利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

摘要

我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，通过基因组分析和功能基因组筛选，鉴定并比较在基因工程小鼠模型中以及相应人类肿瘤类型中发生的肿瘤的治疗靶点。

摘要

恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）起源于施万细胞或其前体细胞。在患有肿瘤易感综合征——1型神经纤维瘤病（NF1）的患者中，MPNSTs是最常见的恶性肿瘤，也是导致死亡的主要原因。这类罕见且具有高度侵袭性的软组织肉瘤预后极差，5年无病生存率仅为34%–60%。目前针对MPNSTs患者的治疗手段非常有限，主要治疗方式仍为致残性手术。许多曾被寄予厚望的疗法在临床试验中均告失败，例如Ras信号通路抑制剂替吡法尼（tipifarnib）。同样，以厄洛替尼（erlotinib，靶向表皮生长因子受体EFGR）和索拉非尼（sorafenib，靶向血管内皮生长因子受体VEGF、血小板源性生长因子受体PDGF及Raf）联合标准化疗方案进行的II期临床试验，也未能在患者中产生有效应答。

近年来，功能基因组筛选方法与肿瘤细胞系的遗传谱型分析相结合，已被证明在识别关键的胞质信号通路以及开发靶向特异性治疗策略方面具有重要价值。对于罕见肿瘤类型，一种被称为跨物种比较肿瘤基因组学的方法正被 increasingly 用于发现新的治疗靶点。在跨物种比较肿瘤基因组学中，首先在基因工程小鼠（GEM）模型中进行遗传谱型分析和功能基因组学研究，然后在可获得的罕见人类样本和细胞系中验证结果。

本文介绍了如何利用全外显子组测序（WES）在人和小鼠恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞中识别候选驱动基因突变。随后，我们描述了如何开展全基因组规模的短发夹RNA（shRNA）筛选，以鉴定并比较小鼠与人MPNST细胞中的关键信号通路，并识别这些通路中可作为药物靶点的分子。这些方法为在多种人类癌症类型中发现新的治疗靶点提供了有效途径。

引言

恶性外周神经鞘瘤（MPNSTs）是一种高度侵袭性的梭形细胞肿瘤，可发生于与肿瘤易感综合征1型神经纤维瘤病（NF1）相关的患者中，也可在普通人群中散发出现，或出现在既往接受过放射治疗的部位。^1,2,3NF1 患者出生时携带一个野生型的拷贝 NF1 肿瘤抑制基因和第二个 NF1 等位基因发生功能缺失突变。这种单倍体不足状态使NF1患者易在其野生型等位基因上发生第二次功能缺失突变 NF1 基因，可触发肿瘤发生。当该 "二次打击" NF1 当施万细胞谱系中的细胞发生突变时，会形成两种肿瘤：一种是起源于皮肤的皮肤型神经纤维瘤，另一种是发生在大神经或神经丛的丛状神经纤维瘤。尽管皮肤型神经纤维瘤与丛状神经纤维瘤的病理特征相同，但它们的生物学行为却显著不同——虽然两者均为良性肿瘤，但只有丛状神经纤维瘤可能发生恶性转化并发展为恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）。除了神经纤维瘤蛋白的缺失外，还包括由Ras GTPase激活蛋白编码的基因的失活 NF1 基因，MPNSTs 携带多个其他肿瘤抑制基因的突变，包括 TP53^4,5,

方案

在开展研究之前，动物实验操作及病毒载体处理方案须提交机构动物照护与使用委员会（IACUC）和机构生物安全委员会（IBC）审查并获得批准。本文所述操作已获南卡罗来纳医科大学（Medical University of South Carolina）IACUC和IBC的批准，并由经过适当培训的人员依照《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》及南卡罗来纳医科大学的机构动物照护指南执行。

