富氏皮下针刺法对坐骨神经痛疗效的研究：慢性缩窄性损伤大鼠模型中的行为学与电生理学变化

摘要

我们介绍了一种在坐骨神经慢性压迫损伤模型中应用付氏皮下针刺法诱导大鼠坐骨神经痛的实验方案。

摘要

富氏皮下针刺法（FSN）是一种源自中医的创新针灸技术，目前在全球范围内用于缓解疼痛。然而，其作用机制尚未被完全阐明。在 FSN 治疗过程中，FSN 针被插入皮下组织并长时间留置，同时进行摆动摇动操作。但在动物模型（如大鼠）中实施 FSN 操作时，研究人员面临维持特定姿势的困难。不舒适的治疗过程可能导致动物对 FSN 针产生恐惧和抗拒，增加受伤风险，甚至可能影响研究数据的准确性。使用麻醉也可能干扰实验结果。因此，亟需建立一种在动物实验中实施 FSN 治疗的策略，以最大程度减少干预过程中的损伤。本研究采用 Sprague-Dawley 大鼠的慢性缩窄性损伤模型来诱导神经病理性疼痛。该模型通过对外周神经进行手术结扎，模拟人类神经损伤所引发的疼痛，重现了诸如神经卡压综合征和周围神经病变等疾病中常见的神经压迫或嵌压状态。我们介绍了一种适用于将 FSN 针顺利插入动物皮下层的操作方法，包括进针方向与位置、留针方式以及摆动摇动手法。通过减轻大鼠的不适感，可避免其因紧张导致肌肉收缩，从而阻碍针具进入，并有助于提高研究效率。

引言

神经病理性疼痛是指由神经损伤引起的疼痛，估计影响全球6.9%–10%的人口，报告的终生患病率为49%–70%^1,2。它也被认为是最难治疗的疼痛综合征之一。目前使用药物治疗神经病理性疼痛的效果有限，因为常用的止痛药物如非甾体抗炎药和阿片类药物在缓解此类疼痛方面疗效甚微^3,4。因此，迫切需要探索新的治疗方法，尤其是非药物治疗手段。针灸作为一种非药物干预方式，可能通过作用于躯体感觉系统产生镇痛效应，从而缓解神经病理性疼痛。临床和临床前研究均表明，针灸在缓解神经病理性疼痛症状方面有效，且无明显副作用^5,6,7。然而，针灸治疗神经病理性疼痛的中枢机制仍有待进一步研究。

近年来，浮针疗法（Fu's subcutaneous needling, FSN）在治疗与疼痛相关的神经系统疾病方面逐渐受到关注⁸。FSN起源于传统中医针灸，由中医师傅中華于1996年首次提出^9,10。尽管源于传统针灸，FSN在技术与理论体系上与经络学说、阴阳理论及传统穴位概念存在显著差异。FSN更强调基于神经生理学与解剖学的方法，以有效干预肌筋膜疼痛¹¹。在临床实践中，FSN被用于治疗多种肌肉性疼痛疾病，其作用靶点为与肌肉密切相关的结缔组织，尤其聚焦于对紧张肌肉（tightened muscles, TMs）的治疗¹²。作为一种缓解疼痛的辅助疗法，已有临床证据表明，FSN不仅可用于软组织损伤的治疗，还能实现快速镇痛，并显著改善软组织痉挛状况^13,14。FSN治疗包含一系列特定技术，旨在针对性地干预与疾病相关的肌筋膜触发点（myofascial trigger points, MTrPs）。FSN针具的进针位置需根据这些触发点的具体位置精心选择，以实现对病变区域的精确定位。操作过程中，FSN针被刺入皮下层，并有意识地在此层次停止，以优化治疗效果。随后采用一种称为“摇摆运动”的独特技术，即通过针体轻柔的摆动刺激周围组织，从而促进治疗反应的产生¹⁰。MTrPs的形成与“能量危机理论”密切相关，该理论认为，慢性肌肉过度负荷、剧烈运动、不当用力姿势、肌肉萎缩及退行性变等因素可导致肌肉组织缺血与缺氧。肌肉组织内氧气与能量的缺乏被认为是MTrPs形成的关键机制^15,16。既往动物研究表明，在大鼠慢性疼痛模型中，FSN治疗可在一定程度上改善紧张肌肉中线粒体的形态结构与功能，证实了FSN疗法在促进受损神经与肌肉恢复方面的潜在作用¹⁷。

