对活体组织进行实时分析可获得重要的功能性和机制性数据。本文介绍了利用一种新型无泵多通道流体系统维持并评估多种组织和细胞模型的实验方案及关键变量，以确保所获取数据的准确性和可重复性。
本文内容
摘要
摘要
许多用于研究组织功能和细胞生物学的体外模型需要培养基流动，以提供充分的氧供和维持细胞功能与存活所需的最适条件。为此，我们开发了一种多通道灌流培养系统，可用于在培养过程中维持组织和细胞，并通过在线传感器和/或收集流出液组分，持续评估其功能与存活状态。该系统结合了八通道连续光学氧消耗率检测与内置的组分收集器，可同时测定代谢物生成速率和激素分泌水平。尽管该系统适用于维持和评估多种组织与细胞模型（包括胰岛、肌肉和下丘脑），但本文重点介绍其工作原理以及我们用于研究分离的小鼠视网膜、小鼠视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜-巩膜复合体和培养的人RPE细胞生物能量调控的实验准备与操作方案。系统设计上的创新，例如无泵驱动的液体流动，显著简化了多通道灌流系统的操作。视频和图像展示了如何组装仪器、为实验做准备，以及将不同类型的组织/细胞模型装入灌流腔室的过程。此外，文中还阐明并讨论了针对不同实验方案和组织类型的实验条件选择指南，包括设定合适的流速与组织比例，以获得稳定一致的培养条件，并准确测定物质消耗与生成速率。通过优化组织维持条件并实时监测多个参数，该系统可产生信息量丰富的数据集，对眼生理学研究以及治疗视力障碍的药物研发具有重要应用价值。
引言
灌流系统在生命科学领域有着悠久的历史。特别是对于胰岛分泌功能的研究，该系统已被用于表征胰岛素在促分泌剂刺激下的分泌动力学1。除了收集流出液用于后续激素和代谢物的测定外，研究中还整合了实时传感器，主要用于检测耗氧量2,3,4。目前，由于缺乏生理相关的方法来评估眼部各分离组分（包括视网膜、视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜-巩膜复合体以及培养的RPE细胞）的代谢调控与失调机制，导致人们对眼部疾病相关机制的深入研究受到限制。虽然原本为培养细胞设计的静态系统已被改造用于组织研究5，但组织需要持续灌流以实现充分的氧供。流动系统已成功实现了对视网膜及RPE-脉络膜-巩膜组织耗氧速率（OCR）的实时、准确且可重复的测量，并且组织可在超过8小时的时间内保持代谢稳定，从而支持包含多种测试化合物的高信息量实验方案4,6,7,8,9。然而，流体系统以往的操作通常依赖于定制设备以及掌握非标准化技术方法的技术人员，因此这类系统尚未在大多数实验室中成为标准方法。BaroFuse是一种新开发的流体系统，无需使用泵，而是利用气体压力驱动液体流经多个通道和组织腔室（图1）。每个通道均可持续监测OCR，流出液则通过基于微孔板的组分收集器进行收集，以便后续分析其成分。重要的是，该仪器的组织灌流腔室设计可兼容不同几何形状和尺寸的组织样本。
仪器的核心是流体系统，流体由一个密封的加压储液罐驱动，经过内径较小（ID）的管路（在流体回路中产生最主要的流动阻力），向上流入容纳组织的玻璃组织腔室。向培养基储液模块（MRM）供压由连接至混合气体气瓶（通常为21% O₂）的低压和高压调节器提供。2，5% CO₂2，平衡 N2），并通过顶部的灌流室模块（PCM）密封，该模块容纳组织室组件（TCA）。流速由阻力管的长度和内径以及低压调节阀的压力设定控制。连接至组织室顶部的流出管将液体导入废液容器（通过持续称重自动测定流速）或由组分收集器控制的96孔板的孔中。O2 检测系统测量O的寿命2-敏感染料涂布于组织下游每个玻璃组织腔的内侧。该信息随后用于持续计算耗氧率（OCR）。整个流体系统位于温度控制的封闭环境中，气体罐、组分收集器和计算机是该仪器的主要组成部分。图2A）。最后，运行仪器的软件用于控制其操作（包括注入测试的准备和时序） 化合物、流速测量系统和组分收集器定时，以及OCR数据和其他补充测量数据的处理与绘图。
本文介绍了利用流体系统对眼组织的各个分离组分进行灌流并测定其耗氧率（OCR）和乳酸生成率（LPR）的实验方案。LPR 是反映糖酵解速率的参数，与 OCR 高度互补，二者共同代表了细胞内碳水化合物能量生成的两条主要途径10。由于组织制备及将其装入组织腔室的操作通过观看视频学习效果更佳，因此视频内容将有助于展示在系统设置和操作过程中一些难以仅通过文字描述清楚的关键步骤。
该实验方案的描述分为8个部分，分别对应实验的不同阶段（图2B）：1. 实验前准备；2. 灌流液的准备/平衡；3. 仪器安装；4. 组织平衡；5. 实验方案；6. 仪器拆卸；7. 数据处理；8. 流出液组分的检测。
方案
所有从大鼠和小鼠采集组织的实验程序均经华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 实验前准备
注意：以下任务需至少在实验前一天完成。
- 设计实验方案
- 通道中组织的放置分配：选择要放置在MRM每侧4个通道中3个通道内的组织或细胞模型。每侧的一个组织腔不放置组织，用于基线校正。
- 使用以下两种典型设计之一来安排样本——两侧采用不同的测试化合物方案（例如，MRM一侧的通道接受测试化合物，而另一侧的通道作为对照）；MRM两侧采用相同的测试化合物注射方案，但两侧的组织或组织模型不同，或一侧为实验组、另一侧为对照组。
- 选择最佳OCR测量的流速和组织量： 调节流速，直到寿命比的变化值乘以100约为3。
