用于研究内皮-间充质转化的新生大鼠异位心脏移植模型

摘要

本研究展示了一种由内皮-间充质转化诱导纤维化的动物模型，该模型见于重度主动脉瓣狭窄或左心发育不良综合征等先天性心脏缺陷，可用于进行详细的组织学组织评估、调控信号通路的鉴定以及治疗方案的测试。

摘要

心内膜纤维弹性组织增生症（EFE）以心内膜下组织积聚为特征，严重影响左心室（LV）的发育，使患有先天性重度主动脉瓣狭窄和左心发育不良综合征（HLHS）的患者无法接受根治性的解剖学双心室外科修复手术。目前，外科切除是唯一可用的治疗手段，但EFE常会复发，有时甚至会以更具浸润性的生长模式侵入邻近的心肌组织。

为了更好地理解限制性心内膜纤维化的潜在机制并探索治疗策略，研究人员建立了一种适用于临床前测试的动物模型。该动物模型考虑到限制性心内膜纤维化是一种未成熟心脏的疾病，并且与血流紊乱相关，这得到了临床观察的支持。因此，本模型基于新生大鼠供体心脏的异位心脏移植技术。

将新生大鼠心脏移植到青春期大鼠的腹腔内，并与受体动物的肾下腹主动脉和下腔静脉相连。尽管冠状动脉灌注可维持供体心脏的活性，但左心室内的血流停滞会诱导极度未成熟心脏中出现心内膜纤维弹性组织增生（EFE）。EFE形成的潜在机制是心内膜内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT），这一过程是胚胎早期心脏瓣膜和间隔发育的已知机制，同时也是心力衰竭中纤维化的主要原因。EFE的形成在移植后数天内即可通过肉眼观察到。通过经腹超声心动图监测移植物的存活情况、收缩功能以及吻合口的通畅性。在实施安乐死后，采集EFE组织，其组织病理学特征与来自左心发育不全综合征（HLHS）患者的人类EFE组织相同。

这种体内模型可用于研究心脏中EFE形成的机制，测试预防此类病理性组织形成的治疗方案，并为EndMT诱导的纤维化提供更广泛的分析机会。

引言

心内膜弹力纤维增生症（EFE）的特征是亚心内膜组织中胶原和弹性纤维的积聚，表现为珍珠样或不透明的心内膜增厚；EFE 在胎儿期和婴儿早期生长最为活跃¹。一项尸检研究显示，70% 的左心发育不良综合征（HLHS）病例伴有 EFE²。

表达成纤维细胞标志物的细胞是局灶性心内膜纤维化的最主要细胞群体，但这些细胞同时也共表达心内膜内皮标志物，提示此类局灶性心内膜纤维化细胞的来源。我们课题组先前已证实，局灶性心内膜纤维化形成的潜在机制涉及心内膜内皮细胞通过内皮-间质转化（EndMT）向成纤维细胞发生的表型转变³。可通过针对内皮细胞标志物（如分化簇（CD）31或血管内皮（VE）-钙黏蛋白（CD144））与成纤维细胞标志物（例如α-平滑肌肌动蛋白，α-SMA）的免疫组织化学双染色法来检测EndMT。此外，我们此前还证实了TGF-ß信号通路在此过程中通过激活转录因子SLUG、SNAIL和TWIST发挥调控作用³。

内皮-间质转化（EndMT）是一种在胚胎心脏发育过程中发生的生理过程，可导致心内膜垫形成心脏间隔和瓣膜⁴，但也与心力衰竭、肾纤维化或癌症中的器官纤维化有关，并在血管动脉粥样硬化中发挥关键作用^5,6,7,8。我们及他人的研究已报道，心脏纤维化中的EndMT主要通过TGF-β通路进行调控^3,9。已有多种刺激因素被证实可诱导EndMT的发生：炎症¹⁰、缺氧¹¹、机械改变¹²以及血流紊乱，包括心腔内血流的改变¹³，此外EndMT也可能是遗传性疾病的结果¹⁴。

该动物模型利用了心脏内膜纤维弹性组织增生（EFE）发育的关键要素，即发育不成熟和心腔内血流的改变，特别是血流停滞。通过使用新生大鼠心脏作为供体来满足“发育不成熟”这一条件，因为新生大鼠在出生后即处于发育不成熟状态。异位心脏移植则可实现心腔内血流受限¹⁵。

从临床角度来看，该动物模型有助于更好地研究内皮-间质转化（EndMT）对发育中左心室（LV）的影响。通过EndMT诱导形成心内膜纤维弹性组织（EFE），对胎儿和新生儿心脏的生长施加了限制。¹⁶ 排除了患有左心室流出道梗阻（LVOTO）的患者接受根治性解剖性双心室外科修复，例如先天性重度主动脉瓣狭窄和左心发育不良综合征（HLHS）¹⁷该动物模型有助于研究内皮-间质转化（EndMT）过程中组织形成的细胞机制及其调控，并可用于药理治疗方案的测试。^3,18.