1. WES-Seq 分析与致病性变异的鉴定

1. 从肿瘤样本或在60 mm培养皿上生长至70%融合度的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞中提取基因组DNA，采用标准的市售基于硅胶吸附法（参照试剂盒生产商提供的操作说明进行具体步骤）。常规操作流程如图所示 图1.
2. 除非另有说明，向测序核心实验室提交的基因组DNA样本应不少于10 µL，浓度为50 ng/µL。
   1. 核心设施通过超声处理将基因组DNA打断，随后采用首选方法进行纯化。使用选定的外显子组测序试剂盒进行外显子捕获和文库构建，并在外显子扩增产物上添加索引标签。
   2. 将样本提交至测序中心进行全外显子组双端测序（WES；每端测序100 bp）。
   3. 核心实验室生成的FASTQ文件将提供给研究人员。仅使用通过质量评估指标的FASTQ文件进行分析。
   <....

结果

图5 图中展示了在每种经过筛选的人类细胞系中，被标记为 TRUE 的核心必需基因（CEGs）与被标记为 FALSE 的非核心必需基因（非-CEGs）的耗竭评分。数据点表示各个基因的耗竭评分倍数变化的 log2 值，叠加在整体评分分布的箱线图上。Student's t-采用t检验分析每种细胞系中两组间耗竭评分均值的显著性差异。所得结果 p每个图中均标示了数值。请注意，核心必需基因（CEGs）的平均耗竭倍数得分显著高于非核心必需基因（非-CEGs）。这是符合预期的，因为根据定义，核心必需基因在大多数细胞类型中始终是增殖和/或存活所必需的。

图6A展示了三种人源MPNST细胞系中筛选出的“命中基因”的维恩图。我们通常发现多个细胞系之间存在大量共有的基因；这些共有的命中基因为高优先级，因为它们编码的蛋白质可能对大多数MPNST细胞的增殖和/或存活至关重要。还需注意的是，也存在仅在一个细胞系中被命中的基因。这种情况较为常见，不应将其视为筛.......

讨论

本文介绍的详细方法旨在研究周围神经系统肿瘤及恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的发病机制。尽管我们发现这些方法行之有效，但仍需认识到本文所述方法存在一些潜在的局限性。下文将讨论这些局限性以及在其他模型系统中可能采用的克服策略。

我们发现，全外显子组测序能有效鉴定 P₀-GGFβ3 小鼠中感兴趣的突变。然而，应当认识到全外显子组测序本身存在局限性。首先，全外显子组测序在鉴定融合基因产物方面效果不佳。这是因为大多数染色体断裂及随后的融合主要涉及基因间区域和内含子，而这些区域占基因组的大部分。我们发现，采用双端测序的 RNA-Seq 能更有效地鉴定融合基因。此外，全外显子组测序在识别相对较大的染色体缺失区域方面的有效性也存在疑问。

尽管已有多种算法被开发用于识别此类缺失，但“全外显子组测序”这一术语本身具有误导性，因为在测序效果良好的运行中，外显子组的捕获仍常常会遗漏多达5-10%的外显子区域。因此，我们常规地将全外显子组测序与其他方法（如阵列比较基因组杂交（aCGH））相结合。在识别出拷贝数增加和缺失后，我们检查.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物破碎仪超声系统	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo 图像细胞仪	Nexcelom	N/A
Cellecta 条形码分析与解卷积软件
Citrisolve 混合清洗剂	Decon Laboratories	5989-27-5
康宁 96 孔黑色微孔板	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15 ml 锥形管	Diagenode	C30010009
dNTP 混合液	Clontech	639210
伊红 Y	Thermo Scientific	7111
洗脱缓冲液	Qiagen	19086
乙醇（200 证明）	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC 纯化
GraphPad Prism	Dotmatics
哈里斯苏木精	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
多聚甲醛（4%）	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS 转染试剂	Thermo Scientific	11514015
Polybrene 转染试剂	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink 快速 PCR 纯化试剂盒	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq 聚合酶	Clontech	639210
Trimmomatic 软件		www.usadellab.org