注：对于眼部各组成部分，表1列出了典型的组织用量及相应的流速，仪器在6–80 µL/min/通道的流速范围内性能最佳。 - 计算所需培养基/缓冲液体积：计算实验开始时需加入每个MRM插入件的培养基体积，公式如下：
体积MRM = 30 mL + 实验方案持续时间（分钟）× 流速（mL/min）× 4 通道（公式1）
例如，在0.01 mL/min流速下，起始体积MRM为60 mL时，可支持12.5小时的实验方案（其中30 mL被消耗，剩余30 mL）；而在0.04 mL/min流速下，起始体积MRM为90 mL时，可支持6小时的实验方案（剩余30 mL）。 - 测试化合物注射方案： 选择待评估的测试化合物、测试浓度（通常选择接近最大反应的浓度或进行浓度依赖性测试）以及暴露时间。考虑溶解度，并使用合适的溶剂（如水、DMSO或乙醇）配制储备液 。
- 选择注射时机及后续注射时间，确保在加入下一个试剂前反应已达到稳态。重复实验时，应保持注射时间一致，以便对多个时间过程的数据进行平均处理。
注：本实验所用化合物来自先前的线粒体（Mito）应激测试11，其中寡霉素（oligomycin）和羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）均需在储备液及最终灌注液中使用DMSO作为溶剂。 - 流出液采样时间点： 选择所需的分段收集间隔（1–60分钟/样本），快速变化时采用较短的采样间隔，接近稳态时采用较长的时间间隔。使用足够容量的收集管（0.3至1.5 mL），以避免在采样间隔期间发生溢出（选择的体积应大于流速×时间间隔）。
注：采样时间点根据实验方案而异，对于线粒体应激测试，我们通常在基线期使用5分钟间隔，在注射期间使用15分钟间隔（-15、-10、-5、0、15、30、45、60、75、90、105，每个时间点代表采样间隔的起始时刻）。 - 将上述选定的测试化合物信息和分段收集参数输入用户界面（UI），系统将生成这些信息的图形化表示。导出文件并分发给团队进行评估和讨论（补充图1）。
- 准备配件和耗材
- 取出制造商提供并已预包装灭菌的物品，包括：组织连接器（TCA，每包8个）、流出管组件（每包8根）、测试化合物注射管（2根）、镊子、管夹（3个）、MRM主体、MRM插入件（2个）、搅拌子（2个）以及排气管组件（置于生物安全柜内）。
- 切勿重复使用与液体接触的一次性耗材，否则将增加实验失败的风险。镊子和搅拌子可在实验间通过清洗和高压灭菌后重复使用。
2. 灌流液的制备与平衡（时间：30 分钟，不含孵育时间）
- 根据公式1的计算结果，在实验前一天配制培养基或Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRB），通常配制200 mL，并在39 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育，使用T225细胞培养瓶，每瓶液体体积不超过90 mL。
- 若使用市售的KRB或培养基（已预热至室温），则在实验当天早晨配制灌流液，并置于5% CO2培养箱中至少1小时。所有溶液均需无菌操作配制。
注意：所有与液体接触的液体试剂及流体系统部件在实验开始时均为无菌状态。然而，系统的组装及组织装载步骤在开放环境中进行。
3. 仪器设置中的温度与溶解气体平衡（时间：75 分钟）
- 将管路组件连接至 MRM
- 将 MRM 和一个流体包放置在仪器旁边的实验台上。确保工具托盘上已放置管夹（3）、搅拌子（2）和镊子。
- 在 MRM 的每一侧放入一个未使用且带有搅拌子的 MRM 插件（见图 3）。
- 将测试化合物注入组件（TCA）连接至 MRM 两端的进样口，使管路末端正对搅拌子上方。确保两个测试化合物注入组件中较长的一根位于 MRM 的背面。
- 接下来，将气体进气管路和吹扫管路组件分别连接至背面和前面的空闲端口（见图 4A）。
- 将 MRM/管路组件放入 enclosure 中
- 将已连接管路组件的 MRM 放入 MRM 加热器中（图 4B）。
- 将四组管路组件分别放入 enclosure 底座内壁的凹槽中（每侧两个），以便在中间 enclosure 安装到位后，管路可从 enclosure 外部伸出。
- 通过拧紧检测器支架上的两个旋钮，将 MRM 固定在夹具之间。
- 将从 enclosure 背面伸出的较长测试化合物注入组件穿过 enclosure 侧面的两个导管导向装置，使管口朝向前方（图 4C）。
- 夹紧每个封闭的测试化合物注入组件。
- 组装 enclosure 并启动温度控制器
- 将为 enclosure 内所有电气设备供电的电源插座 切换至开启位置 。检测器支架上的风扇将启动，MRM 温度控制器应亮起并显示设定值为 38 °C（图 5）。
- 使用用户界面（UI）将搅拌器开启至 70 rpm，以确保搅拌子平稳旋转。观察到正常搅拌后，关闭搅拌器。
- 将 enclosure 的中段部分放置在底座上方。
- 将 enclosure 中段的电缆连接至电气箱的电缆，以接通环境温度控制器杠杆开关的电源，并为环境温度加热器供电。
- 盖上 enclosure 的顶盖，上方温度控制器（即环境温度控制器）的显示屏将亮起并显示 36 °C。启动计时器，计时 30 分钟，这是 MRM 加热器达到设定温度所需的时间。
- 将 TCAs 插入 PCM
