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一种用于评估小鼠心力衰竭模型中心率依赖性舒张功能的起搏控制方法

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DOI：

10.3791/65384

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2023年7月21日

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Therapeutic Strategy for Heart Failure, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins Medical Institutions

本文内容

摘要

本方案描述了通过经食管起搏获取压力-容积关系的方法，该方法在评估心力衰竭小鼠模型舒张功能方面具有重要价值 。

摘要

射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）是一种以舒张功能障碍和运动不耐受为特征的临床综合征。尽管在人类中可通过运动负荷血流动力学检测或磁共振成像（MRI）来识别舒张功能障碍并诊断HFpEF，但在基于小鼠模型的基础研究中，这些技术的应用受到限制。 treadmill运动试验虽常用于小鼠，但其结果易受体重、骨骼肌力量及精神状态的影响。本文介绍一种心房起搏实验方案，用于检测心率（HR）依赖性的舒张功能变化，并在HFpEF小鼠模型中验证该方法的有效性。该方法包括麻醉、气管插管，并在心房起搏的同时进行压力-容积（PV）环分析。本研究中，将导电性导管插入 通过 采用左心室心尖入路，并将心房起搏导管置于食管内。在使用伊伐布雷定减慢心率之前，采集基线压力-容积环（PV环）。随后在心率从400次/分钟逐步增加至700次/分钟的不同梯度下采集并分析PV环 通过 心房起搏。通过该方案，我们清晰地展示了在代谢诱导的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）模型中存在心率依赖性的舒张功能障碍。与对照组小鼠相比，随着心率升高，舒张时间常数（Tau）和舒张末期压力-容积关系（EDPVR）均显著恶化。总之，这种可控的心房起搏方案有助于检测心率依赖性的心脏功能障碍，为研究HFpEF小鼠模型中舒张功能障碍的潜在机制提供了新方法，并可能有助于开发针对该病症的新疗法。

引言

心力衰竭是全球范围内导致住院和死亡的主要原因，其中射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）约占所有心力衰竭诊断病例的50%。HFpEF的特征是舒张功能障碍和运动耐受能力受损，相关的血流动力学异常（如舒张功能障碍）可通过运动负荷血流动力学检测或磁共振成像（MRI）扫描明确检出1,2。

然而，在实验模型中，可用于评估与射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）相关的生理异常的方法有限3,4。跑步机运动试验（TMT）可用于测定跑步时间和距离，这些指标可能反映运动应激状态下的心脏血流动力学；然而，该方法易受体重、骨骼肌力量和精神状态等混杂因素的干扰。

为了克服这些局限性，我们设计了一种心房起搏方案，该方案能够基于心率（HR）检测舒张功能中细微但关键的变化，并已在HFpEF小鼠模型中验证了其有效性5。多种生理因素参与调控运动相关的心脏功能，包括交感神经与儿茶酚胺反应、外周血管舒张、内皮反应以及心率6。在这些因素中，心率-压力关系（也称为Bowditch效应）被认为是决定心脏生理特征的关键因素之一7,8,9。

该方案包括在基线状态下进行常规的压力-容积分析，以评估收缩功能和舒张功能，相关参数包括压力上升速率（dp/dt）、收缩末期压力-容积关系（ESPVR）以及舒张末期压力-容积关系（EDPVR）。然而，应注意这些参数会受到心率（HR）的影响，而不同动物由于其固有心率的差异，心率可能存在变化。此外，还应考虑麻醉对心率的影响。为解决这一问题，通过同时给予静脉注射伊伐布雷定并实施心房起搏来标准化心率，并在逐步增加的心率条件下进行心脏参数的测量。值得注意的是，在不同心率条件下的心脏反应能够区分射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）小鼠与对照组小鼠，而在基线状态（使用固有心率）下的压力-容积环测量中未观察到显著差异5。

尽管该起搏方案看似相对复杂，但只要充分理解，其成功率可超过90%。该方案为研究HFpEF小鼠模型中舒张功能障碍的潜在机制提供了一种有效方法，并有助于开发针对该病症的新疗法。

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方案

本动物实验方案经机构动物护理和使用委员会批准，并遵循东京大学关于动物实验及相关活动的规定。本研究采用8至12周龄雄性C57/Bl6J小鼠，动物购自商业来源（见材料表）。通过连续15周给予高脂饮食联合NG-硝基-L-精氨酸甲酯建立HFpEF模型，具体方法如先前文献所述10。