经腹超声心动图用于监测移植物的存活情况、收缩功能以及吻合口的通畅性。在实施安乐死后，移植术后3天内可肉眼观察到胚胎前体细胞（EFE）的形成。EFE组织表现出与左心室流出道梗阻（LVOTO）患者的人类EFE组织相同的组织病理学特征。

因此，尽管该动物模型是为研究HLHS谱系中的儿科疾病而开发的，但也可应用于基于EndMT分子机制的各种其他疾病的探索。

方案

所有动物实验操作均依照美国国家研究委员会2011年发布的《实验动物护理与使用指南》（第八版）进行。动物实验方案已通过波士顿儿童医院机构动物护理与使用委员会的审查和批准。

手术前，所有手术器械均需进行蒸汽高压灭菌，制备含有22 mmol/L KCl的改良Krebs-Henseleit缓冲液作为心脏停搏液（表1）。该溶液经滤膜除菌后，于4 °C保存过夜。异位新生大鼠心脏移植手术需要使用手术显微镜（12.5倍）。

1. 准备与麻醉

1. 选用体重约150 g（5–6周龄）的雄性/雌性Lewis大鼠作为受体。
2. 首先用剃刀充分剃除大鼠腹部的毛发。
3. 将大鼠放入异氟烷麻醉舱中，开启氧气流速至2 L/min，并使用2%异氟烷，直至动物充分镇静但仍保持自主呼吸。经腹腔注射（IP）给予45 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪，同时注射300 U/kg肝素。通过脚趾夹捏试验确认麻醉效果。
   注意：在整个过程中需通过触诊胸部密切监测自主呼吸和心率，以确保血流动力学状态稳定。
4. 进行插管时，将大鼠置于倾斜架上（图1），用绳子固定其门齿，使头部朝向术者。
5. 将光源置于颈部外侧声带区域，用两根手指抓住舌头，轻微向上并向左推移，以获得最佳插管视野。对100–150 g大鼠使用18 G、2英寸的套管针。用胶带固定气管内导管。
   注意：建议使用3.5倍放大率的外科手术放大镜进行插管。
6. 将插管套管连接至小型动物呼吸机，并根据动物体型按照制造商说明调整参数。
   注意：对于150 g大鼠，建议使用以下参数：容量控制模式；呼吸频率55次/分钟；潮气量1.3 mL；吸呼比50%；可根据需要适当调整。确保双侧胸廓运动对称且充分，并通过呼吸机持续输送0.5%–2%异氟烷。
7. 将大鼠仰卧位放置于加热垫上（以维持正常体温），尾部朝向术者。交替使用聚维酮碘溶液和70%乙醇对腹部区域消毒三次。涂抹眼用润滑剂，并用无菌手术巾覆盖大鼠身体，仅暴露腹部区域。