- 使用 TCA 插入工具，通过插入工具的端面用力按压适配器，将 8 个 TCAs 逐一插入 PCM 的孔中，直至包裹组织腔室的管套顶部接触到 PCM 孔周围表面为止。
- 在插入下一个 TCA 前，必须完全插入一个 TCA。将部分组装好的 PCM 放置在一旁，靠近 PCM 支撑架和 6 颗螺丝。
注意：TCA 插入不完全将导致顶空无法达到设定压力，灌注液将无法流动。
- 用预平衡灌注液填充 MRM 中的两个插件
- 在 enclosure 组装完成且 MRM 达到设定温度 30 分钟后，使用 50 mL 移液器沿插件内壁轻轻加入预平衡灌注液，将其转移至预加热的 MRM 插件中。
注意：这些步骤以及第 3.6 节中的步骤应立即执行，以避免 MRM 中的灌注液与大气之间发生气体交换。
- 在 enclosure 组装完成且 MRM 达到设定温度 30 分钟后，使用 50 mL 移液器沿插件内壁轻轻加入预平衡灌注液，将其转移至预加热的 MRM 插件中。
- 组装 MRM/PCM 以形成气密密封，并定位 O2 检测器
- 通过将 PCM 底部引出的 TCA 阻力管插入 MRM 插件中（MRM 分隔板每侧各 4 个），将 PCM 放置在 MRM 上。调整 PCM 方向，使其组织腔室在定位后可紧贴 O2 检测器。
- 使用电动螺丝刀，用 6 颗螺丝固定 PCM 和 PCM 支撑架。
- 使用提供的弹性带，将其拉伸环绕 PCM 支撑鳍片的橡胶垫圈位置，以固定 PCM 支撑鳍片内的 TCAs（图 6）。
- 将 O2 检测器放置在检测器支架上，使其端面紧贴 PCM 的鳍片。检查 LED/光电探测器对是否与组织腔室中的 O2 敏感染料对齐。如有需要，在松开 O2 检测器支架侧面的紧定螺钉后，调整 O2 检测器的横向导向装置。
- 将顶盖盖在 enclosure 上。
- 使 MRM 顶空中的气体与灌注液达到平衡
- 在高压阀完全锁紧并关闭的情况下，逆时针旋转气瓶顶部的阀门以打开气瓶阀。
- 使用调节器上的旋钮，将高压调节器调整至 10 psi 的压力。
- 通过将低压调节器设定为 1.0 psi 来对 MRM 加压（图 7A）。
- 松开吹扫管路（图 7B），使气瓶中的气体在 15 分钟内置换 MRM 顶空中的空气（测试化合物注入器保持夹闭状态）。通过将吹扫管末端浸入盛水烧杯中观察气泡，确认气体流动。
- 确认气体流动后，按照下文第 3.8 节所述启动 O2 检测器。
- 15 分钟后，将搅拌器开启至 70 rpm，并在整个实验剩余时间内保持运行。再经过 15 分钟后，夹闭吹扫管路组件（图 7C）。
- 将低压调节器的压力降低至操作压力，以达到所需的液体流速（由实验包指定，通常在约 0.5–0.7 psi 之间）。如果流速超过 20 µL/min，可暂时将压力设为 0.3 psi，以便有足够时间加载组织而不会导致腔室溢出。若在夹闭后 15 分钟内完成组织加载，则此步骤非必需。
注意：切勿让缓冲液沿组织腔室外壁流下，因为液体可能干扰 O2 检测。
- 启动 O2 检测器
- 通过点击标记为 氧气检测器 的图标，在笔记本电脑上启动 O2 检测器软件。
- 程序启动后（补充图 2），确认已选择正确的 COM 端口。如有需要，可通过拔下并重新插入 O2 检测器与计算机的连接来识别 COM 端口，此时端口号将显示出来。若在应用程序运行期间拔下 COM 端口，则必须先关闭并重新打开应用程序才能继续使用。
- 点击 开始，然后点击 记录（并将数据保存至备份文件夹）。接着点击 图表。
- 将寿命图左下角的平均值更改为 5（指示程序使用连续 5 个数据点计算移动平均值）。一分钟后，当第一个数据点显示在图表界面上时，点击 自动缩放。
4. 组织加载与平衡期（时间：90 分钟）
- 将烧结玻璃滤片置于组织培养室中
- 移除 enclosure 的顶盖和中间部分。
- 当组织室中的灌流液上升至预置烧结滤板顶部后，用滤板推杆轻轻敲击滤板顶端，将滤板下压，以排除滞留在滤板下方或内部的气泡。
- 将滤片置于组织室底部约0.25英寸上方。
- 将组织装入组织腔室
- 当培养基液面距离顶部0.5英寸时，将组织装入腔室。
- 加载视网膜或视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜：按照前述方法收获视网膜或视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜 6使用精细尖头镊子轻轻将组织放入每个腔室中，注意不要折叠组织，同时使用拭纸防止组织腔室中的液体滴落到O上2 传感器。观察组织下沉并附着到烧结环上。
注意：在收获组织至将组织装入腔室期间，应避免组织受到损伤，确保组织在取出培养箱后于碳酸氢盐缓冲液/培养基中放置不超过10分钟，并保证组织浸没在足量的缓冲液/培养基中（至少1 mL/10 mg组织），以防止组织缺氧并避免暴露于空气中。 - 将RPE细胞接种至Transwell膜上：按照先前所述方法制备RPE细胞 12 以及在 补充文件 1使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并将细胞接种于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）径迹蚀刻膜（细胞培养小室，孔径0.4 mm）上，接种密度至少为2.0 × 105 细胞/厘米²2实验当天，将膜切成三条等宽的条带，用镊子夹取并装入组织培养室中（参见 图8A).