坐骨神经痛已被归类为神经病理性疼痛¹⁸。神经病理性疼痛的起源被认为可位于运动终板至肌肉外层纤维层之间的任何部位，涉及细胞水平上的微血管系统和神经递质。当发生神经损伤时，会出现肌肉失神经支配以及受支配神经元的凋亡¹⁹，从而导致患肢出现与疼痛相关的步态异常。此外，神经的慢性压迫或刺激可引起神经功能方式的多种改变，进一步加重坐骨神经痛的症状²⁰。然而，神经系统的复杂性使得在体外难以复制其结构与功能，因此此类研究必须依赖动物模型。在神经病理性疼痛障碍的研究中，通常采用模式生物，并通过多种直接损伤外周神经的方法，如坐骨神经结扎、横断或压迫^21,22。目前已在Sprague-Dawley大鼠中建立慢性缩窄性损伤（CCI）模型以诱导神经病理性疼痛。该模型通过手术对外周神经进行部分结扎，模拟人类神经损伤所引发的疼痛，重现了诸如神经卡压综合征和周围神经病变等疾病中所见的神经压迫或嵌压状态。

本研究评估了浮针疗法（FSN）和低频电刺激疗法（经皮神经电刺激，TENS）对坐骨神经慢性压迫损伤伴神经病理性疼痛大鼠的镇痛效果。由于麻醉会减慢或阻断神经冲动，影响突触传递和神经元功能²³，因此在所有针刺操作和摆动过程中均不能对动物实施麻醉。因此，需要采用适当的针刺技术以减少大鼠的不适。本文详细描述了建立大鼠CCI模型的步骤、在无麻醉条件下对大鼠实施浮针联合摆动治疗的方法、可行的动物行为学检测以及电生理学检查方法。

方案

所有涉及动物受试者的实验程序均于2022年10月获得中国台湾彰化县彰滨秀传纪念医院机构动物照护及使用委员会（IACUC）的批准（111031）（图1）。

1. 动物准备

1. 购买48只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（年龄：8–10周，体重：250–300 g）。
2. 将大鼠单独饲养于通风笼具中，环境温度为24 ± 2 °C，光照周期为12小时明暗循环。
3. 给予大鼠标准颗粒饲料，并提供可随时饮用的无菌饮水，同时铺设柔软垫料。

2. 动物分组

1. 将48只SD大鼠随机分为六组（每组n = 8）：假手术组、CCI组、CCI+FSN组、CCI+TENS组、单独FSN组和单独TENS组，分组方法参照Chan等²⁴先前的研究。
   ​注：六组的具体情况如下：（1）假手术组：不进行手术且不接受治疗；（2）CCI组：进行手术但不接受治疗；（3）CCI+FSN治疗组：在成功建立CCI模型后接受FSN治疗；（4）CCI+TENS治疗组：在成功建立CCI模型后接受TENS治疗；（5）单独FSN治疗组：仅接受FSN治疗，不进行手术；（6）单独TENS治疗组：仅接受TENS治疗，不进行手术。