1. 导管准备及压力/容积校准

  1. 将导纳导管置于生理盐水中，并连接至由 PowerLab 8/35 和压力-容积单元（MPVS 模块，参见材料表）组成的模块。
  2. 通过在 MPVS 模块上记录预设的压力（0 mmHg 和 100 mmHg）和容积参数（不同 MPVS 模块的参数值有所不同）对压力和容积进行电子校准3,11 （另请参阅制造商说明书）。

2. 准备用于插管的动物

  1. 麻醉与通气
    1. 在插管前 5-10 分钟，腹腔注射 5 mg/kg 依托咪酯和 500 mg/kg 水合氯醛（参见材料表）。
      注意：水合氯醛在动物实验中虽具有良好的麻醉效果，但被怀疑对人类具有致癌性。因此，仅当实验目的必须使用水合氯醛且无其他替代药物可用时，方可谨慎使用。操作时必须采取适当的防护措施，例如佩戴手套和口罩，并在通风橱中进行配制。可能的替代方案是使用氯胺酮（80 mg/kg，腹腔注射）。
    2. 将小鼠置于先前已充满 2% 异氟烷的麻醉舱内，待其进入麻醉状态后，立即转移至预热至 38 °C 至 40 °C 的加热垫上。
    3. 剃除手术区域毛发，随后使用聚维酮碘和酒精交替消毒手术部位三次。
    4. 在颈部做一横向切口（1-2 cm），切除气管周围肌肉组织以暴露气管。将一根外科 2-0 丝线穿过气管下方，提起气管，并在其上做一小切口（1-2 mm）以打开气管。
    5. 将气管插管插入气管，并连接至呼吸机，通入含 100% 氧气和 2% 异氟烷的混合气体（后续可将异氟烷浓度降低至 0.5% 至 1%）。
  2. 中心静脉（CV）导管插入与液体注射
    1. 在胸锁乳突肌下方定位颈内静脉3。
    2. 将中心静脉导管（由 PE-10 硅胶管（参见材料表）连接至 30 G 针头组成）插入颈内静脉。
    3. 在 3 分钟内快速推注 10% 白蛋白/氯化钠溶液，剂量为 5-6 µL/g 体重，随后以 5-10 µL/min 的速率持续输注。
      ​注意：此步骤对于预防因麻醉引起的外周血管扩张所导致的低血压至关重要。颈内静脉位于胸锁乳突肌与颈动脉之间，颜色较动脉更深。

3. 左心室插管手术操作（开胸法）

  1. 剃除麻醉小鼠手术区域的毛发，然后用碘伏和酒精交替消毒手术部位三次。
  2. 通过夹捏脚趾确认麻醉深度，随后在剑突下方做一水平切口（2–3 cm），并用钝头剪刀将皮肤与胸壁分离。
  3. 使用电灼器从两侧横向切开胸壁（参见材料表）。
  4. 切开膈肌暴露心脏，并用镊子轻轻去除心脏表面的心包膜。
  5. 将27 G针头插入左心室（LV）心尖部，并通过穿刺孔逆行插入导管式导纳导管至左心室via该穿刺孔。
  6. 调整导管位置，以获得方形的压力-容积环。
  7. 在下腔静脉（IVC）阻断期间，通过观察压力-容积环的形状变化，确认导管在负荷条件改变时未接触乳头肌。
    ​注意：充分暴露心脏有助于操作，并可获得清晰的视野。

4. 记录PV环数据并确定收缩末期压力-容积关系（ESPVR）和舒张末期压力-容积关系（EDPVR）

注意：通过下腔静脉阻断减轻前负荷，可测定收缩末期压力-容积关系（ESPVR）和舒张末期压力-容积关系（EDPVR）。

  1. 在插管后5-10分钟信号稳定后，使用LabChart软件（参见材料表）、PowerLab和MPVS模块记录并分析基线压力-容积（PV）环。
  2. 通过镊子压迫下腔静脉（IVC）进行IVC阻断，并在IVC阻断期间至少记录20个心动周期的PV环。使用LabChart软件，通过将线性回归线拟合至PV环的收缩末期各点来确定收缩末期压力-容积关系（ESPVR），并通过将曲线拟合至舒张末期各点来确定舒张末期压力-容积关系（EDPVR）。
    ​注意：在IVC阻断期间应停止呼吸机，以防止肺部运动伪影。当肺部运动明显时，可使用如潘库溴铵（0.5-1 mg/kg）等肌松剂，但仅可在确认麻醉深度稳定后使用。