- 将流出管路组件连接至组织腔室
- 从包装中取出流出管路组件，并将流出管路分离器放置于 enclosure 中段边缘，使流出管路接头位于 enclosure 内侧（图8B，C).
- 小心操作，避免对TCA施加过大压力（否则TCA会从MRM上松脱），将流出管路接头安装到组织腔室TCA的顶部图8D更换围护结构的中部，并重新连接环境温度控制电缆。
- 在更换 enclosure 的盖子之前，确认 enclosure 内部流体系统组件（包括 O2 检测器、PCM、组织腔室、流出管、MRM 和加热器均按图示正确放置 图8E.
- 更换封闭装置的盖子。将八根流出管穿过馏分收集器导管臂。
- 启动组分收集器
- 确保组分收集器相对于 enclosure 的右壁和流出管支架居中：组分收集器底座的左侧支撑应紧贴 enclosure 壁的边缘。
- 在笔记本电脑上，单击 用户界面 快捷方式，实验信息页面将会打开（补充图3 顶部。
- 在实验信息页面的相应字段中填写信息（可在实验开始前完成），然后点击 流式 & 组分收集器 顶部页面（补充图3 底部。
- 设定自动流量测量参数
- 在顶部中央的“样本采集时间”下拉菜单中，选择合适的积分时间，以在所需的准确性（与积分时间成正比）和时间分辨率之间取得平衡。
- 如果实验中不收集流出组分，则点击“开始”，并进入第4.7节。如果需要收集流出组分，则执行第4.6节中的步骤。
- 收集流出液组分
- 在UI软件中，检查 收集组分？ 实验信息页面或流程中的框 & 组分收集器页面。然后点击 计算 FC 设置 按钮
- 当新窗口打开时，在方案中填写首次注射的时间（定义为时间 = 0）、每通道的流速，以及每个样品的时间间隔，然后点击 计算.
- 确认收集间隔后，单击 生成并启动.
- 测量各通道的流速（可选）
- 若需测量各通道的流速（在正常条件下，流速差异通常仅为百分之几），请称量八个（或更少）微量离心管，并记录其重量。
- 将装有预先称重的微量离心管的试管架放置在板架上。点击 手动测量流速 在其他工具部分。
- 选择测量时长，然后单击 生成模板关闭窗口并单击 开始馏分收集器将在测量持续时间内从流出管收集液体，然后机械臂将返回初始位置。
- 收集后称量微量离心管，用重量差值除以测量时长来计算流速（其中 1 mg = 1 µL）。
- 基线稳定化
- 将组织和/或细胞加入组织室后，让系统平衡 90 分钟，以建立稳定的 O₂ 基线2 消耗完毕时，可注射第一种测试化合物（此时间点记为时间 = 0）。
- 在首次注射前30分钟，将每个通道最近3次FR的平均值输入至注射页面，用于准备测试化合物的注射。
5. 实验方案（时间：2-6 小时）
注意：一旦基线稳定开始，接下来的任务是注入待测化合物，并在使用多个收集板时更换组分收集器上的收集板。
- 准备测试化合物注射液
- 在“注射”页面的用户界面表格中输入测试化合物的名称、所需浓度（终浓度和储备液浓度）以及注射时间。确认程序中显示的信息，包括注射时微流控反应模块（MRM）中剩余的灌流液体积，以及为达到目标浓度所需注射的储备液体积（补充图4）。
- 为计算每次注射所需的灌流液和储备液量，请填写注射表格中的空白区域，然后点击计算。根据计算出的 数值，在注射前用灌流液稀释测试化合物储备液，使注射体积为注射后MRM中总体积的5%。
- 通过混合储备液与灌流液制备每种测试化合物。在预定注射时间前至少10分钟将溶液装入注射器，并置于CO2培养箱中（温度维持在37–40 °C），直至准备注射。
- 注射测试化合物
- 将装有测试化合物的注射器连接至注射管路（图9A）。松开通向注射管路的软壁药用级 tubing，以约3 mL/min的速度缓慢注入测试化合物（图9B）。注射完成后，重新夹闭注射管路上的tubing，然后取下注射器（图9C）；对MRM的另一侧重复相同操作。
- 每次注射测试化合物后，根据用户界面“注射”页面的指示，准备下一种待注射的测试化合物。
- 测定每个通道的进流O2信号
- 每次实验结束时，注射呼吸抑制剂KCN（3 mM），以测定每个通道的进流寿命信号，该信号用于校正基线传感器寿命的差异以及非线粒体耗氧量的影响。
6. 结束实验并拆解系统（时间：30 分钟）
- 保存氧气数据
- 点击 保存 单击氧气检测软件图形窗口左上角的按钮；为文件命名并保存至指定文件夹中。单击 停止录制 单击主窗口上的按钮以保存备份文件。
- 保存用户界面实验信息文件
- 点击 保存配置文件 单击用户界面主页面左上角的按钮；为文件命名并将其保存至指定文件夹中。在组分 & 用户界面的流程页面，点击 工具 下拉菜单，然后 保存保留生成的名称或另选名称，并将文件保存至所需位置。如有需要，可访问并保存备份文件。
- 拆解仪器
- 由于KCN具有挥发性，应在通风橱中处理流体组件；将MRM和FC废液盘中的培养基倒入废液容器中，并用水彻底冲洗MRM插件和搅拌子。将含有KCN的废液容器内容物倒入贴有标签的化学废液容器中，由化学品安全部门进行后续处理。下次实验前，应彻底清洗并高压灭菌搅拌子和镊子。
7. 数据处理（时间：15–45 分钟）