3. 建立CCI大鼠模型

注意：大鼠的 CCI 手术模型是根据 Bennett 和 Xie 于 1988 年建立的方法进行改良的²⁵。

1. 操作者须佩戴外科口罩、一次性手术帽和无菌手套。
2. 用70%乙醇消毒手术台表面。通过高压灭菌对器械（如剪刀、镊子和牵开器）、纱布、缝合钉和棉签进行灭菌。
   注意：整个手术过程均采用无菌技术。
3. 在完成标准皮肤准备（剃毛）后，使用4%异氟烷麻醉大鼠，并以2%异氟烷维持麻醉（图2A）。
   1. 通过夹捏后肢足掌无反应来确认麻醉深度，并在手术过程中持续监测麻醉状态。
   2. 在眼睛表面涂抹足量兽用眼膏，防止角膜干燥。
4. 将大鼠俯卧位固定于手术台上，剃除右侧后肢外侧的毛发，然后用聚维酮碘溶液和75%乙醇对皮肤进行三次消毒。手术全程提供保温支持，并使用无菌手术巾覆盖手术区域。
   1. 在股骨下方约3-4 mm处沿纵轴做一长度约为20-50 mm的平行皮肤切口。
   2. 优先辨认臀大肌与股二头肌的位置。使用手术剪逐层分离皮下脂肪和浅筋膜，剪开周围结缔组织以暴露肌肉（图2B）。
      注意：为区分皮下脂肪与浅筋膜层，应观察其质地与颜色。皮下脂肪层质地柔软、有延展性，呈淡黄色或白色；浅筋膜为位于皮下脂肪下方的一层薄而致密的纤维组织。可通过钝性器械轻柔触诊或探查进行区分，注意皮下脂肪对压力的阻力较浅筋膜更大。
5. 使用钝头剪刀剪开臀浅肌与股二头肌之间的结缔组织。
   1. 使用牵开器扩大两肌之间的间隙，以暴露坐骨神经（图2C）。
      注意：在大鼠体内肉眼识别坐骨神经时，应聚焦于大腿区域。找到大腿中点位置以观察坐骨神经。通常该神经沿大腿后侧走行，起自髋部区域并向膝部延伸。
   2. 在良好光源下，使用微针轻轻挑起坐骨神经，注意不改变神经形态。使用3-0铬制肠线对坐骨神经进行双重结扎，两结扎点间距约1 mm。
   3. 每个结扎线先打松结，握住结扎线靠近结环处的两端，缓慢收紧至刚好贴合神经，确保结扎线不在神经上滑动。当结扎过程中观察到肢体出现轻微抽动时即停止收紧（图2D）。
6. 使用4-0缝线逐层缝合肌肉和皮肤。最后用碘伏对伤口进行消毒（图2E）。
7. 在麻醉期间密切监测大鼠生命体征，术后将其置于单独的恢复笼中直至清醒，再转移回饲养笼。笼内铺设平整的纸垫料，以防意识未完全恢复的动物发生窒息。术后肢体出现短暂抽动提示手术成功（图2F）。
8. 在CCI造模前多次进行疼痛过敏性检测（基线值），并在CCI后不同时间点重复检测。
9. 在模型构建后的第1、3、5和7天观察自发性疼痛及相关行为学变化。
   注意：观察右侧后肢的步态、姿势以及是否存在舔咬患肢行为。
   1. 通过上述表现判断是否存在神经病理性疼痛，以确认模型是否成功建立，并剔除造模失败的大鼠。
      注意：通过观察如下体征评估模型是否成功：下肢行走无力、右后肢脚趾并拢伴轻度外翻、频繁悬垂、不愿着地等。典型表现为大鼠站立时由左后肢承重，右后肢抬高并贴近腹部。

4. 筋膜松解术操作的实施

1. 将FSN治疗组（包括CCI+FSN组和单独FSN组）的大鼠固定于啮齿类动物束缚器中，使患肢侧向暴露。整个操作过程中提供保温支持。两组均使用一次性FSN针具（图3A）。
2. 在无麻醉状态下，逐渐缓慢地伸展大鼠后肢，直至完全拉紧（图3B）。
   注意：用手术单覆盖大鼠头部，以保持动物安静和稳定。切勿过度伸展肢体，以免造成损伤。密切观察大鼠反应，注意是否有痛苦或不适的迹象。若大鼠出现疼痛或不适表现，应立即停止伸展，给予休息后再尝试。
3. 取下FSN针的保护套管。
   1. 将FSN针针尖朝向触发点肌肉（MTrPs），插入位置大致靠近位于下背部和后部的臀大肌区域。
4. 将FSN针平放，以约15°角刺入皮肤。
   1. 小心且迅速地将针推过皮肤并进入皮下组织，以减少大鼠应激，直至完全插入。确保针插入足够深度，使软管部分完全埋入皮下。
   2. 向前推进时，轻微抬高针尖，观察皮肤隆起是否随针尖移动（图3C）。
5. 以拇指为支点，食指、中指和无名指保持直线排列，轻柔平稳地扇动FSN针针尖，完成摆动操作。
   1. 将FSN针夹持于中指与拇指指腹之间，呈面对面姿势，交替使用食指与无名指进行前后摆动。
   2. 设定频率为每分钟100次，操作持续约1分钟（图3D）。
6. 完成操作后，迅速拔出FSN针。
   ​注意：该操作每2天进行一次，共进行四次（在建立CCI模型后的第1、3、5和7天）。一次性FSN针具仅可使用一次。重复使用会导致针尖变钝，增加大鼠疼痛。

