传控制和疾病有关，因此是重要的研究目标。B-CePs 的化学定位是表征 DNA G4s 的有用方案，可用于鉴定在生理盐条件下参与 G-四分体形成的鸟嘌呤碱基。

该协议中使用的化学探针是B-CeP 1（图2A），其通过与鸟嘌呤核碱基的 N7特异性反应，可以区分参与G-四链体四链体形成的鸟嘌呤和不涉及这种排列的鸟嘌呤。事实上，G-四分体中鸟嘌呤之间的Hoogsteen氢相互作用（图1）损害了与探针的反应。探测反应产物通过高分辨率PAGE（图2B）进行解析，这是一种实验室可访问的程序，用于检测DNA序列中的烷基化加合物和切割位点。此外，使用用荧光团标记的DNA序列允许用户在安全条件下进行实验，避免放射性标记的核酸和使用插层剂的常规染色步骤。

B-CeP 1探针在.......

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Disclosures

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作者没有要披露的利益冲突。

Acknowledgements

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这项工作得到了帕多瓦大学制药和药理学系（PRIDJ-BIRD2019）的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 40%ApplichemA3658R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
过硫酸铵 （APS）Sigma AldrichA7460
分析天平梅特勒-托利多
高压灭菌pbi 国际
硼酸Sigma AldrichB0252
溴酚蓝 亮蓝 RSigma AldrichB0149
磷酸氢二钠十二水合Fluka71649
DMSOSigma Aldrich276855
DNA 寡核苷酸集成 DNA 技术定制序列
EDTA 二钠Sigma AldrichE5134
甲酰胺Fluka40248H351-360D-373
凝胶成像仪GE HealtcareSTORM B40
甘油Sigma AldrichG5516
微量管 0.5 mLSarstedt72.704
氯化钾Sigma AldrichP9541
测序仪Biometra型号 S2
硅烷化溶液 IFluka85126H225， 314， 318， 336， 304， 400， 410
磷酸二氢钠Carlo Erba480086
Speedvac 浓缩器Thermo ScientificSavant DNA 120
TEMEDFluka87689R11-21/22-23-34
Tris-HClMERCK1.08387.2500
尿素Sigma Aldrich51456
紫外-可见分光光度计Thermo ScientificNanodrop 1000
器 物 合成

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
  2. Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and....

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G Quadruplex DNAChemical MappingBis 3 ChloropiperidinesG TetradsDNA AlkylationPolyacrylamide Gel ElectrophoresisThrombin Binding AptamerSingle Stranded DNADNA Strand CleavageNucleic Acid Probes

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