- 在 Mac 或 PC 计算机上打开数据处理应用程序。选择由实验生成的 .csv 数据文件。如果该实验的方案与先前分析过的实验相似，则选择相应的设置文件，然后点击 下一步。否则直接点击 下一步 以开始输入实验设置。
- 填写实验的各项设置。在确定参考时间点时，选择 KCN 开始起效且寿命值开始下降之前的时间点。可通过滑块或在输入框中键入时间值来选定该时间点。
- 点击 计算 以根据公式 2 生成耗氧率（OCR）图表：
OCR = ([O2]in - [O2]out) × FR = (217 nmol/mL - [O2]out) × FR/组织量（公式 2）
其中，当 KRB 缓冲液在 37 °C 下与 21% O2 达到平衡时，O2 浓度为 217 nmol/mL，FR 为流速（单位：mL/min），组织量为加载到检测室中的组织量（即视网膜数量、RPE-脉络膜-巩膜复合物或 RPE 细胞）。 - 通过点击 导出图表 按钮将图表保存为 .pdf 文件。在编辑设置页面中，通过勾选对应测试化合物的复选框并将其设为 1，可将 OCR 以绝对值或相对于稳态值的分数形式绘图。
8. 流出组分的检测
- 如果实验结束后无法立即进行检测，应将微孔板置于 4 °C 保存（若次日检测），或冷冻保存（若需长期储存）。若微孔板已冷冻，则需在 4 °C 条件下解冻样本（以确保样本保持低温）。
- 在选定的流出组分完成检测后，将各数据列（每通道一列）输入一个 .csv 文件中，最左侧列为时间（单位为 min），右侧列为浓度（单位为 nmol/mL 或 ng/mL）；数据处理程序中有一个链接，点击后可上传模板文件。
- 将此文件上传至数据处理程序，以计算并绘制数据图表。
结果
为了说明从眼组织分离组分所获得数据的分辨率，按照常用的实验方案（线粒体应激测试10），测量了三种组织（视网膜、RPE-脉络膜-巩膜以及RPE细胞）的耗氧率（OCR）和线粒体质子泄漏率（LPR）（图10、图11 和 图12）。每种组织的使用量见表1。数据通过为该流体系统开发的软件包进行处理和绘图。视网膜和RPE-脉络膜-巩膜组织的制备相对简单，每种组织类型的处理时间少于20分钟。在测试化合物注射期间，OCR保持稳定，表明组织状态健康且功能稳定，支持该方法的有效性（图10）。一旦针对每种组织类型完成方法验证，我们发现无需在每次实验中都设置不注射测试化合物的对照组。结果与采用更传统的灌流方法获得的数据一致6,8,13：寡霉素导致OCR降低，而FCCP引起OCR升高。LPR的变化趋势与OCR相反：寡霉素使LPR升高，随后FCCP处理导致LPR下降（但降幅较小）（图11）。为了比较每种依次加入的测试化合物效应的统计学显著性，进行了t检验（由仪器配套软件自动计算）。由于本文的目的是描述该方法的操作流程，实验重复次数并不总是足够多以达到统计学显著性。然而，通常情况下，当重复次数为3次或以上时，FCCP和寡霉素对OCR和LPR的影响均具有显著性。
RPE 细胞此前未通过流动系统进行过分析，但其反应与 RPE-脉络膜-巩膜组织相似（这与大部分氧消耗率（OCR）源于 RPE 细胞的观点一致；图 11）。这些示例性结果突显了该系统维持组织活力的能力，表现为对照通道中 OCR 的稳定性，以及寡霉素和 FCCP 所诱导的 OCR 变化具有超过 100:1 的高信噪比。此外，对外流组分的检测可用于关联组织对外部液体中多种化合物的摄取或生成速率，这些数据可与 OCR（本例中为 LPR）相互补充。仪器的这些特性使得能够准确量化不同类型组织在平行实验中反应特征的差异。RPE-脉络膜-巩膜组织和 RPE 细胞对寡霉素的敏感性始终高于视网膜（图 11 和 图 12），尽管对于 RPE-脉络膜-巩膜组织，FCCP 作用时间尚不足以达到稳态。使用 DMSO 作为溶剂时需考虑一点：在较高浓度下（0.2%），DMSO 对视网膜的 OCR 具有短暂影响（可能反映了 DMSO 对膜通透性的影响所导致的渗透压变化效应）。
基于KCN通过直接作用于细胞色素c氧化酶而完全抑制呼吸作用的假设，KCN处理结束时的耗氧率（OCR）被设定为0，所有OCR值均根据相对于KCN处理值的变化进行计算。耗氧过程可能独立于呼吸链和细胞色素c氧化酶而发生。然而，这种非呼吸链途径对总耗氧率的贡献通常不超过百分之几（数据未显示），并且组织暴露于KCN的时间足够长，可确保非电子传递链氧化酶的底物已被耗尽。
统计学分析
单次实验结果如图中所示，包含多个取平均值的通道。数据以平均值 ± 标准误差（SE；计算公式为 SD/√n）的形式绘制成图。
图1．流体/检测系统的示意图。 主要组件包括外壳、温度控制元件、流体系统和组织室系统、灌流液上方顶空区的气体压力调节、馏分收集器/流速监测以及O2检测器。缩写：MRM = 培养基储存模块，PCM = 灌流室模块，TCA = 组织室组件。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2．（A）仪器主要组件的示意图。主要组件包括气瓶（压力调节器）、外壳、组分收集器和计算机。（B）实验流程图，显示主要步骤类别及完成各步骤所需时间。请点击此处查看该图的放大版本。