5. TENS 治疗操作的实施

1. 将经皮神经电刺激（TENS）治疗组的大鼠（包括CCI+TENS组和单独TENS组）固定于啮齿类动物束缚器中，使患侧肢体侧向暴露。整个操作过程中提供保温支持。确保在治疗前已剃除局部毛发。
   注：电极被裁剪为45 mm（长）× 5 mm（宽）（图4A）。
2. 选择足三里穴（ST36）和三阴交穴（SP6）作为经皮神经电刺激（TENS）的刺激位点。该选择基于治疗神经病理性疼痛的理论依据^26,27。
   1. 定位足三里穴（ST36）：位于胫骨前结节外侧约5 mm处，在膝下胫骨与腓骨之间²⁸。
   2. 定位三阴交穴（SP6）：位于胫骨内侧后缘，内踝上方3 mm处²⁸。
      注：上述两个穴位均通过手动触诊定位，方法依据Stux与Pomeranz的描述以及动物针灸图谱中的标准^28,29（图4B）。
3. 使用经皮神经电刺激（TENS）设备，在神经周围腿部位置施加低频电刺激（2 Hz连续正弦波，3 mA），持续10分钟。用手术单覆盖大鼠头部以保持其安静和稳定。
   ​注：该操作每2天进行一次，共进行四次（在建立CCI模型后的第1、3、5和7天）。

6. 进行动物行为学测试时的生理指标测量

注意：坐骨神经功能指数（sciatic function index, SFI）³⁰ 是研究神经损伤病理学及潜在治疗方法的研究人员广泛使用的一个指标，通过比较损伤大鼠患侧后足与对侧足的几何形态，并与对侧足进行对比来确定。

1. 使用透明有机玻璃和倾斜镜设计大鼠行走通道，以捕捉大鼠行走过程中的足印和身体朝向。
   注意：行走通道是一个长10 cm、宽50 cm、高15 cm的平台，底部铺有白色纸张（图5A）。
2. 将大鼠轻柔地自由放入箱内，使其在开始记录前至少适应新环境5分钟。
   注意：需特别注意尽量减少动物不必要的应激，以避免其对姿势性肌肉张力可能产生的影响。
3. 将大鼠的足部浸入红色印泥中，让其沿行走通道行进，在衬纸上留下足迹痕迹。每次测试至少记录2秒的连续行走过程。使大鼠沿同一方向至少行走3次（图5B）。
   注意：使用快干、无毒、水溶性的红色印泥涂抹双侧后肢足部，以确保后足足迹清晰可见。
4. 实验结束后，将行走通道上的纸条晾干以进行参数测量。使用直尺测量足迹，并将数值四舍五入至最接近的0.5 mm。
   注意：从每只大鼠的多个足迹中选取三个清晰的足迹，并测量三个不同参数。坐骨神经功能指数（SFI）包含的参数有：足印长度（PL）、足趾展开度（TS）和中间足趾展开度（ITS）。
   SFI值通过以下公式计算³¹：
   
   （EPL，实验足印长度；NPL，正常足印长度；ETS，实验足趾展开度；NTS，正常足趾展开度；EIT，实验中间足趾展开度；NIT，正常中间足趾展开度。）
   SFI值为0和-100分别表示正常功能和完全功能障碍。对于拖行足趾的大鼠，SFI值人为设定为-100。正常神经功能时，SFI值在0附近波动，而SFI值接近-100则代表完全功能障碍³²。

7. 通过电生理测量进行神经生理学评估³³

注意：本研究采用肌电图记录电生理活动。复合肌肉动作电位（CMAP）由神经支配的目标肌肉中的肌纤维激活引起。本研究检测CMAP的波幅和潜伏期。CMAP波幅从基线测量至负向波峰。CMAP潜伏期通过测量刺激施加时刻与复合动作电位起始之间的时间确定，该时间受刺激部位与记录部位之间距离的影响。电生理学可对大鼠周围神经功能进行客观评估。