2. 新生供体心脏在受体大鼠体内的手术准备与异位移植

1. 使用15号刀片手术刀行正中腹切口，剪开前腹壁，随后用棉签轻轻分离暴露腹膜后腹主动脉和下腔静脉（IVC）。
2. 游离肠道（包括降结肠），将其移至右上腹象限，并用温热的生理盐水浸湿纱布覆盖。使用牵开器以确保充分暴露下腔静脉和腹主动脉。
3. 钝性分离肾下腹主动脉和下腔静脉，直至分叉处。使用10-0尼龙缝线结扎所有肾下分支动脉和静脉（如肠系膜下动脉和淋巴结动脉）。
   注意：这些侧支血管的解剖结构存在较大个体差异。在无其他血流动力学监测手段时，应通过肉眼观察主动脉搏动和心率进行监测。每15分钟通过脚趾夹捏试验评估麻醉深度，并相应调整异氟烷浓度。
4. 从新生大鼠获取供体心脏后，在含有Krebs-Henseleit缓冲液的无菌手术盆中将切除的心脏运送至手术区域。间歇性地用冰冻心脏停搏液冲洗供体心脏。
   注意：若有第二位外科医生协助，应同时准备供体心脏，这可缩短受体动物的总麻醉时间和供体心脏的缺血时间。若无第二位外科医生，则在供体心脏获取过程中，应用温热生理盐水覆盖受体腹部，并持续监测动物状态。
5. 在肾下腹主动脉和下腔静脉的远端及近端分别放置四个小型无创血管夹。如有必要，可用7-0丝线暂时阻断位置不利的肾血管，并在操作完成后松开该缝线。在主动脉前壁垂直放置一根10-0尼龙缝线，以辅助行主动脉切开。使用显微剪刀在缝线轻提状态下做两个小的横向切口（楔形）完成主动脉切开。
   注意：为清除可能存在的血栓，建议用肝素化生理盐水冲洗主动脉管腔。
6. 将供体心脏置于主动脉左侧（从动物视角看），使用缝线在主动脉切口的12点和6点位置将受体肾下腹主动脉与供体升主动脉行端侧吻合。随后在3点和9点位置添加第三和第四根缝线，在完成第三根缝线后轻柔地将心脏翻转至主动脉右侧。通过在每个间隙间添加一至两针完成动脉吻合。
   注意：吻合过程中应避免使用镊子接触供体升主动脉或受体腹主动脉，以防组织损伤。
7. 将大鼠逆时针旋转，使其头部朝向术者左手方向。将供体主动脉移至腹主动脉左侧，以便清晰观察下腔静脉。
8. 在主动脉吻合口稍近端处，使用11号刀片穿刺下腔静脉，再用显微剪刀根据供体肺动脉干直径调整切口大小，完成静脉切开。再次用肝素化生理盐水冲洗下腔静脉管腔。
9. 开始行受体下腔静脉与供体肺动脉干之间的静脉吻合，最佳方法是先在血管后壁（相对于下腔静脉的12点和6点位置）放置间断的11-0尼龙缝线，然后从前壁（从6点向12点方向）行连续11-0尼龙缝合。
10. 用可吸收明胶海绵小条覆盖吻合口，从远端开始依次移除微血管夹。使用棉签轻轻按压海绵以达到最佳止血效果。
11. 在松开远端微血管夹时观察移植物冠状血管是否充盈，并确保松开近端血管夹后供体心脏立即恢复搏动。
    注意：可根据改良的斯坦福评分¹⁹在术中对移植物活力进行0至4分的评分，以确认移植物功能良好。
12. 将肠道复位回腹腔，注意避免扭曲动脉和静脉吻合口。
13. 在动物完全麻醉状态下，皮下注射美洛昔康（1 mg/kg）和ethiqa XR（0.65 mg/kg），以确保术后镇痛。随后使用连续的5-0可吸收Vicryl缝线缝合腹壁，再使用6-0可吸收Vicryl缝线行皮内缝合关闭皮肤。
    ​注意：常见失败原因及处理建议详见表2。

3. 收集新生供体心脏

1. 将新生供体大鼠置于用异氟烷（2%）充气的麻醉 chamber 中以进行镇静。腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）、赛拉嗪（5 mg/kg）以及肝素（300 U/kg）。
2. 通过夹趾反应确认麻醉深度，将大鼠仰卧位放置，尾部朝向操作者。使用聚维酮碘和70%乙醇交替对整个胸壁和腹壁进行三次消毒。用无菌手术巾覆盖大鼠。
3. 在12.5倍手术显微镜下，使用15号刀片从剑突处开始做水平切口，再用剪刀沿两侧向上至腋窝做垂直切口，打开前胸壁；随后在颈部下方再做一条水平切口，即可完整移除前胸壁。
4. 用剪刀游离下腔静脉（IVC）、左右上腔静脉及肺血管，并用7-0丝线环绕并结扎所有血管。用30 G针头穿刺下腔静脉，并用镊子轻压膈肌向下，向右心房注入3 mL冰冻的高钾改良Krebs-Henseleit溶液。
5. 用剪刀切断下腔静脉、上腔静脉、肺血管和主动脉。尽可能远端切断肺动脉，并在头臂干远端切断主动脉，以确保足够的长度，使用11号刀片完成切割。
6. 用显微剪分离肺动脉干和升主动脉，并使用3 mL注射器注入冰冻心脏停搏液冲洗心脏。