图3。MRM的视图。图中显示了MRM，其中包含置于MRM插入件底部的MRM插入件（左侧）和搅拌子（右侧）（放置于MRM分隔器的每一侧）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4．MRM 中的管路组件和吹扫管路组件。（A）测试化合物注入管路组件和吹扫管路组件连接至 MRM 上的端口。（B–C）测试化合物注入组件和吹扫管路组件（B）放置于外壳前端的凹槽内（C）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5．启动 MRM 温度控制器。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6．组织培养室与气体罐。 将O2检测器放置在检测器支架上（该支架同时也支撑MRM和PCM），并将固定带放置在PCM的散热片周围，以帮助将组织培养室固定到位。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7。 （A）气体钢瓶上的高压和低压调压器。（B-C）吹扫管。吹扫管可使MRM顶部空间中的空气排出，并充满供气钢瓶中的气体。图中显示了打开状态的吹扫管（B）和关闭状态的吹扫管（C）。在吹扫过程中，测试化合物注射组件始终保持关闭状态。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8．组织腔室及流出装置。（A）Transwell膜被切割成三等宽条带后的尺寸。（B）多管流出支撑架。（C）流出多管支撑架放置于密闭腔体边缘，管路接头靠近组织腔室的位置。（D）连接至组织腔室的流出管路组件实物图。（E）移除盖子后的密闭腔体俯视图。请点击此处查看该图的高清版本。
图9。在MRM中注入化合物。 使用5 mL注射器通过进样口将测试化合物注入MRM。 请点击此处查看本图的放大版本。
图 10。测试化合物作用下的 OCR 和 LPR 曲线。 小鼠视网膜（每通道一个视网膜）在存在或不存在（对照）指定测试化合物条件下的 OCR 和 LPR 变化。每条曲线来自单次实验的 6 个重复样本的平均值（误差线表示标准误；p 值通过配对 t 检验比较每种测试试剂与前一种试剂稳态值计算得出）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 11．OCR 曲线。 小鼠分离的视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体（RPE-choroid-sclera）和视网膜（每通道 1 个视网膜或 2 个 RPE-choroid-sclera）在测试化合物作用下的平行测定 OCR 结果，测试化合物如图所示。数据来自单次实验的重复样本平均值（RPE-choroid-sclera 和视网膜的 n 值分别为 2 和 4；p 值通过配对 t 检验比较每种测试试剂与其前一试剂的稳态值计算得出）。请点击此处查看该图的高清版本。
图 12. RPE 细胞的 OCR 和 LPR 曲线。 将附着于 transwell 膜上的 RPE 细胞剪成条状后装入灌流室中测得的 OCR 和 LPR 数据。数据来自单次实验的重复样本平均值（n = 3，每通道 1.5 个膜（每通道 360,000 个细胞）；p 值通过配对 t 检验比较每种测试试剂与其前一种试剂的稳态值计算得出）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 组织/细胞 | 数量/通道 | 流速：mL/min |
| 视网膜（小鼠） | 1 | 0.025 |
| RPE-脉络膜-巩膜（小鼠） | 2 | 0.02 |
| Transwell膜上的RPE细胞 | 360,000个细胞（4 × 1/3滤膜条） | 0.016 |
表1. 不同组织的推荐操作参数。
补充图1. 实验设计的图示。 接触待测化合物的时间和组成，以及组分收集的时间。浓度增量（Conc Inc）是指将要实施的浓度变化。请点击此处下载该文件。
补充图2. 启动时的用户界面。 用于监测插入PCM中组织腔室O2浓度的O2检测软件在启动时的用户界面窗口。 请点击此处下载该文件。
补充图3. 实验设置的用户界面。 用于输入实验信息（左侧）和选择流出组分收集时间（右侧）的用户界面。 请点击此处下载该文件。
补充图4：注射页面的用户界面。 该注射页面可根据测试化合物的目标浓度以及多反应监测（MRM）中剩余的体积，自动计算注射体积。请点击此处下载该文件。
补充文件 1：组织样本制备方法。 请点击此处下载该文件。
讨论