1. 腹腔注射 Zoletil 50（40 mg/kg）以麻醉大鼠。按照标准操作规程准备皮肤（剃毛）。
2. 将一次性粘贴式表面电极（外径 20 mm）放置于指定区域。将记录电极固定在腓肠肌的外侧和背侧表面（图 6A）。
3. 对右侧近端坐骨神经干施加电刺激（强度 1.2 mA），在腓肠肌肌腹处记录复合肌肉动作电位（CMAP）（图 6B）。
   注意：插入电极时需小心，避免损伤肌肉组织。
4. 记录每只大鼠三次重复测量的结果。
   注意：CMAP 以每组的平均值 ± 标准差表示。信号经放大器放大并滤波（0.3–3 kHz）。经过积分（时间常数 = 0.05 s）后，原始信号和积分信号均被输入。原始信号与积分信号随后在 PowerLab 系统中数字化，并存储于计算机硬盘中。
5. 完成电生理操作后，将大鼠转移至另一笼中，并持续监测直至其恢复足够意识以维持胸卧位。待大鼠完全从麻醉状态恢复后，将其转回原笼。

8. 统计学：

1. 采用重复测量方差分析（ANOVA）评估各组之间SFI和CMAPs的差异。
2. 由对实验条件设盲的助手对数据进行量化。数据以均值 ± 标准差表示。
3. 在适当情况下，使用Student双尾配对t检验和非配对t检验对数据进行比较。统计学显著性定义为 p < 0.05。

结果

足印分析及坐骨神经功能指数（SFI）的测定
我们观察了仅CCI组、CCI+FSN组和CCI+TENS组中SFI的演变情况（图7）。在CCI手术后第7天接受4次FSN和TENS治疗后，CCI+FSN组（-15.85 ± 3.46）和CCI+TENS组（-29.58 ± 9.19）的SFI显著优于仅CCI组（-87.40 ± 14.22）。其中，CCI+FSN组的改善程度显著优于CCI+TENS组（图7A）。

我们还研究了假手术组（0.02 ± 0.52）、仅行FSN治疗组（0.06 ± 1.75）和仅行TENS治疗组（-2.36 ± 1.22）的SFI值。结果显示，最后两个治疗组与假手术组之间均无显著差异（图7B）。这表明FSN和TENS是安全的治疗方法，不会对健康状态的大鼠造成任何损害（Table 1）。

讨论

本研究观察了浮针疗法（FSN）对坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）大鼠模型神经病理性疼痛的影响。本研究提供了一种用于评估FSN或经皮神经电刺激（TENS）治疗后疗效的坐骨神经功能指数（SFI）和电生理检测方案。此外，还阐述了如何通过无创行为学测试和生理学测量来评估损伤神经的功能恢复情况。结果表明，在CCI诱导的坐骨神经痛后，FSN治疗组在所有预后指标上的改善均显著优于TENS治疗组。该研究在以FSN疗法为核心的动物实验中具有广阔的应用前景，有助于弥合基础研究与临床应用之间的鸿沟。本研究将通过更深入地理解疾病机制，从而改善患者的治疗效果。

针灸在中国已有3000多年的应用历史，通常被认为是一种在人类和实验动物中缓解疼痛的安全有效方法^34,35。既往临床研究已证实，针灸可减轻CCI模型中的疼痛行为³⁶。浮针疗法（FSN）是一种源于传统中医针灸的技术³⁷，广泛用于治疗多种与疼痛相关...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子	World Precision Instruments	14098
傅’皮下穿刺	南京派夫医学科技有限公司		FSN针具为一次性使用设计。FSN针由三部分组成：实心钢制针芯（底部）、软质套管（中部）和保护鞘（顶部）。
Medelec Synergy 肌电图仪	Oxford Instrument Medical Ltd.	034W003	肌电图（EMG）可用于辅助诊断和管理神经病变等疾病。包含便携式双通道肌电图/神经传导速度系统。
生理盐水（0.9%）20 mL	中国台湾生物技术有限公司	4711916010323	批号：1TKB2022
POLYSORB 4-0 紫色 30" CV-25	美国外科公司，泰科医疗旗下部门	GL-181
牵开器	COOPERSURGICAL, INC.(美国)	3311-8G
Rompun	礼来动保韩国有限公司	27668
SCISSORS CVD 90MM	BBRUAN	XG-LBB-BC101R
经皮神经电刺激	Well-Life Healthcare Co.	型号 2205A	提供经皮神经电刺激（TENS）功能的数字装置。配备患者导联线、自粘电极片、3节AAA电池、使用说明书，收纳于柔软便携袋中。间歇模式开启时间1–30 秒。间隔关闭时间 1–30 s
Zoletil	VIRRBAC	8V8HA