4. 受体恢复与移植物监测

1. 术后让大鼠有充足的时间苏醒，通常在15分钟内苏醒，随后将其置于加热垫上恢复。
   注意：由于感染风险极低，且为了避免干扰实验模型，无需使用抗生素，也不限制食物和饮水。
2. 移植后每日通过触诊评估移植物功能，但需注意由于肠道覆盖，有时评估较为困难。
   注意：腹部超声心动图可更准确地测量移植物存活性。进行超声心动图检查时，通过鼻罩吸入异氟烷（1-2%）对大鼠进行轻度镇静，并将其置于加热垫上。超声检查通常在术后第1天（POD 1）、第7天（POD 7）和第14天（POD 14）进行。为评估心率和收缩力，可轻松获取长轴和短轴切面图像（图2A，B）。为评估吻合口情况，使用多普勒超声心动图（图3A），并通过观察左心室腔内出现的回声增强的心内膜层来确认EFE组织的形成（图3B，C）。

结果

移植物存活率与搏动情况
在本研究中，所有夹闭装置移除后，通过肉眼评估移植物的存活情况，并在腹腔开放状态下允许大约 10–15 分钟的再灌注时间以进行观察。采用相同的评分系统，在手术结束时进行肉眼评估，并在术后第 1 天（POD 1）、术后第 7 天（POD 7）和术后第 14 天（POD 14）进行超声心动图检查，以客观验证移植物的存活状态。

0 = 无器官功能；1 = （静息）器官功能，仅有轻微收缩；2 = 器官功能弱或部分存在；3 = 收缩频率或强度降低，但器官功能均匀；4 = 心房和心室收缩最佳（120-160 次/分钟）。评分为 3 或 4 视为成功。通过触诊评估腹部供体移植物，以监测超声心动图评估时间点之间的移植物存活情况。

死亡率与移植物存活成功率
该手术于2022年10月至2022年12月期间在研究机构内引入至一个新的外科团队，期间共进行了19例新生大鼠异位心脏移植手术。即时手术存活率为79%，移植物存活成功率（表现为存活且跳动的...

讨论

将新生供体大鼠心脏异位移植到受体腹部的动物模型，为通过详细的组织学评估研究内皮-间质转化（EndMT）相关的纤维化、鉴定调控信号通路以及测试治疗方案提供了可能。由于内皮-间质转化是心脏纤维化疾病的潜在机制，该模型在小儿心脏外科及相关领域具有重要价值。在此模型中，多种因素可能对操作结果产生不利影响。因此，针对供体心脏因发育不成熟而导致的极为脆弱的组织进行恰当处理、在麻醉过程中规范的动物操作以及高水平的显微外科技术，是确保该模型成功的基本要求。进行此类实验时，应采用理想的手术技术配置，包括手术显微镜、小动物呼吸机和显微外科器械。尽管非必需，但对心率或体温进行基本监测可能有助于监测血流动力学状态和麻醉深度，尤其对经验不足的外科医生而言具有益处。

需要牢记的重要手术要点包括：新生供体心脏尚未成熟，导致组织非常脆弱，升主动脉和肺动脉干容易发生撕裂。因此，任何操作都必须格外小心。由于吻合所用血管较细，建议采用间断缝合法进行动脉吻合，并间歇性地用肝素化生理盐水冲洗吻合部位，以帮助防止血栓形成。需选择合适日龄的新生大鼠，以避免使用过于不成熟、因而极易发生吻合口破裂的心脏。另一方面，在约7天龄之后，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于啮齿类动物的高级呼吸机系统，SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	小型动物呼吸机
aSMA	Sigma	A2547	免疫组织化学用抗体
Axio observer Z1	卡尔·蔡司		倒置显微镜
聚维酮碘 溶液	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	免疫组织化学用抗体
DAPI	Invitrogen	D1306	免疫组织化学用抗体
DemeLON 尼龙黑线 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 尼龙缝合线
ETFE IV 导管，18G × 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	插管导管
微型夹 8mm	Roboz外科器械公司	RS-6471	微血管夹
尼龙黑单丝11-0	外科专科公司	AA0130	11-0 尼龙
O.C.T. 包埋剂	Tissue-Tek	4583	冷冻组织样本包埋介质
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	免疫组织化学用抗体
啮齿类动物，倾斜工作台	Hallowell EMC	000A3467	用于插管的斜置搁板
丝线缝合线，非吸收性，7-0	Braintree Scientific	NC9201231	丝线缝合线
Slug/Snail	Abcam	ab180714	免疫组织化学用抗体
未染色涂层薇乔缝线 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
未染色涂层薇乔缝线 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-钙黏蛋白	Abcam	ab231227	免疫组织化学用抗体
蔡司 OPMI 6-SFR	Zeiss		手术显微镜
Zen，蓝色版，3.6	禅		倒置显微镜软件