由于生物能量学在细胞功能的各个方面以及眼内多种组分的维持中具有重要作用，因此迫切需要研究其调控机制的方法。特别是神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）依赖于代谢过程，不仅用于能量生成，还参与细胞内和细胞间的信号传导14,15,16,17。由于眼部组织具有较高的氧化能力，在静态条件下难以良好维持其活性18,19，因此对眼部分离组分的研究需要能够同时维持并评估代谢过程的灌流系统。本研究开发的流体系统可用于获取多种组织类型的耗氧率（OCR）和乳酸生成率（LPR）数据，本文提供了经验证可获得最佳结果的详细实验方案。
使用流式系统生成可靠数据的主要决定因素包括在39 °C下对基于CO2的培养基/缓冲液进行预平衡（以确保灌流液不会因溶解气体过饱和而在实验过程中发生脱气）。特别是储存在4 °C的培养基或KRB缓冲液相对于37 °C处于过饱和状态，如果预平衡时间不足，则在实验过程中会发生脱气。此外，装入组织腔室的组织必须避免因撕裂或组织分离不完全等不当分离操作而受损，也应避免将组织暴露于少量碳酸氢盐缓冲液中并长时间接触大气空气。温度控制、流速稳定性以及O2检测的可靠性变异极小，这些因素对失败率的影响不显著。
该仪器具有八个并行运行的流路通道/组织腔室，由两个储液器提供灌注液，每个储液器供应四个组织腔室。为了获得最准确的耗氧率（OCR）时间进程曲线，需使用未装载组织的腔室对动力学曲线进行基线校正。因此，典型的实验方案通常包括两组，每组三个组织腔室。总体而言，实验方案可分为两类：一类是在两侧分别施加不同的测试化合物（例如，在MRM的一侧加入药物/溶剂对照，另一侧仅加入溶剂对照）；第二类是在MRM的两侧施加相同的测试化合物注射方案，但在MRM的两侧分别放置不同的组织或组织模型。本文中，通过比较暴露于寡霉素和FCCP的视网膜组织与未暴露于任何测试化合物的组织的OCR，同时在相同实验方案和条件下对两种组织进行平行评估，以识别组织特异性行为。本研究通过在同一实验中平行展示RPE-脉络膜-巩膜相对于视网膜具有更高的代谢速率动态范围，说明了后一种方案的应用。其他研究已报道了更广泛的实验设计，包括测量不同氧浓度（O2）对OCR和乳酸生成率（LPR）的影响，以及燃料、药物和毒素的浓度依赖性效应20,21。此外，尽管本研究仅将流出液组分的分析局限于乳酸测定及LPR计算，但如果对流出液中的多种化合物及其类别同时进行检测（如激素、神经递质、细胞信号分子以及可从细胞中释放的代谢物），则实验所获得的信息量将显著增加20,22,23。
分离的视网膜或RPE-脉络膜-巩膜复合体的装载操作简便，一旦分离，这些组织即可用镊子直接放入组织室的上部，并使其自然沉降至烧结滤板处。在滤膜插件上培养的RPE细胞，经过体外培养4–8周后，可形成适当的极性结构以及表达RPE成熟的相关标志物。若需维持RPE细胞的成熟状态和极性，则无法在RPE细胞贴附于Transwell膜后将其剥离用于活细胞分析24。灌流室可容纳用手术刀在缓冲液中切割下的Transwell膜条，并迅速插入组织室中。尽管已有将滤膜条置于静态系统中的操作报道24，但目前尚无其他流体动力学方法可用于评估这些重要的细胞类型。RPE细胞的反应速度较快且动态性更强，相较于视网膜或RPE-脉络膜-巩膜复合体，这可能部分归因于RPE细胞在膜插件上形成单层结构后，其顶面和基底面均可立即与灌流液接触。
确保数据具有最高信噪比的另一个因素是选择灌流室中组织加载量与流速之间的最佳比例。相对于流速而言，组织量过少会导致溶解氧的差异2 流入与流出之间的浓度差非常小，难以可靠测量。相比之下，如果流速过慢，则氧气浓度会2 变得过低，导致组织出现缺氧。然而，气体压力驱动的液体流动可在低至5 mL/min的流速下维持，仅需少量组织即可实现准确的OCR和LPR测量。在本实验中，每个通道使用约20 mL/min的流速，适用于单个视网膜、两个RPE-脉络膜-巩膜复合体或360,000个RPE细胞。为最大限度减少系统效应导致的组织暴露延迟和分散问题，提供了多种规格的组织腔室，以便将组织用量（及流速）与相应尺寸的腔室相匹配。
本文所示分析的数据以两种方式呈现：相对于速率的绝对量值，或相对于稳态或基线的相对分数变化。重点在于展示对测试化合物反应的测量方法。然而，该流体系统也非常适用于在离体灌流分析之前评估和比较组织处理（如基因修饰）的影响。若要检验某种处理与对照之间的差异，最可靠的方法是分析该处理对测试化合物标准化反应的影响。如果分析需要使用绝对量值，则在同一次离体灌流实验中同时进行预处理样本及其对照的评估，可使统计分析的效力达到最大化。
除了搅拌器之外，所有与液体接触的部件均由制造商作为耗材提供，并已进行灭菌处理。这些部件不应重复使用，因为实验偶尔会因清洗不彻底或表面污染而失败。系统在初始组装时处于无菌状态。然而，培养基是在非无菌条件下添加到MRM中的，组织也是在非无菌条件下装入腔室的。我们曾对使用无菌部件组装但实验过程本身在非无菌条件下进行的系统测量过耗氧率（OCR）。细菌积累至可检测到OCR水平大约需要14小时（未发表结果）。如果实验所用方案持续时间少于约10小时，则细菌的积累及其可能产生的影响可忽略不计。