5. 经食管起搏

  1. 将一根2-Fr四极电极导管插入食管，将导管连接至脉冲刺激器（参见材料表），并确定心房起搏阈值（通常刺激幅度为3 mA，脉冲宽度为1 ms）。
  2. 通过腹腔注射20 mg/kg的伊伐布雷定（参见材料表），将心率减慢至400次/分钟以下。
  3. 待状态稳定后，在起搏频率从400次/分钟至700次/分钟、以100次/分钟为增量的不同起搏频率下，每个频率持续5分钟，分别采集20个连续的心脏搏动周期的压力-容积环（PV环）。

6. 生理盐水校准和主动脉血流校准

  1. 关闭呼吸机，并通过中心静脉导管静脉注射 5–10 µL 高渗盐水溶液。
  2. 记录注射盐水期间压力和容积的变化，并使用 PowerLab3,11 计算 Vp 值。
  3. 重复进行盐水校准，以提高准确性和可重复性。
  4. 将小鼠转向左侧卧位，以避免干扰容积信号。
  5. 在 Th3 至 Th5 椎体之间向脊柱方向做侧胸切口，并用镊子轻轻分离降主动脉的一小部分。
  6. 将血管血流探头（见材料表）放置于主动脉上，以测量心输出量。
    ​注意：准确计算绝对容积需要两种校准方法：盐水校准和主动脉血流校准。需注意在动物实验中高渗盐水输注可能带来的潜在风险，过量的盐负荷可能导致心肌收缩力下降。

7. 安乐死

  1. 实验结束后，通过麻醉过量处死小鼠 通过 颈椎脱位
    注意：为确保生命功能完全停止，需采用第二种安乐死方法，例如在麻醉下放血并随后采集心脏组织。

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结果

基线PV环数据如图1和表1所示。在基线状态（未起搏时），对照组与HFpEF小鼠在舒张期参数方面无显著差异，包括舒张时间常数（Tau）、最小压力变化率（dP/dt min）以及EDPVR。然而，如图1所示，HFpEF小鼠表现出更高的血压和动脉弹性（Ea），并在心室收缩期呈现典型的山形PV环。此形态应与因心室肌直接接触压力传感器所引起的尖峰相区分（图2）。重要的是，通过心房起搏，可清晰区分对照组与HFpEF小鼠的舒张功能5（图3和图4）。在对照组中，随着起搏频率增加，Tau和EDPVR均有所改善；而在HFpEF组中，随着心房起搏导致心率升高，Tau和EDPVR均恶化。

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讨论

我们提出了一种通过经食管起搏来评估压力-容积关系的方法。运动耐力下降是射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的关键特征之一，但目前尚无可用于评估小鼠运动过程中心脏功能的技术。我们的起搏方案为检测在静息状态下可能不明显的心室舒张功能障碍提供了一种有价值的工具。

为获得准确且稳定的压力-容积环（PV环），必须严格遵循以下步骤3,4,5,7,8,11,12,13,14：（1）需谨慎麻醉动物，并...

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致谢

本研究得到了福田医疗技术基金会（资助编号：E.T. 和 G. N.）以及日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI 21K08047，资助编号：E.T.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-0 丝线缝合线，无菌日本大阪 Alfresa Pharma Corporation62-9965-57手术用品
2-Fr 四极电极导管日本 Fukuda Denshi 和日本 UNIQUE MEDICAL定制的手术用品
牛血清白蛋白日本京都，Nacalai Tesque, Inc.01859-47其他
C57/BL6J 小鼠杰克逊实验室动物
导纳导管Millar Instruments，休斯顿，德克萨斯州PVR 1035
电烙器，电烙刀套装ellman-Japan，日本大阪1-1861-21外科手术用品
依托咪酯东京化学工业株式会社，日本东京E0897麻醉剂
Grass Instrument S44G 方波脉冲刺激器Astro-Med，西沃里克，罗得岛州起搏设备
异氟烷Viatris Inc.，日本东京8803998麻醉剂
伊伐布雷定东京化学工业株式会社，日本东京I0847其他
LabChart 软件ADInstruments，悉尼，澳大利亚LabChart 7血流动力学设备
MPVS UltraMillar Instruments，休斯顿，德克萨斯州PL3516B49血流动力学设备
Pancronium bromideSigma Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市15500-66-0麻醉剂
PE10 聚乙烯管生物研究中心  株式会社，日本东京62101010手术用品
PowerLab 8/35ADInstruments，悉尼，澳大利亚PL3508/P血流动力学设备
PVR 1035Millar Instruments，休斯顿，德克萨斯州842-0002血流动力学设备
氨基甲酸乙酯（乙基氨基甲酸酯）日本大阪市和光纯药工业株式会社050-05821麻醉剂
血管血流探针Transonic，纽约州伊萨卡MA1PRB手术用品

参考文献

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