体外利用双-3-氯哌啶对G-四链体DNA结构进行化学图谱分析

摘要

双--3-氯哌啶类化合物（B-CePs）是用于识别和表征DNA模板中G-四链体结构的有效化学探针 体外本方案详细描述了使用 B-CePs 进行探针反应的操作步骤，并通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应产物。

摘要

G-四链体（G4s）是一类具有重要生物学意义的非经典DNA结构，在基因表达和疾病发生中发挥关键作用，是极具潜力的治疗靶点。目前亟需开发简便易行的方法以研究 体外 潜在G-四链体形成序列（PQSs）中DNA的表征。B-CePs是一类烷基化试剂，已被证明是研究核酸高级结构的有用化学探针。本文描述了一种新的化学图谱分析方法，该方法利用B-CePs与 N7个鸟嘌呤，随后在烷基化的G位点发生直接链断裂。

具体而言，为了区分G4折叠结构与未折叠的DNA形式，我们使用B-CeP 1探针检测凝血酶结合适配体（TBA）——一种能够形成G4结构的15个核苷酸的DNA序列。B-CeP响应性鸟嘌呤与B-CeP 1反应后生成的产物，可通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在单核苷酸水平上进行分辨，从而定位单个烷基化加合物以及在烷基化鸟嘌呤位点发生的DNA链断裂。利用B-CePs进行图谱分析是一种简单而强大的工具，可用于体外（in vitro）表征能够形成G-四链体的DNA序列，精确定位参与G-四分体形成的鸟嘌呤位置。

引言

除了典型的沃森-克里克双螺旋结构外，由于富含鸟嘌呤的序列，核酸还可形成多种二级结构，例如替代性的G-四链体（G4）结构。G4结构基于平面四聚体（称为G-四联体）的形成，其中四个鸟嘌呤通过霍格斯滕氢键相互作用。G-四联体堆叠在一起，并由位于鸟嘌呤核心中心配位的单价阳离子进一步稳定（图1）¹。

图1：G-四联体结构的示意图。（A）G-四联体的示意图。该平面结构通过Hoogsteen碱基配对以及中心阳离子（M⁺）稳定。

方案

1. 核酸与化学探针的制备

1. 核酸
   注意：名为 "TBA" 的寡核苷酸是一条15个碱基的DNA序列，序列为5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'，其3'端用荧光染料5-羧基荧光素（FAM）标记，以便在凝胶中可视化。未标记的寡核苷酸 "cTBA" 是其互补DNA序列，序列为5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'。TBA和cTBA用于获得三种不同的结构，如表1所示。
   1. 对枪头和0.5 mL离心管进行高压灭菌，以获得无菌耗材并避免污染。
   2. 将每种寡核苷酸溶于超纯水中，配制为终浓度100 µM的储备液。使用紫外-可见（UV-Vis）分光光度计测定寡核苷酸的确切浓度，并采用生产商提供的260 nm处的消光系数。
      注意：TBA和cTBA的消光系数分别为164,300 M^-1 cm^-1和138,600 M^-1 cm^-1。
   3. 将TBA和cTBA的储备液储存于-20 °C（在此条件下可保存数月）。
2. 化合物B-CeP 1
   注意：化合物B-CeP 1的合成方法如先前文献⁶所述。
   1. 配制浓度约为10 mM....

结果

图2 展示了按照本方案所述，使用 B-CeP 1 对具有三种不同结构的 TBA 寡核苷酸进行化学图谱分析实验的代表性结果。TBA 的 G-四链体构型（G4-TBA）是通过在 BPE 缓冲液中并存在 K⁺ 阳离子的条件下折叠寡核苷酸获得的，而相同 TBA 序列的单链形式（ssTBA）则是在无钾离子条件下折叠形成的。双链结构（dsTBA）是通过将 TBA 与其互补序列在 BPE 缓冲液中退火制备而成。将 B-CeP 1 以 5 或 50 µM 的终浓度分别与 2 µM 的 G4-TBA（图2B 左侧泳道）、ssTBA（图2B 中间泳道）和 dsTBA（图2B 右侧泳道）反应 1 h、4 h 和 15 h。额外的对照组为未与探针反应的 DNA 构建体。对三种不同折叠形式的 TBA 进行的圆二色性（CD）分析证实了其正确的结构（补充图 S1）。事实上，d.......

讨论

G-四链体是一类通常在富含鸟嘌呤的DNA序列中折叠形成的核酸二级结构，因其与基因调控及疾病密切相关，已成为重要的研究对象。利用B-CePs进行化学图谱分析是一种用于表征DNA G-四链体的有效方法，可在生理盐条件下鉴定参与G-四分体形成的鸟嘌呤碱基。

本方案中使用的化学探针为 B-CeP 1（图 2A），该探针可特异性地与鸟嘌呤碱基的 N7 位点发生反应，从而区分参与形成 G-四链体四联体结构的鸟嘌呤与未参与此类结构的鸟嘌呤。事实上，G-四联体中鸟嘌呤之间的 Hoogsteen 氢键作用（图 1）会阻碍探针与其发生反应。探针反应产物通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离（图 2B），这是一种实验室常规可及的方法，广泛用于检测 DNA 序列中的烷基化加合物及切割位点。此外，使用荧光标记的 DNA 序列可使实验在安全条件下进行，避免使用放射性标记的核酸以及传统的嵌入染料染色步骤。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
过硫酸铵（APS）	Sigma Aldrich	A7460
分析天平	Mettler Toledo
高压灭菌器	pbi international
硼酸	Sigma Aldrich	B0252
溴酚蓝 亮蓝 R	Sigma Aldrich	B0149
十二水合磷酸氢二钠	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA 寡核苷酸	Integrated DNA Technologies	定制序列合成
乙二胺四乙酸二钠	Sigma Aldrich	E5134
甲酰胺	Fluka	40248	H351-360D-373
凝胶成像系统	GE Healtcare	STORM B40
甘油	Sigma Aldrich	G5516
0.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72.704
氯化钾	Sigma Aldrich	P9541
测序仪	Biometra	Model S2
硅烷化溶液 I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
磷酸二氢钠	Carlo Erba	480086
真空浓缩仪	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
尿素	Sigma Aldrich	51456
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	Nanodrop 1000