许多研究者使用专门设计的仪器，在静态培养条件下测量单层细胞的耗氧率（OCR），这类方法通量相对较高25,26。相比之下，本文测试并描述的流体控制系统通过确保充足的氧气（O2）供应来维持组织活性，这对于组织样本中较大的扩散距离尤为关键。此外，该系统能够收集洗脱组分，从而可并行检测多个与OCR相关的参数，显著增强了研究这些参数之间相互关系的能力。最后，溶解气体浓度（如O2和CO2）可被精确控制，这延长了使用碳酸氢盐培养基和缓冲液的实验持续时间，使研究者能够系统研究O2的影响。需要指出的是，这两种方法的一个共同局限在于无法研究待测化合物的洗脱过程，而其他灌流系统具备这一功能4,27,28。在确定最佳分析方式时还需考虑另一个因素：流体控制系统相比静态系统需要消耗更多的培养基和待测化合物。然而，由于当前流体控制系统可采用极低流速运行，额外开销已降至最低。
总体而言，本文详细描述了使用新型流体/评估仪器进行实验的操作流程。利用视网膜及视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜-巩膜组织所获得的数据，重现了此前使用更为复杂且不易获取的系统所得到的结果。此外，本系统还被证实可用于维持并评估附着于Transwell膜上的RPE细胞，这是一种非常重要的细胞模型，但由于细胞脆弱，此前尚未能在流体系统中进行分析。该实验方案主要包括75分钟的准备时间，随后是90分钟的平衡期，再进行正式实验，因此适用于不具备微流控系统操作专长的实验室常规使用。尽管本研究重点在于测量组织对测试化合物的急性反应，但该系统也非常适合用于比较来自不同来源的组织，例如动物模型或经过基因改造、接受过测试处理/条件干预的细胞模型。此外，可对流出液组分开展的检测范围广泛，包括代谢物、细胞信号分子、分泌的激素/神经递质，以及利用质谱技术对各组分和组织本身进行的多组分分析。
披露
I.R.S.、M.G. 和 K.B. 与本研究中所述 BaroFuse 灌流系统的制造商/经销商 EnTox Sciences, Inc.（美国华盛顿州默瑟岛）存在财务关系。其他所有作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（R01 GM148741 I.R.S.）、U01 EY034591、R01 EY034364、BrightFocus基金会、防止失明研究基金会（J.R.C.）以及R01 EY006641、R01 EY017863和R21 EY032597（J.B.H.）提供的资助支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物样本 | |||
| C57BL/6J 小鼠 | Envigo Harlan (印第安纳波利斯, IN) | N/A | |
| 试剂 | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| 乳酸 | MilliporeSigma | L6661 | |
| 寡霉素 A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| 细胞培养与组织收获 | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml 戊巴比妥钠 | Virbac | RXEUTHASOL | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s 平衡盐溶液 | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液 (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| 耗材 | |||
| 气体钢瓶：21% O₂ / 5% CO₂ / 氮气平衡 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell 滤膜 | MilliporeSigma | 3470 | |
| 商用检测试剂盒 | |||
| Amplex Red 葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒 | ThermoFisher | A22189 | |
| 来自 Aerococcus viridans 的葡萄糖氧化酶 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| 乳酸氧化酶 | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| 仪器设备 | |||
| BaroFuse 多通道灌流系统 | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | 型号 001-08 | |
| Synergy 4 荧光计 | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
参考文献
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